CN101875940B - 一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌nsm18及其专用基因簇 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇。该基因簇如序列表中序列1所示。将该基因簇转移至苜蓿中华根瘤菌中构建成一株工程菌株NSM18。耐盐性实验表明，该工程菌株能耐受高达1.4mol/L NaCl、1.5mol/L KCl以及0.6mol/L LiCl的盐浓度条件，而且，工程菌能在42℃下生长，而对照则不能生长，表现出抗高温能力。并且本发明的工程菌株NSM18在拥有上述的优点基础上仍保持其优良的结瘤固氮能力。

Description

一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇。

背景技术

干旱和土壤盐渍化是农业所面临的一个主要问题，特别在干旱或半干旱气候条件下尤为突出。据估计，全世界大约有40％的可耕地都存在盐过量的现象，受盐渍化影响的集约农业的农田面积可达到4.0～9.5亿公顷。更为严重的是，因受厄尔尼诺气候的影响，全球气温升高，海平面上升，加之工业污染和农业灌溉、施肥不当等人为因素的影响，次生盐碱化土壤的面积还在以每年3％的速度扩展。利用生物工程技术提高农作物、农用微生物的抗逆性是改良利用盐渍化土壤经济有效的方法之一，而与耐盐有关基因的资源是实施生物工程改良利用盐渍化土壤的物质基础。目前，我国一方面由于缺乏与耐盐有关的基因的开发和利用，特别是缺乏有效的耐高盐基因，另一方面因受知识产权等因素的影响，某些国外与耐盐相关基因的转化利用受到限制，这些严重制约了我国生物工程改良利用盐渍化土壤的进程。因此，挖掘耐盐生物种质资源的潜力，拓宽遗传基础，对存在于中度嗜盐菌中的与耐盐有关基因或调节因子进行克隆分离，并以基因工程的手段转移到其它微生物中，对于打破物种限制，实现种间、种外外源基因的转移或累加，对构建耐盐的工业生产用菌、开发利用盐碱地和增加粮食产量等方面具有广阔的应用前景。

根瘤菌是一类重要的土壤微生物，可与相应的豆科的植物共生固氮。发展和开发其共生固氮***是解决农业可持续发展的一个办法。共生固氮***能合成最廉价的蛋白质，对人类与动植物的营养具有相当重要的作用。然而，盐胁迫导致生物固氮的迅速下降，以致造成蛋白质产量的显著降低。同时，独立生活的根瘤菌在土壤中也受到相同的盐胁迫的影响，繁殖能力大大地降低，而且其在植物根部的定殖也大受影响，造成结瘤能力的下降。因此，从具有高度耐盐能力的中度嗜盐菌中克隆与耐盐有关基因，并转化根瘤菌，构建耐盐高效的共生***必将有益于农业的持续性发展。

本发明人以往尝试过其它与耐盐相关基因，比如甘氨酸甜菜碱合成和转运基因。虽然该基因可以不同程度地增强转基因微生物对多种逆境胁迫的抗性，但是受制于其关键前体物(胆碱)的供给，这些基因所获得的转基因产品通常积累的甘氨酸甜菜碱的量很低(约0.05-5μmol·g^-1FD)，限制了其在耐盐基因工程中的应用。相比较而言，本发明中所使用的四氢嘧啶基因是从头合成基因，不需要特殊底物的存在，也不需要特殊的转运***，对底物要求不高，而且，已有在植物中表达四氢嘧啶合成基因能提高高渗冲击的耐受能力的报道。但是，在微生物不同种属间的转移和表达还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一个基因簇(命名为ectABC)，是从一株能在4mol/LNaCl条件下生长的革兰氏阳性放线菌喜盐涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia halobia)DSM 20541中克隆出的四氢嘧啶合成基因。

本发明提供的基因簇，为如下1)-4)中任一种：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1809-5236位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子。

序列表中序列1有5496个碱基，其中自5’端第2047-2575位为ectA的编码区，自5’端第2746-4030位为ectB的编码区，自5’端第4238-4625位为ectC的编码区。

所述的严格条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

含有上述基因簇的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

使用上述基因簇构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

上述重组载体是将上述的基因簇***pLAFR3的多克隆位点构成的重组表达载体。

含有上述基因簇的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。

上述重组菌是将上述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。

上述根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌；该苜蓿中华根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌1021。

本发明的另一目的在于提供一种培育耐逆的转基因重组菌的方法。

本发明提供的培育耐逆的转基因重组菌的方法，是将上述基因簇导入目的菌中构成的重组菌。

上述的基因簇是将上述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。

上述根瘤菌可以是苜蓿中华根瘤菌；上述苜蓿中华根瘤菌可以是苜蓿中华根瘤菌1021。

上述的重组菌具体可以是苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)NSM18，已于2009年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3383。

上述耐逆是耐盐和/或耐高温。

扩增上述基因簇的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。

上述的基因簇、上述的重组载体、或上述的重组菌在合成四氢嘧啶中的应用也属于本发明的保护范围之内。

本发明的优点在于，打破物种界限，将来自中度嗜盐菌中的四氢嘧啶合成基因转移至根瘤菌中，这是一个大胆的尝试。

实验证明：本发明提供的基因簇不但可以提高大肠杆菌的耐盐能力，而且通过HPLC-UV分析，检测到四氢嘧啶的合成。

在上述工作的基础上，本发明获得一株耐盐的根瘤菌工程菌株NSM18。耐盐性实验表明，该工程菌株能耐受高达1.4mol/L NaCl、1.5mol/L KCl以及0.6mol/L LiCl的盐浓度条件，而且，工程菌能在42℃下生长，而对照则不能生长，表现出抗高温能力。

并且，本发明的工程菌株NSM18在拥有上述的优点基础上仍保持其优良的结瘤固氮能力。

由此可见，本专利中的工程菌株NSM18不但高度耐盐、耐高温，并且能高效固氮，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为ectABC基因的克隆策略图。

图2为重组质粒pGEM-Nect的构建示意图。

图3为ectABC对大肠杆菌XL1-Blue的渗透保护作用。

图4为大肠杆菌KNabc/pGEM-Nect和KNabc/pGEM-3f(+)在不同NaCl浓度下的生长。

图5为HPLC-UV检测四氢嘧啶在大肠杆菌KNabc/pGEM-Nect中的积累，A是四氢嘧啶标样的色谱峰，B是大肠杆菌KNabc/pGEM-Nect相容性溶质提取物的色谱峰，C是大肠杆菌KNabc/pGEM-3zf(+)相容性溶质提取物的色谱峰。

图6为重组质粒pLAFR-NECT的构建示意图。

图7为苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同NaCl浓度下的生长。

图8为苜蓿中华根瘤菌NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同KCl浓度下的生长。

图9为苜蓿中华根瘤菌NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同LiCl浓度下的生长。

图10为苜蓿中华根瘤菌NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同温度下的生长，A是28℃，B是37℃，C是42℃。

图11为HPLC检测四氢嘧啶在苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18中的积累，A是四氢嘧啶标样的色谱图，B是NSM18相容性溶质提取物的色谱图，C是对照相容性溶质提取物的色谱图。

图12为苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18的结瘤实验，A是结瘤实验第40天的整株照片，B是结瘤实验第40天植株根部结瘤的照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明所使用的常规分子生物学实验操作，如DNA酶切、连接、转化和质粒提取等，均参考“分子克隆指南”。

本发明所使用的培养基为：

MM63培养基(1L)：(NH4)₂SO₄15mmol/L，KH₂PO₄22mmol/L，K₂HPO₄40mmol/L，葡萄糖40mmol/L，MgSO₄1mmol/L，FeCl₂25μmol/L，定容至1L，pH6.8-7.2。

LBK液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KCl 6.48g，自然pH。

液体TY培养基(1L)：胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl₂0.6g，定容至1L，pH 7.0；固体TY培养基：胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl20.6g，琼脂粉15g，定容至1L，pH 7.0。

LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，定容至1L，pH 7.0。

YMA培养基(1L)：甘露醇10g，酵母粉3g，MgSO₄0.2g，NaCl 0.1g，K₂HPO₄0.25g，KH₂PO₄0.25g，定容至1L，pH7.0；固体培养基加15g琼脂粉后定容至1L。

结瘤实验的无氮培养液(1L)：CaSO₄0.46g，KCl 0.075g，K₂HPO₄0.136g，MgSO₄0.06g，柠檬酸铁0.075g，微量元素1ml，定容至1L；其中微量元素(1升)：H₃BO₃2.86g，ZnSO₄0.22g，CuSO₄0.8g，H₂MoO₄0.02g，MnSO₄1.81g，蒸馏水1000ml。

本发明所用的遗传资源如下：

喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 20541，于2000年3月购自德国微生物菌种保藏中心，因为喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 2054购自德国微生物菌种保藏中心，所以其原始来源不清楚。

苜蓿中华根瘤菌1021，中国农业大学实验室保藏，无法说明其原始来源。

实施例1、四氢嘧啶合成基因的全序列的获得

一、ectB基因的部分片段

在本发明中，四氢嘧啶合成基因是从喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 20541(购自德国微生物菌种保藏中心)中分离的。基因分离是通过简并引物扩增，获得部分保守片段，引物序列如下表所示：

ectB-up    5’-GCNGGNGCNYTNAAYTAYGGNCAYAA-3’

ectB-dn    5’-ARNCCNCCYTCNCCYTGNACNGTYTC-3’

PCR的扩增条件为：

反应条件

94℃5 min

94℃30s，56℃30s，72℃，30s      30轮循环

72℃10min

PCR扩增获得大小为497 bp左右的DNA片段，将扩增产物电泳回收纯化，然后连接到pGEM-T easy载体上。用碱解法提取质粒，用于序列测定，测序反应由上海生工生物技术有限公司完成。在GenBank中进行BLAST比较，表明已经获得了喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541 ectB基因的部分片段。

二、ectBC及其下游序列

为了进一步获得ectABC基因簇全序列，将喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541的基因组DNA用BamHI完全酶切后自连。根据已知的497 bp部分ectB片段，设计一对反向引物NIP1和NIP2，引物序列如下：

NIP1-116    5’-gccgcgaacctgcctcagaa-3’

NIP2-284    5’-tgacgctgggctcgctgtcggt-3’

PCR反应体系如下：

反应条件

94℃5min

94℃30s，56℃30s，72℃，30s         30轮循环

72℃10min

经反向PCR扩增，结果得到2.87kb左右的DNA片段。测序结果表明，此次的克隆序列只包括ectBC及其下游序列，没有克隆到ectA基因序列。

三、ectABC基因簇的全序列的获得

用构建部分基因文库的方法克隆ectA。根据两次杂交结果，在SphI和BglII双酶切的约5Kb具有阳性信号，回收5Kb左右的DNA片段，连到pUCl9的SphI和BamHI位点上，转化大肠杆菌DH5α，构建了部分基因文库。经过菌落PCR，将阳性克隆筛选出来，测序后与已知序列拼接，获得5.946Kb的DNA片段。菌落PCR所使用的引物如下：

Ectup1    5’-gccgcatcacggagga-3’

Ectdn1    5’-gtaggggatcttggag-3’

菌落PCR体系如下：

2×GC rich buffer I      12.5 μl×N

dNTPmix                  2μl×N

Ectup1                   0.5μl×N

Ectdn1                   0.5μl×N

LA Taq(or EX Taq)        0.25μl×N

菌悬液                   0μl

ddH₂O                    8.75μl×N

总体积                   24.5μl×N

菌落PCR的扩增条件为：

变性：95℃，10min

30轮循环：94℃，1min；58℃，1min；72℃，40s

延伸：72℃，10min；4℃，10min

由此，获得了完整的四氢嘧啶合成基因。ecABC基因的克隆策略如附图1所示。ectABC基因簇的全序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1有5496个碱基，其中自5’端第62-1625位为DUF112的编码区，自5’端第2047-2575位为ectA的编码区，自5’端第2746-4030位为ectB的编码区，自5’端第4238-4625位为ectC的编码区。

实施例2、重组大肠杆菌的获得及其检测

一、本发明所用的ectABC基因全序列的获得

利用primer premier 5.0设计一对引物，扩增包括启动子和终止子序列在内的ectABC基因全序列。引物序列如下：

NectupE 5’-GCGAATTCGGCGCAGATCACAGGAATACAA-3’(EcoRI site)

NectdnX 5’-GCTCTAGAGCTCTCCCTCAGCCAGGG-3’(XbaI site)

PCR扩增条件如下：

5×Phusion GC Buffer(含有Mg²⁺)          10μl

dNTP(各2.5m moL/L)                      4μl

上游引物(NectupE)                       1μl(0.5μmoL/L

下游引物(NectdnX)                       1μl(0.5μmoL/L)

喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541的基因组DNA    1μl(1～10ng)

Phusion DNA聚合酶                       0.5μl(2U)

ddH₂O                                   32.5μl

总体积                                  50μl

PCR的扩增条件为：

变性：98℃，2min

30轮循环：98℃，1.5min；52℃，1min；72℃，1min 30s

延伸：72℃，5min

以NectupE和NectdnX为引物，以喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541的基因组DNA为模板进行扩增，得到3.444kb的PCR产物。将该PCR产物送交公司测定序列。测序结果表明目的片段的DNA序列具有序列表中序列1的自5’端第1809-5236位的所示的核苷酸，将该片段命名为Nect。

二、用于大肠杆菌的重组质粒的构建

使用EcoRI和XbaI进行双酶切Nect，经凝胶试剂盒回收后，***到载体pGEM-3zf(+)(购自美国Promega公司)的EcoRI和XbaI位点上，获得重组质粒pGEM-Nect。其构建策略如附图2所示。

三、重组大肠杆菌XL1-Blue的获得及其检测

1、重组大肠杆菌XL1-Blue的获得

通过电转化的方法将重组质粒pGEM-Nect转入大肠杆菌XL1-Blue(购自北京鼎国生物技术公司)中，得到转化子XL1-Blue/pGEM-Nect。同时将克隆质粒pGEM-3zf(+)转入大肠杆菌XL1-Blue中，获得转化子XL1-Blue/pGEM-3zf(+)，作为对照。

2、检测

将上述步骤1得到的转化子和其对照在无NaCl的液体培养基MM63中过夜培养，制成种子液，然后按1％的接种量接种到含0.68mol/L NaCl的MM63液体培养基中，每隔1小时测定培养液中的OD₆₀₀。

结果如图3所示，Nect能使大肠杆菌XL1-Blue在含0.68mol/L NaCl的MM63培养基中生长，并且可明显缩短大肠杆菌XL1-Blue的生长延滞期，提高其最终的OD₆₀₀。

四、重组大肠杆菌KNabc及其检测

大肠杆菌突变株KNabc(美国Terry A.Krulwich教授惠赠，记载过该突变株的非专利文献是Masahiro I，Arthur AG，Bauke O，Terry AK(1999)mrp，a multigene，multifunctional locus in Bacillus subtilis with roles in resistance to cholate and to Na⁺ and in pH homeostasis.J Bacteriol 181：2394-2402.)由于缺失了NhaA和NhaB两个主要的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，对盐非常敏感，0.2mol/L NaCl就可以完全抑制该菌的生长。

1、重组大肠杆菌KNabc的获得

本发明同样通过电转化的方法将重组质粒pGEM-Nect转入大肠杆菌突变株KNabc，得到转化子KNabc/pGEM-Nect，同时将克隆质粒pGEM-3zf(+)转入大肠杆菌突变株KNabc中，获得转化子KNabc/pGEM-3zf(+)，作为对照。

2、检测

将转化子KNabc/pGEM-Nect与对照KNabc/pGEM-3zf(+)先接种在不含Nacl的LBK液体培养基中，过夜培养，按1％的接种量接种于不同NaCl浓度(0、0.05、0.1、0.15和0.2mol/L)的LBK液体培养基中，振荡培养48小时后测定最终OD₆₀₀值。

结果如图4所示，发现转化子KNabc/pGEM-Nect能在含0.2mol/L NaCl的LBK液体培养基中生长，而阴性对照KNabc/pGEM-3zf(+)在此条件下不能生长。

3、验证

为了证实重组子KNabc/pGEM-Nect在含0.2moL/L NaCl的LBK液体培养基上的生长，是由于相容性溶质四氢嘧啶在其细胞质内合成的结果，本发明使用HPLC-UV对重组子KNabc/pGEM-Nect和KNabc/pGEM-3zf(+)细胞内有无四氢嘧啶进行了分析。

相容性溶质的提取方法为：接种重组子于相应培养基中，37℃过夜摇菌。次日按1％的接种量接种于三角瓶中，继续摇菌，直到菌液的OD₆₀₀约为1.0。常温离心收集菌体，并置于冷冻干燥机中干燥；称量菌体的干重后，置于400μl的提取混合液(甲醇/氯仿/水，10∶5∶4[体积比])中剧烈震荡(或超声)30min。再加入等体积(130μl)的氯仿和水，再次振荡30min。回收含有相容性溶质和其它溶质的上层水相，冻干；加入100μl水和400μl的乙腈，完全溶解后，过滤，备用。

HPLC-UV分析条件是：仪器为美国安捷伦公司的Agilent 1100系列高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器(UV-detector)。检测条件：流动相为水∶乙腈＝1∶4，流速为1ml/min，检测波长为210nm。

结果如图5所示，四氢嘧啶标样(购自Sigma公司)的出峰时间在4.43min。同样，在KNabc/pGEM-Nect提取的相容性溶质的色谱图中，在4.43min也具有一个明显的色谱峰(图5B)，而对照KNabc/pGEM-3zf(+)中则没有该峰出现(图5C)，说明四氢嘧啶确实在KNabc/pGEM-Nect细胞内合成。由此，已证明从中度嗜盐菌喜盐涅捷连科氏菌中克隆得到的四氢嘧啶合成基因具有明显的遗传优势，不但能在大肠杆菌中异源表达，而且能显著提高大肠杆菌KNabc的耐盐能力，并且能在大肠杆菌KNabc中积累。

实施例3、重组根瘤菌的获得及其检测

苜蓿中华根瘤菌是重要的农用微生物，可以与苜蓿等牧草结瘤固氮，提高牧草产量，其共生体系在农牧业上具有重要的应用前景。但这种共生体系往往会受到盐胁迫的抑制。基于四氢嘧啶合成基因在大肠杆菌中的高效表达，可以将其作为耐盐的基因资源在重要的农用菌株中进行应用。

一、重组根瘤菌的获得

1、重组表达载体的构建

运用EcoRI和HindIII双酶切重组质粒pGEM-Nect，胶回收酶切过的片段，连接到pLAFR3(中国农业大学已保存，记载过该载体的非专利文献是孙栋 唐莉丽 王倩倩等，2006，高盐极端环境土壤基因组DNA的分离纯化方法研究及基因文库的构建，广西农业生物科学，25(1)：24-29)的EcoRI和HindIII位点中，构成重组表达载体pLAFR-Nect，然后转化大肠杆菌DH5α，挑出能在含有25μg/ml四环素(Tc)的LBK平板上能生长的单菌落，提取质粒，酶切验证。构建策略如附图6所示。

2、重组根瘤菌的获得

利用三亲本接合实验，将重组质粒pLAFR-Nect转移至苜蓿中华根瘤菌1021(中国农业大学已保存，记载过该载体的非专利文献是Jebbar M.，Sohn-Bosser L.，Bremer E.，Bernard T.and Blanco C.Ectoine-Induced Proteins in Sinorhizobium meliloti Include an Ectoine ABC-Type Transporter Involved in Osmoprotection and Ectoine Catabolism.J.Bacteriol.，2005，187：1293-1304)中，获得苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18。

其中，三亲本接合的具体操作如下：将受体菌株苜蓿中华根瘤菌1021在固体TY培养基上活化，28℃培养2-3天。挑取单菌落接种于5ml含有400μg/ml链霉素的TY培养液中，28℃振荡培养24h。按1％的接种量转接于另一含有5ml含有400μg/ml链霉素的TY培养液的试管中，28℃继续培养20h左右。

将含有供体质粒pLAFR-Nect的大肠杆菌菌株DH5α和含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌菌株DH5α分别活化后，同时接种于5ml含25μg/ml四环素和50μg/ml的卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养16h。按1％的接种量转接于另一LB试管中，继续培养8h左右。

同时，分别收获供体、受体菌株和含辅助质粒的菌株，以10,000rpm离心1min，收集菌体，然后分别用0.9％的生理盐水培养液洗涤菌体2-3次。将三种菌悬液等量混和，离心，倒掉上清，静置，用200μl枪头将松散的菌泥转移到TY固体培养基上的硝酸纤维素膜(45μm微孔滤膜)上，28℃培养24h。注意：不要倒置培养。用接种环将滤膜上的菌体刮下，溶于无菌生理盐水中，充分打散菌体后进行梯度稀释。各取100μl不同稀释度的菌悬液，涂布于含50μg/ml四环素和400μg/ml链霉素的YMA培养基上，同时涂布适当浓度的供体和受体菌悬液，作为阴性对照。将平板表面吹干后，于28℃倒置培养2-4天。将平板上长出的单菌落分别挑到含有50μg/ml四环素和400μg/ml链霉素的YMA培养基培养，提取质粒，并酶切验证，至此，得到含有pLAFR-Nect的苜蓿中华根瘤菌1021，命名为Sm/pLAFR-Nect，其中的一株命名为苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18。

同时，按照获得Sm/pLAFR-Nect的方法将pLAFR3转移至苜蓿中华根瘤菌1021，获得对照Sm/pLAFR3。

二、检测

1、耐盐实验

挑取接合子的单菌落，接种于含有50μg/ml四环素和400μg/ml链霉素的TY液体培养基中，28℃下摇菌2天，然后按1％比例接种于含有不同浓度的NaCl(浓度分别是0；0.1；0.3；0.5；0.7；0.9；1.1；1.3和1.5mol/L)、KCl(浓度分别是0；0.1；0.3；0.5；0.7；0.9；1.1；1.3；1.5和1.7mol/L)和LiCl(浓度分别是0；0.1；0.2；0.3；0.4；0.5；0.6；0.7和0.8mol/L)的液体TY培养基中，3天后测定OD₆₀₀。

1)耐NaCl实验

结果如图7所示，NSM18菌株能够在高达1.4mol/L NaCl的TY培养基上生长，而对照苜蓿中华根瘤1021(Sm/pLAFR3)最高只能在0.6mol/L的NaCl上生长，表明NSM18菌株具有很高的NaCl抗性。

2)耐KCl实验

结果如图8所示，NSM18菌株能够在高达1.5mol/L KCl的TY培养基上生长，而苜蓿中华根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)最高只能在0.6mol/L的KCl上生长，表明NSM18菌株具有很高的KCl抗性。

3)耐LiCl实验

结果如图9所示，在小于0.4mol/L LiCl，尤其是在0.2-0.4mol/L LiCl之间，NSM18菌株的生长比苜蓿中华根瘤1021(Sm/pLAFR3)弱，并随着LiCl浓度的升高而降低。但在大于0.5mol/L LiCl培养条件下，NSM18菌株依然能够生长，而苜蓿中华根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)却不能生长。

4)高盐下的HPLC-UV检测

为了进一步证实NSM18菌株在含高盐的TY培养基上的生长，是由于相容性物质四氢嘧啶在其细胞内积累的结果，将生长在含0.5mol/L NaCl的TY液体培养基中的NSM18菌株细胞内的相容性溶质提取，然后以HPLC-UV检测其细胞内四氢嘧啶的积累情况。检测条件为：流动相为水∶乙腈＝4∶1，流速为1ml/min，检测波长为210nm。

其中相容性溶质提取的方法与实施例2中KNabc/pGEM-Nect中相容性溶质的提取方法一致。

结果如图11A所示，四氢嘧啶标样的峰出现在色谱图中的2.176min处。从图11B可以明显看出，NSM18菌株细胞内提取物中具有与标样一致的四氢嘧啶特征峰，而苜蓿中华根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)则不具有该特征峰(图11C)，表明该工程菌株中确实有四氢嘧啶的积累。

2、耐高温检测

由于四氢嘧啶能够稳定微生物等生物体内各种酶的构型，从而提高微生物耐受极端环境的能力，因此，本发明对NSM18菌株的耐温性能进行了研究。实验步骤如下：

挑取接合子的单菌落，接种于含有50μg/ml四环素和400μg/ml链霉素的TY液体培养基中，28℃下摇菌2天，然后按1％的接种量接种于上述培养基中，置于不同温度下：28℃、37℃、42℃三个温度梯度，大约3天测定OD₆₀₀。

结果如图10所示，在28℃的常规培养温度下，NSM18菌株和苜蓿中华根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)生长没有任何差异(图10A)。在37℃培养条件下，NSM18菌株的延滞期明显缩短，比苜蓿中华根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)缩短了近10h(图10B)。在42℃培养条件下，Sm/pLAFR3已经完全不能生长，而NSM18却依然能够生长，只是生长延滞期达到20h(图10C)。从上可以看出，NSM18菌株确实具有一定的耐热能力。

由上述步骤1耐盐性试验和步骤2的耐高温检测表明，工程菌株NSM18具有耐盐、耐高温的能力。

3、结瘤实验的研究

为了分析NSM18菌株(Sm/pLAFR-Nect)、Sm/pLAFR3和野生型对照苜蓿中华根瘤菌1021共生固氮能力，本发明选用优良的苜蓿品种紫花苜蓿保定，购自北京中畜东方草业科技有限责任公司，作为结瘤实验的植物宿主，在温室中培养(温度在25-28℃，光照时间12h)40天后收获。

结瘤实验操作步骤如下：

将紫花苜蓿种子放入无菌培养皿中，加入95％乙醇，用枪头反复抽吸，使种子表面被完全浸润。5分钟后，吸掉乙醇，加入0.1％升汞5ml，消毒5分钟，然后用无菌的生理盐水反复冲洗3遍。将表面消毒的种子置于垫有湿润滤纸的无菌培养皿中，于28℃培养2-3天，待主根长到2-3cm时，进行瓶栽和接种。每瓶中保留3-5棵苜蓿幼苗。采用双层瓶法进行结瘤实验，将萌发的无菌种子种植于无菌双层瓶中，上层瓶中装满蛭石，下层瓶中装有上述的无氮培养液，用纱布经上层瓶瓶底的小孔引流到上层瓶中，以保证蛭石的湿润度。双层瓶经121℃灭菌1小时。将根瘤菌(工程菌株NSM18、Sm/pLAFR3和Sm1021)分别在TY培养液中培养至对数期，以5000rpm离心5min，收集菌体，用生理盐水重悬菌体，调整其浓度为10⁷-10⁸菌体/ml。每瓶接种量为1ml，以不接种的处理为对照(图12中的CK为没有接种的处理)。每组处理设3-5瓶重复。将双层瓶随机摆放在温室中，每天光照时间约为12小时，温度25-28℃。40天后收获，测定根瘤数。剪取植株地上部分，测定株高，并于70℃温箱烘至恒重，即得植株干重。

表1.结瘤实验结果

试验菌株	单株干重(g)	单株根瘤数(个)	单株株高(cm)	氮含量(％)
					Sm/pLAFR3	0.070a	11.87a	22.84a	2.84
Sm1021	0.074a	12.19a	23.81a	2.67
					工程菌株NSM 18(Sm/pLAFR-Nect)	0.076a	14.48a	26.06a	2.56

注：Sm1021表示苜蓿中华根瘤菌1021

结果如表1和图12所示，工程菌株NSM18(Sm/pLAFR-Nect)仍保持亲本菌株优良的固结瘤能力。表明它是一株耐盐高效的苜蓿中华根瘤菌工程菌株。

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)NSM18已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3383。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇

<160>1

<210>1

<211>5496

<212>DNA

<213>喜盐涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia halobia)

<400>1

gcatgccctc ccggcaggcc gcacgcgacc cgccgccccc accagtcgaa ggagcccggt     60

gatgtcgtcg caccccacca ccccggaaac cgacaggacc agagaggccg cgggcccccg    120

cccgggggcc tcggaggagc acgtgccgca cacccggctc tggaccggac gcgtcctggg    180

cccggtgctc ggggtgatcg tctacctcgc cagcagccag gacccggccc tgagcacgga    240

cgcggcgatg acgctcggcg tcgccgtgct catcgccgtg tggtggatga ccgaggcgct    300

gccgctggcg gtgacctcgc tgatgccgct gctgctcttc cccctgctgg gcgtcttcga    360

catcgaccag gccgccagcc agtacggcga caacatcgtc ttcctcttcc tcggcggctt    420

catcatcgcc ctggcgatgg agaagtggaa cctgcacaag cgcatcgccc tgctgacgat    480

gcgcggcatc ggttctcgac cccgccagct gctgctcggc atcatggtcg cgacctggtt    540

cctgtccatg tgggtctcca acacggcgac gacgatgatg atgctgccca tcggcgtctc    600

cgtgctgacc atggtcgcca gcgagaagct ctcccacctg cccgccgccc agcgccccgc    660

cggcgacgac gacccggtca ccgcgctctc cggcgaccgc gacacccgca acttcgccat    720

cagcgtcatg ctcggcatcg ccttcgccgc cacgatcggc ggactgggca cgctgatcgg    780

cagcccgccc aacctcgtca tggtcggggt gatggagcag cagttcgaca ccaccgtcag    840

cttcgccgac tggatgaagc tgggcgtgcc gctgtcgctg gtgttcctgt tcgtcgcctg    900

gctgatgctc agtcgggtca tcttccccac gaccatgacc gacgccatgg gcggccggga    960

cgtcgtccgc gacgagctcc gcgcgctcgg gaagatgtcc cgcggcgagt ggagcgtgtt    1020

ggcggtcttc gtctccaccg ccctgctgtg ggtcttcacc ggccagctgc agaagatcga    1080

ctggctggtc gatgccctgc ccttcctcga gggcatgaac gacaccagca tcgcgatggc    1140

cgcggccatc gcgctcttcc tcatcccggt ctcggccaag gacggcgtgc aggccatgga    1200

ctggaagacg gcccagcgcg gggtcccgtg gggcgtgctg ctgctcttcg gcggcggcct    1260

ctgcctcgcc gccgcgatgt ccgagaccgg cgtctccgac tggatcggcg agcgcatgga    1320

gggcctcggc gtgctgccga ctgtgctgct cgtcgccgcg gtctgcctgc tcaccctgct    1380

gctgaccgag ctgaccagca acaccgcgac ctcgacgacc ttcctgccgg tcttcgccgg    1440

cttcgccgtc gcgatcggcg tcgacccgat gctgctgatg gtcccggcgg cgatggccgc    1500

gacctgcagc ttcatgctgc cggtcggcac ccctccgaac gccatcgtct acggctccgg    1560

ctacgtgacc atgccgcaga tggtgaaggc cggcgtctgg ctgaacctga tcggcgtcgt    1620

gctgatcacc ggcatgacga tgctgctcgg cggatgggcc atgggcctgg acctctgagc    1680

ctctccactc gggccggaac gcggggccgg ggcgcggggc atgactccgc accccgcccg    1740

atgtgtgagc gtcccgtccg cgggaccgtc ggggccctcg ggcgcgaccg gaccccggag    1800

cgcgtcatgg cgcagatcac aggaatacaa ggggctttga cgtcttcttc atcacaaaga    1860

cgattacagt cttcccattt cttcgcgcat ttccgaccgg atcctcacat cgtcatcatg    1920

acggggatcg cacgacgcgg ataatctctg cggaaggcga cggcgggccg ccgacgcccc    1980

acgacaaggc cgcagaatca gcattcccgg ttgattcgtc ctccacggtc agtatcgtgg    2040

ggcgcgatgc ctgactccgc agacgaccct gcccattccg gggaagagat cgagctccgc    2100

gcccctgtgc tctccgacgg cgccgccctg tggcggatcg ctgagggcac cggcgtcctc    2160

gatgtgaaca ccccgtacgc ctacctgctg tggacccgcg acttcgccac gacgtcggtg    2220

atcgccctgg tcgacggccg ccccgcaggc ttcatctccg gctacctccg cccctccgac    2280

ccgcagacgc tgttcatctg gcaggtggcc gtcgactccg agttccgcgg gcgccgcctg    2340

gcctcccgga tgctcgccga cgtcgtcgcc cgctccggcg cccgccgcct ggagaccacc    2400

atcaccgcgg acaacaccgc ctccatcgcg ctgttcaccg ggctcgcccg cgaccacgac    2460

gccgagatca cccgatccga cctgttcacc gaagacctct tccccgctca gcaggagacc    2520

ggcgagcacc acgccgccga ggacctctac accgtcgagc cgctgcgctc gagctgaacg    2580

acgcccccca gacgcacgac gtcggccgcc gcggccggat ccgccggatc cacggcgggc    2640

gcgccgcggc atcggccgcc ggccgagccc cgccgacgtc gacagcaccg atcccccacc    2700

ccagaccgcg gcgcacgacg ccgcatcacg gaggagacca cacctatggc caccgacatc    2760

ttcgaaacct tcgaatccca ggtccgcagc tactgcatga actggccggc cgtcttcgag    2820

aaggcctccg gctcctacca gtacaccgag gacggctcgc ggtacctgga cttcttctcc    2880

ggggccggcg cgctgaacta cggccacaac cacccggagc tgcgcgacct gctggtcgac    2940

tacgtggcca acgacggcgt cacccactcg ctggacatga agactccgtc caagcgccgc    3000

ttcctggaga ccttcgagcg ggtcatcctg gagccgcgga acatggagta caaggtcatg    3060

ttcccgggcc cgacgggcac caacagcgtc gaggcggcgc tgaagctggc ccgcaaggtc    3120

accggccgcc agcacatcct gtcgttcacc aacgccttcc acggcatgac gctgggctcg    3180

ctgtcggtca ccggcaactc gatgaagcgc cgcggcgcgg gcatcccgct gaccaacagc    3240

tccaagatcc cctacgacga ctacttcgac ggcaacatcc cggactttat ctggctggag    3300

aaggtcctgc aggactccgg ctccggcgtc gacaagccgg ccgcggtcat cgtcgagacc    3360

gtgcagggcg agggcgggct gaacgccgcg cgcatggagt ggctgaagga gctctccgcg    3420

ctgctgcgcc gccacaagat cctgctgatc atcgacgacg tgcaggccgg ctgcggccgc    3480

accggcacct tcttctcctt cgaggaggcc ggcatcaccc cggacatcat ctgcatgtcc    3540

aagtcgatct ccggctacgg cctgccgatg gcgatcacgc tgttcaagcc ggagctggac    3600

gtctgggagg gcggcgagca caacggcacc ttccgcggca acaacctcgg cttcatcacc    3660

ggcgcccggg ccctggagct gttctggtcg gacgactcct tccagaagca gctggccgcg    3720

aagatcgaga cgctccgcga gggcctggag gacatcgccc agcacgtgaa gggcgcgacg    3780

ctgcgcggcc gcggcttcct gaccggcatc tgcttccccg acgccgacac cgccggcaag    3840

gtcgccgccg agtcctataa gcggaacctg ctgctggaga cctccggccc cgaggacgag    3900

gtcatcaagg tcatgccgcc gctgaccatc gaggacgacg acctgcagaa gggcatcaag    3960

gtcatcgagg acgccgggct ggccgccacc ggccagatga gcgagccgag ccgcctgcgc    4020

gccccgcgct gatcccgctc cgacgcggag ctccccgcgt cccccggtcc cctctcctcc    4080

gacggcttgc gccgtgggat gatgcggaga ccggggacgc gagccgtgcg ggaccgccgc    4140

cccgcgccgg cctcgacccc gcccggacgt cggtccgccg acgtcggccg tccatgacga    4200

cctccgcacc atccctcccc gcagacagga gacgactatg tacacgctgc acatcgacga    4260

cctcaacgac ggcgagcgcg acatccgcga cgccgactgg cgctcccgcc ggatggtcct    4320

gggccgtgag aaggtcggct tctcgctgca cgagaccacc atctacgccg gctccaccca    4380

ctcgttctgg tacgcgaacc acatcgaggc cgtctactgc gtcggcggca agggtcggct    4440

gaccaacctg gagaccgacg aggtccacga gatcaccgac ggcttcctct acctgctcga    4500

cggtcacgag aagcaccagg tggaggccga cgaggagctc cgactggtct gcgtgttcaa    4560

cccgccggtg accggcaagg agatccacga cgagaacggc gtgtacccgc tgatcgtcga    4620

agactgagca ccgccgcgcg ctgagccggc gcgagccctc gctcgcccgc acgacgacgc    4680

ccgccccggg atcgcggaga tctccggggc gggcgtcgtg gtgtgcggcg ccgctactcg    4740

gctccggtcc ggtccaggtc cgcccggttc ttccggacct gccggatctt cggcagcacc    4800

atggcaccgc caggatcagc accgcgatca tcaggatgac cacggtcgag ggccgggtga    4860

agaacaccga gaagtcgccc tggctgaggg agagcgcccg ccgcagctgg gtctcgacca    4920

tcggcccgag gatcgcgccg aggatcgcgg gggcgaccgg gaagtcgtag acccgcatga    4980

agaagccggc cacaccgatc aggcagacga gcatcacctc gatgagcgag ccggagatcg    5040

agtacacgcc gaggatgcct agcaccagga tgccggcgta gagcagcgtc ttggggatct    5100

ccagcagctt gatccagatc ttcaccagcg gcagattgat caccagcagc atcacgttgc    5160

cgatgaacag cgaggcgatc agcgtccaga ccaggtccgg ggagttctcg aagagcttcg    5220

gcccgggctg gatgttgtag acctggaagg ccgagaggat gatcgccgcc gtggccgagg    5280

tcgggatgcc cagcgtcagc agcggcacca gcacgccgga gaaggaggcg ttgttcgccg    5340

cctccggtcc ggcgacacct tcgatggcgc cgtggccgaa ctcctccggg tgcttcgaga    5400

gccgccgctc ggtggtgtag gagaggaacg tgggcacctc ggagccgccg gtgggcatgg    5460

agccgaaggt gaatccgagc aggccgccgc ggatcc                              5496

Claims (13)

1.一个基因簇，为如下1)-2)中任一种：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1809-5236位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1所示序列。

2.含有权利要求1所述基因簇的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求1所述的基因簇***pLAFR3的多克隆位点构成的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述基因簇的转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求2或3所述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述苜蓿中华根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌1021。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是苜蓿中华根瘤菌NSM18 CGMCC No.3383。

9.一种培育耐盐和/或耐高温的转基因重组菌的方法，其特征在于：所述重组菌是将权利要求2或3所述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述苜蓿中华根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌1021。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述重组菌是苜蓿中华根瘤菌NSM18CGMCC No.3383。

13.权利要求1所述的基因簇、权利要求2或3所述的重组载体、或权利要求4-8任一所述的重组菌在合成四氢嘧啶中的应用。

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