CN102321665A - 一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，是利用基因工程手段将humanin蛋白编码基因连接到油体蛋白基因的3’端，构建由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-人humanin蛋白”植物表达载体，转化花生，重组蛋白伴随着油体的积累在花生种子中高水平的表达，然后离心分离出融合蛋白，将融合蛋白用外切蛋白酶消化后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。本发明方法获得的重组蛋白安全、活性高、非常容易回收和纯化，而且可以在花生种子中长期的储存、运输方便，大大提升了作物的附加值。

Description

一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种表达人humanin蛋白的方法，尤其涉及一种利用油体蛋白***在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，属于生物技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已经成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。二十一世纪初，日本学者首先分离出一种称为Humanin(HN)的短肽，由24个氨基酸组成。它能有效抑制AD相关基因：淀粉样蛋白前体(amyloid precursor，APP)基因、早老素1(preseniln1，PS1)基因、早老素2(preseniln2，PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloid peptide，Aβ)引起的神经细胞死亡^[1-3]。HN的一级结构具有信号肽结构特点，可被分泌至细胞外，细胞外的HN通过与细胞表面受体结合，继而激活细胞内信号传导通路而发挥其细胞保护作用。此外，有关动物实验表明，脑内注射HN可以改善东莨菪碱引起的动物学习记忆障碍。且Humanin的一种衍生物——Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍^[4]。近年来的研究表明，HNG还具有预防和治疗中风^[5]、增强胰岛素活性从而治疗II型糖尿病^[6]的作用。Humanin蛋白作用广泛，临床应用前景广阔，市场需求巨大，因此大规模生产人humanin蛋白意义重大。

利用植物生物反应器是生产药用蛋白的有效方式。已有多种植物用作生物反应器，如烟草、大豆、拟南芥、玉米、油菜、马铃薯块茎、番茄果实、水稻种子等，其表达产物也有多种，如疫苗、抗体等。植物生物反应器成本较低，易于扩大规模，不存在动物细胞培养或微生物发酵中遇到的细胞培养困难、培养基昂贵、污染控制困难等问题。与动物转基因技术相比，植物转基因技术更加成熟。与动物和微生物***相比，植物本身不携带引起人类疾病的病菌或病毒，避免了病原菌对生物反应器产品的污染。与微生物相比，利用植物生产的产品一般具有较高的生物活性。此外，油料作物种子中的油体蛋白能够高水平表达，可达到种子总蛋白的10％。如果将外源蛋白与油体蛋白融合表达，在提高外源蛋白表达水平的同时，还能简化蛋白的分离程序，有效降低生产成本。

研究表明油体蛋白(oleosin)具有亲水和亲脂双重特性，在植物种子中以膜嵌入方式覆盖在油体表面。油体蛋白分子除中部疏水区域高度保守外，N端和C端的序列差异都很大。油体的性质决定了它是一种易于人工改造的细胞器，小分子量蛋白***到油体蛋白的N端或C端后，不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位和表达，形成的重组融合蛋白非常稳定，通过漂浮离心很容易将它与其他细胞成分分开，易于大规模的蛋白分离纯化。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油体蛋白合成了人工油体(AOB)，只有天然油体的1/10，通过一系列生理实验证明AOB保留了天然油体的特性而且非常稳定^[7]。Peng等利用人工油体优化了油体-油体蛋白表达体系，在大肠杆菌中构建了“油体蛋白-Xa-GFP”表达载体，通过离心，oleosin-GFP全部富集到人工油体的表面，通过蛋白酶Xa将GFP从嵌入油体的油体蛋白中分离，再一次离心，收集上清液得到高浓度的GFP^[8]。Xu等利用大豆24kDa油体蛋白***，构建了“油体蛋白-肠肽酶-水蛭素”植物表达载体，在转基因烟草中成功表达了重组蛋白，通过肠肽酶切割，分离得到了水蛭素^[9]。SemBioSys公司利用油体-油体蛋白这一***在拟南芥中表达人胰岛素，植物性胰岛素累积到种子总蛋白含量的0.13％^[10]，经后续试验优化后，种子中积累的胰岛素占种子蛋白总量的1.15％，达到商业应用水平。该公司还利用油体蛋白表达***在红花中表达人胰岛素，每英亩红花所产的红花籽中能提取到1公斤的人胰岛素，能够有效填补市场需求，利用油菜油体蛋白***生产水蛭素产品也已经进入商业化阶段。

花生是重要的油料作物，是我国单产、总产和出口创汇最高的油料作物，占我国油料作物总产的50％，占世界花生总产的30％以上，花生已经在榨油、食品加工和化工等领域发挥着不可替代的作用。花生种子的含油量高达45-55％，蛋白含量达到25-30％，可以生食，也可作为食品加工的原材料，其蛋白质极易备人体吸收，吸收率在90％以上，所以花生是生物反应器的优良载体。人humanin蛋白具有广阔的临床应用前景，经检索，目前还没有关于在花生种子中利用油体蛋白表达***表达人humanin蛋白的方法的报道。

参考文献：

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发明内容

针对现有技术的状况，本发明要解决的问题是提供一种利用油体蛋白***在花生种子中表达人humanin蛋白的方法。

本发明所述在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，步骤包括(1)克隆花生油体蛋白基因Aholeosin及其启动子；(2)合成人humanin蛋白编码基因；(3)构建pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS植物表达载体；(4)花生的转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白；其特征是：

所述克隆花生油体蛋白Aholeosin及其启动子的方法是：提取花生基因组DNA，以其为模板，以带有EcoRI酶切位点GAATTC的正向引物：AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和带有KpnI酶切位点GGTACC的反向引物：GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LA TAQ酶进行PCR反应，PCR反应的程序为：94℃5min；再94℃45sec，54℃45sec，72℃2min，35循环；72℃7min；16℃保存PCR产物；将PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带Aholeosin及其启动子的克隆载体；

所述合成人humanin蛋白编码基因的方法是：设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和点肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)：GAAGGTACCG ATGATGATGA TAAGATGGCT CCACGAGGGT TCAGCTGTCTCTTACTTTTA ACCAGTGAAA TTGACCTGCC；反向引物包含His tag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位点(GTCGAC)：ACGCGTCGAC TTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GTGCCCGCCT CTTCACGGGC AGGTCAATTT CACTGGTTAAAAGTAAGAGA，利用TAQ酶进行退火和延伸，程序为：94℃3min；40℃1min；72℃2min；16℃保存产物；将产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆载体；

所述植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin：humanin-OCS构建方法是：将按照上述克隆方法获得的Aholeosin及其启动子通过EcoRI和KpnI酶切位点连接到pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin-OCS载体，再将按照上述克隆方法获得的humanin蛋白编码基因通过KpnI和SalI酶切位点连接到pCAMBIA2300-Aholeosin-OCS载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS植物表达载体；

所述花生的转化方法是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS通过农杆菌介导的方法侵染花生；

所述转基因花生种子的获得的方法是：收获第二代转基因花生纯合体的花生种子；

所述Western Blot检测转基因花生种子中人humanin蛋白表达的方法是：用人humanin抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗进行的免疫印迹杂交检测；

所述从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，抽提液体，离心回收上层油相，得到含融合蛋白的液体；将融合蛋白经酶切后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。

上述在花生中表达人huamnin蛋白的方法中：所述植物表达载体中花生的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白编码基因的连接顺序为“花生油体蛋白启动子+花生油体蛋白基因+肠肽酶识别位点+人humanin蛋白基因+终止子”。

人humanin蛋白具有广阔的临床应用前景，利用原核***重组蛋白往往没有活性或者活性很低，利用动物细胞作为生物反应器表达外源蛋白表达量低、成本高，植物生物反应器具有生产药用蛋白的优势。本发明提供的利用油体蛋白***在花生种子中表达人humanin蛋白的方法实现了人humanin蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白共同表达和高水平积累。

本发明以花生作为受体植物，花生的种子作为表达蛋白的载体，采用花生油体蛋白基因和启动子的克隆，表达载体的构建，花生的遗传转化，人humanin蛋白基因的表达确认，重组蛋白的分离纯化和回收的方法，成功实现了利用花生种子作为生物反应器在转基因花生中高效、安全地表达人humanin蛋白，进而纯化回收蛋白。

综上，本发明方法具有以下优点：

(1)花生含油量高，油体蛋白丰富，占种子总蛋白的10％以上，人humanin蛋白以融合的方式与花生油体蛋白共同表达，并高水平积累。

(2)在花生中表达重组的humanin蛋白稳定性好，能够在花生种子中长期储存并保持活力，且运输方便。

(3)花生栽培面积广，适应性强，利用油体蛋白的纯化体系、容易回收和纯化，具有易操作、成本低的优点，同时增加了农产品的附加值，为生物制药和分子农业新兴产业的发展提供技术支持。

附图说明

图1本发明所述植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS构建示意图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1包含启动子的花生油体蛋白基因的克隆

根据Genbank中花生油体蛋白的启动子和编码基因的序列(基因登录号：EF695400)，设计含有EcoRI酶切位点(GAATTC)的正向引物primer1：AGAAT TCAGG TCAAC TACCATTCGT；根据花生油体蛋白基因的开放阅读框序列，去掉中止密码子，设计带有KpnI酶切位点(GGTACC)的反向引物primer2：GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG。

提取花生(鲁花14)的基因组DNA，方法如下：

(1)取1g的花生幼嫩叶片，用液氮研磨成粉，置于液氮预冷的Eppendof管中；

(2)在65℃水浴中预热CTAB提取液(2％CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmo/L EDTA(pH8.0)，100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，2％pvp-40)；

(3)估算样品组织的质量，每200mg样品中加700μL预热的CTAB提取液，迅速混匀，在65℃温浴10-30min，期间混匀2-5次；

(4)加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇(12∶12∶1)，混匀；

(5)12000rpm室温离心10min；

(6)将上清转移至一新的离心管中；

(7)用氯仿/异戊醇(24∶1)重复4-6步；

(8)加0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；

(9)12000rpm室温离心15min；

(10)倒掉上清，用500μl-20℃预冷的70％乙醇洗沉淀2-3次；

(11)沉淀干燥后，用50μl去离子水或TE溶解DNA，置于-20℃备用。

(12)吸取5μl溶解的DNA，加入45μl去离子水，混匀待用。

花生油体蛋白启动子和基因的PCR扩增：

以上述primer1，primer2为引物，花生基因组DNA为模板，PCR扩增得到花生油体蛋白的启动子和全长基因。反应程序如下：模板DNA 1μl，2×LATaq mix 10μl，primer1(10μM)0.5μl，primer2(10μM)0.5μl，ddH₂O 8.0μl。在PCR仪(TaKaRa TP650)上设置94℃5min，随后94℃45sec，54℃45sec，72℃2min，共35个循环后72℃7min结束反应。

花生油体蛋白启动子和基因序列的获得：

取PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，胶回收2100bp左右的目的条带，连接T载体(pMD18-T，TaKaRa，Dalian)，连接体系10μl：回收产物4μl，pMD18-T载体1μl，Solution I 5μl，16℃下进行连接反应4h以上，连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞。

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：用无菌接种环挑取-70℃甘油保存的E.coli DH5α，通过划线稀释的方法经37℃培养16-20h，在平板上得到DH5α的单菌落；挑一单菌落于3ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养12h；取1ml DH5αLB菌液于100ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养到OD值0.4；冰上放置15min，无菌条件下转入50ml Beckman离心管中，4℃，4500rpm离心10min，弃上清；沉淀用30ml冰预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬；4℃，4500rpm离心10min，小心倒出上清液；沉淀重悬于2ml冰预冷的含15％甘油0.1M CaCl₂溶液；将这些感受态细胞按每份70μl分装，-80℃保存。

大肠杆菌的转化：将上述10μl的连接液加入70μl DH5α感受态细胞中混匀，冰上放置30min，42℃热激90sec，冰浴5min，加入150μl液体LB(NaCl 10g/L，Tryptone 10g/L，Yeastpowder 5g/L)，37℃120rpm振荡培养1h，将菌液均匀涂抹布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基上(NaCl 10g/L，Tryptone 10g/L，Yeast powder 5g/L，Agar powder 15g/L)，37℃培养过夜。挑取单菌落到4mL液体LB中，37℃摇菌8-10h，提取质粒DNA(Omega)，分别用(EcoRI、KpnI)双酶切验证，对阳性克隆用M13通用引物进行测序验证(见序列表SEQ ID No.1)，得到克隆载体T-AhOleosin质粒。

实施例2人Humanin基因的合成

根据Genbank中humanin基因(NP_001177635)序列，设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI(GGTACC)位点和肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)primer3：GAAGGTACCG ATGATGATGA TAAGATGGCT CCACGAGGGT TCAGCTGTCTCTTACTTTTA ACCAGTGAAA TTGACCTGCC；反向引物包含His tag序列(CACCACCACCAC CACCAC)和SalI酶切位点(GTCGAC)primer4：ACGCGTCGAC TTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GTGCCCGCCT CTTCACGGGC AGGTCAATTT CACTGGTTAAAAGTAAGAGA。

利用TAQ酶进行退火和延伸，primer3(100μM)1μl，primer4(100μM)1μl，程序为：94℃3min；40℃1min；72℃2min；16℃保存产物；产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，胶回收目的条带，将回收产物与T载体连接，按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5α细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆(见序列表SEQ ID No.2)，得到克隆载体T-humanin质粒。

实施例3植物表达载体的构建

植物表达载体的构建过程如图1所示：

(1)将花生油体蛋白启动子和ORF连接到pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体，此植物表达载体骨架来源于Cambia公司，由中国科学院遗传与发育生物学研究所改造(Luo et al.Journal of integrative plant biology，2005，47(6)，745-752)：将pCAMBIA2300-35S-OCS质粒和T-AhOleosin质粒分别用EcoRI和KpnI双酶切，回收载体序列和AhOleosin序列，用T4DNA连接酶将两者进行连接：10×T4D NA ligase buffer 1μl，AhOleosin 6μl，pCAMBIA2300 2μl，T4DNA ligase 1μl，16℃连接过夜，连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5α，用EcoRI和KpnI双酶切验证正确克隆，得到pCAMBIA2300-AhOleosin-OCS表达载体。

将人humanin蛋白基因连接到pCAMBIA2300-AhOleosin-OCS表达载体：将pCAMBIA2300-AhOleosin-OCS质粒和T-humanin质粒分别用KpnI和SalI双酶切，回收载体序列和humanin序列，用T4DNA连接酶将两者进行连接：10×T4DNA ligase buffer 1μl，humanin 6μl，pCAMBIA2300-AhOleosin-OCS 2μl，T4DNA ligase 1μl，16℃连接过夜，连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5α，用KpnI和SalI双酶切验证正确克隆，得到pCAMBIA2300-AhOleosin-humanin-OCS表达载体。

(2)表达载体的农杆菌转化

制备农杆菌EHA105的感受态细胞：挑取农杆菌EHA105单菌落到3ml LB培养基(含利福平25μg/ml)28℃摇菌过夜；然后取1ml接种到50ml液体LB培养基中(含利福平50μg/ml)，28℃扩大培养，200rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.5；冰浴10min，4℃4500rpm，离心10min；菌体用50ml预冷的0.1M CaCl₂重悬，4℃4500rpm再次离心10min；收集的菌体加入2ml 20mM CaCl₂悬浮液(含15％的甘油)，80μl/管分装，液氮速冻后-80℃保存。

重组质粒转化农杆菌：取pCAMBIA2300-AhOleosin-humanin-OCS质粒5μl加入80μlEHA105农杆菌感受态细胞，冰上放置30min；液氮中速冻90sec；37℃水浴快速解冻，3min；加入800μl LB培养基，28℃，150rpm震荡培养3h；瞬间离心，去上清，将菌体带200μl LB涂布在加有25μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的LB平板上，28℃培养2-3d。取1μl菌液做模板进行PCR验证，分别以3对引物：(primer1，primer2)、(primer3、primer4)、(primer1，primer4)进行PCR验证，经PCR验证正确的克隆摇菌，-80℃保存菌株。

实施例4花生的遗传转化和转基因花生种子的获得

(1)花生胚轴的遗传转化

外质体的制备：成熟花生种子去外壳，用70％乙醇浸种1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞(w/v)处理15-25min，然后用无菌水冲洗4-6遍，灭菌期间不断摇动种子，以保证种子表面灭菌彻底。剥去种皮，将胚接种于萌发培养基(蔗糖30g/L，琼脂0.7％，MS大量元素，MS微量元素)上，胚轴深入培养基中，培养4d左右取胚轴作为外植体。培养温度25±1℃，光照强度3500lux。

花生胚轴外植体的侵染：新鲜培养的含植物表达载体的农杆菌EHA105，5000g/min离心收集菌体，重悬于液体诱导培养基中，农杆菌感染的最佳浓度为OD₆₀₀＝0.5-0.8。手术刀切取萌动4d的花生胚轴，在农杆菌悬浮液中浸泡25-30min，取出外植体在滤纸上吸去多余的菌液，然后接种到诱导分化培养基(MS+蔗糖30g/l，琼脂0.7％，6-BA 10mg/l，NAA 0.8mg/l)上，暗处共培养2d。

选择培养基及转化植株再生：共培养后，将外植体接到含有500mg/L羧苄青霉素的诱导分化培养基上恢复培养7d，再接到含有10mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的诱导分化培养基上进行筛选，培养7d后转接到含有25mg/L潮霉素的诱导分化培养基上进一步筛选，大约3-4周后出现丛生芽点，以后每2周更换一次新鲜培养基。待丛生芽长到1-2cm时将其切下，移至分化伸长培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，GA₃4mg/l，6-BA2mg/l)上，潮霉素浓度降至10mg/l，当小苗长至3-5cm时，将其移至生根培养基(1/2MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，NAA2.0mg/l)中，炼苗、转基因植株的移栽。

(2)转基因花生种子的获得

收获花生种子，种植并收获第二代种子，提取DNA进行PCR检测和Southern杂交，验证转基因植株，获得转基因花生种子。

实施例5Western Blot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达

从转基因花生种子中提取重组蛋白：

(1)取0.5g干种子于8ml提取缓冲液(蔗糖0.6M，KCl 10mM，MgCl₂1mM，Tris-Cl 0.15M pH 7.5)中，匀浆。

(2)12000rpm离心20min，取油相。

(3)加入提取缓冲液重悬混匀，12000rpm离心20min，收集油相。

(4)加入5ml漂浮缓冲液(蔗糖0.4M，KCl 10mM，MgCl₂1mM，Tris-Cl 0.15M pH 7.5)重悬，12000rpm离心20min，收集油相。

(5)加入NaHCO₃冰浴30min，12000rpm离心20min，收集油相。

(6)用过量丙酮在0℃抽提3次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于适量无菌水中。Western Blot杂交：

(1)将提取的重组蛋白50μg通过12％的SDS-PAGE胶电泳分离。

(2)电泳结束后将胶切割成合适的大小，用转膜液平衡3次，每次5分钟。

(3)将硝酸纤维素膜用蒸馏水润洗，用电转方法将胶上的蛋白质转到膜上。

(4)转后将膜放入染色液中50s，在50％的甲醇中脱色至背景清晰，然后用双蒸水清洗。

(5)用0.01M PBS(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g加H₂O定容至1000ml)洗膜3次，每次15min，然后用3％明胶浸泡洗3h，封闭非特异位点的。

(6)将膜取出，用0.01M PBS洗2次，每次10min。

(7)加入用PBS稀释1000倍的一抗(Monoclonal anti-human BMP7 antibody)，室温结合2h，阴性对照用1％的BSA。

(8)弃一抗和BSA，用0.01M的PBS洗膜4次，每次5min。

(9)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(用PBS稀释2000倍)，室温轻摇2h。

(10)弃二抗，用PBS洗膜4次，每次5min。

(11)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

实施例6从转基因花生种子中大规模分离并回收人humanin蛋白

人humanin蛋白分离并回收，将转基因花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀(种子纤维等)，回收上层的油相，清洗后、离心再取上层的油相；加入肠肽酶进行酶消化反应，离心去掉上层的油相，回收水相经纯化得到人humanin蛋白。

Claims (2)

1.一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，步骤包括(1)克隆花生油体蛋白基因Aholeosin及其启动子；(2)合成人humanin蛋白编码基因；(3)构建pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS植物表达载体；(4)花生的转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白；其特征是：

所述克隆花生油体蛋白Aholeosin及其启动子的方法是：提取花生基因组DNA，以其为模板，以带有EcoRI酶切位点GAATTC的正向引物：AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和带有KpnI酶切位点GGTACC的反向引物：GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LA TAQ酶进行PCR反应，PCR反应的程序为：94℃5min；再94℃45sec，54℃45sec，72℃2min，35循环；72℃7min；16℃保存PCR产物；将PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带Aholeosin及其启动子的克隆载体；

所述合成人humanin蛋白编码基因的方法是：设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和点肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)：GAAGGTACCG ATGATGATGA TAAGATGGCT CCACGAGGGT TCAGCTGTCTCTTACTTTTA ACCAGTGAAA TTGACCTGCC；反向引物包含His tag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位点(GTCGAC)：ACGCGTCGAC TTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GTGCCCGCCT CTTCACGGGC AGGTCAATTT CACTGGTTAAAAGTAAGAGA，利用TAQ酶进行退火和延伸，程序为：94℃3min；40℃1min；72℃2min；16℃保存产物；将产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆载体；

所述植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin：humanin-OCS构建方法是：将按照上述克隆方法获得的Aholeosin及其启动子通过EcoRI和KpnI酶切位点连接到pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin-OCS载体，再将按照上述克隆方法获得的humanin蛋白编码基因通过KpnI和SalI酶切位点连接到pCAMBIA2300-Aholeosin-OCS载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS植物表达载体；

所述花生的转化方法是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS通过农杆菌介导的方法侵染花生；

所述转基因花生种子的获得的方法是：收获第二代转基因花生纯合体的花生种子；

所述Western Blot检测转基因花生种子中人humanin蛋白表达的方法是：用人humanin抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗进行的免疫印迹杂交检测；

所述从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，抽提液体，离心回收上层油相，得到含融合蛋白的液体；将融合蛋白经酶切后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。

2.根据权利要求1所述的在花生中表达人huamnin蛋白的方法，其特征是：所述植物表达载体中花生的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白编码基因的连接顺序为“花生油体蛋白启动子+花生油体蛋白基因+肠肽酶识别位点+人humanin蛋白基因+终止子”。

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