CN103981212B - 将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，包含以下步骤：在颖壳颜色决定基因OsCAD2外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，导入水稻细胞并再生成苗，在通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位OsCAD2基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，实现颖壳颜色的改变。实验表明，本方法可快速改变水稻品种的颖壳颜色。
Description
技术领域
本发明涉及水稻生物技术育种领域，具体涉及一种将现有黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改良为褐色的育种方法。
背景技术
我国的杂交水稻制种技术经过30多年的研究发展，不仅制种技术成熟，而且，制种产量也成倍提高，为我国主要农作物产量的持续提高起到了关键作用。但是，杂交水稻制种技术仍然存在制种效率不高，劳动强度大，种子质量难以控制，种子产量不稳定等问题。解决这些问题的有效路径是实现全程机械化的混播制种。由于混播制种中存在父母本和杂交亲本的混收混种，需要适当的标记区分杂交种子和亲本。目前，水稻颖壳的颜色被认为是最具实用化前景的区分标记之一，因此发展快速改造水稻品种颖壳颜色的育种技术将有效促进杂交水稻混播制种技术的发展。
水稻颖壳颜色的遗传机理目前已部分明确。非常规水稻颖壳颜色主要包括深金黄色(褐色)和黑色，其表现的性状受到不同的基因调节。OsCAD2是一种可单独控制水稻颖壳颜色的基因。OsCAD2编码一种肉桂醇脱氢酶，可催化裂解羟基肉桂醛，是木质素合成途径中的关键步骤。已有报道表明，籼稻品种浙辐802的突变体gh2中，OsCAD2基因第四外显子中第554位的G突变为A，造成OsCAD2蛋白中相应的甘氨酸变为天冬氨酸，引起肉桂醇脱氢酶活性的丧失，从而引起gh2突变体的颖壳颜色变褐；而在粳稻品种日本晴中，反转座子Tos17***造成OsCAD2表达提前终止，也造成了同样颖壳颜色加深的性状。
现代作物育种中，存在针对单个性状的改良需求。这个时候，已杂交-回交为基础的传统育种的聚焦能力略显不足，且育种周期长、成本也很高。与之不同，分子生物学技术，特别是最近发展出的基因打靶技术可以快速准确的为单基因的变化提供有效解决方案。特别是2013年起发展出的CRISPR/Cas9技术，具有高通量、操作简单等优良特点，将在分子设计育种中发挥重要作用。
发明内容
本发明提供了一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、在水稻颖壳颜色决定基因OsCAD2外显子区中选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶标片段，其中，N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，所述靶标片段位于所述OsCAD2基因外显子上；
步骤2、利用所述靶标片段，构建用于水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；
步骤3、将所述重组载体导入水稻细胞，诱导含有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，在向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框的共同作用下，剪切OsCAD2基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机***或缺失碱基，实现水稻细胞内OsCAD2基因的功能缺失突变；
步骤4、用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；
步骤5、对再生的水稻植株中OsCAD2基因包含靶标片段的DNA区段测序；
步骤6、选择两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型观察，选取颖壳颜色变褐的株系。
在一种实现方式中，所述靶标片段中的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。
在一种实现方式中，X为19或20。
进一步地，所述功能缺失突变为正常OsCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
在一种实现方式中，所述重组载体包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，所述重组载体还包含能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。
在一种实现方式中，所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至246位所示；结构特征为(N)X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第351至358位所示。
在一种实现方式中，所述Cas9核酸酶表达框包括玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第1至2031位所示，植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第6347至6599位所示。
在一种实现方式中，步骤2具体包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体。向导RNA表达框由CRISPRRNA(crRNA)和sgRNA组成(对于不同位点的基因打靶来说，sgRNA是固定不变的，而CrRNA是根据靶位点的不同变化的)。所述重组载体中CRISPRRNA(crRNA)序列为步骤1中所述靶标区段5’-(N)X-NGG-3’中的(N)X或与之互补的序列。
该方法中，将重组载体导入水稻细胞的方法为PEG介导的水稻原生质体瞬时转化或农杆菌介导的水稻愈伤组织稳定转化。
所述步骤5包括通过基因组PCR方法克隆再生植株中OsCAD2基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。所述基因组PCR方法为，针对包含靶标片段的基因组区域，设计位点特异性引物，以再生植株的基因组DNA为模板，扩增所述包含靶标片段的基因组区域。所述扩增产物测序是指，对PCR产物中的目的条带测序。
该方法中所述两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变是指测序结果在OsCAD2基因靶标位点出现两种功能缺失突变序列，且没有出现野生型序列；其中所述功能缺失突变指的是正常OsCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
本发明能够通过对特定基因的剪切，实现基因突变，进而改变颖壳颜色。本发明针对水稻的特性专门设计了向导RNA和Cas9核酸酶表达框，来实现本发明的目的。
本发明一种实现方式中所采用的向导RNA表达框的核苷酸序列为：
本发明一种实现方式中所采用的Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列为：
附图说明
图1为通过PEG介导原生质体瞬时转化再生水稻株系中OsCAD2基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示为野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了***突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或***的核苷酸数量；
图2为所创制褐壳水稻材料水稻种子的表型，A表示为供体材料，即用于颖壳颜色形状改良的品种皖粳97，B为供体皖粳97经定向改良后具有褐色颖壳的皖粳97材料。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
靶标片段的选择
在水稻颖壳颜色决定基因OsCAD2(LOC_Os02g09490.1)外显子区选取靶标片段，所选择的双链靶标片段的一条链要具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个。在所述OsCAD2基因外显子上，具有所述(N)X-NGG-3’结构的片段可选为靶标的共有96个。
在本实施例中，选择水稻OsCAD2基因(LOC_Os02g09490.1)第一外显子上中自翻译起始密码子ATG后第14-36位的核苷酸序列CCGCCGAGAAGACCGTCACCGGG，(下划线部分为所述5’-(N)X-NGG-3’结构中NGG部分)，作为打靶位点。
用于水稻OsCAD2基因打靶的重组载体的制备
a.按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(OsCAD2KO1P1)和与之互补的反向寡核苷酸链(OsCAD2KO1P2)，
具体序列为：
OsCAD2KO1P1:TGTGCCGCCGAGAAGACCGTCACC；
OsCAD2KO1P2:AAACGGTGACGGTCTTCTCGGCGG。
其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中去除NGG的序列或互补序列，具有下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
b.对OsCAD2KO1P1和OsCAD2KO1P2进行退火程序，将OsCAD2KO1P1和OsCAD2KO1P2两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。
c.用BsaI内切酶(由NEB公司生产)在37℃酶切包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框(核苷酸序列如SeqIDNo.1所示)和能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框的水稻CRISPR/Cas9基因工程载体(核苷酸序列如SeqIDNo.2所示)。本发明的发明人设计出了这样的载体，不过载体结构和构建方法参照现有文献(Xuetal,GenetargetingusingtheAgrobacteriumtumefaciens-mediatedCRISPR-Cassysteminrice,RICE,2014)所示，使用BsaI内切酶酶切水稻CRISPR/Cas9基因工程载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。
d.用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和***片段相连，转入大肠杆菌中。对所得产物经测序验证后，提取其阳性转化子，构成用于水稻OsCAD2基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒。
原生质体瞬时转化介导的水稻OsCAD2基因打靶和褐壳材料获得。
1、利用PEG法将上面获得的用于水稻OsCAD2基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒转化至水稻皖粳97原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Zhang等人的“Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglight/chloroplast-relatedprocesses.”PlantMethod(2011)中公开的实验方法。
2、利用步骤1中转化后的水稻原生质体，获得再生水稻植株(共18株)。水稻原生质体转化和植株再生具体过程参考了文献Hayashimoto等“APolyethyleneGlycol-MediatedProtoplastTransformationSystemforProductionofFertileTransgenicRicePlants”PlantPhysiology(1990).中公开的实验方法。
3、利用植物基因组小量提取试剂盒(由天根生化公司生产)，提取所获18棵再生植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：
OsCAD2KO1genomecheckFP:GAGAGAGAGCGAATCAGCCACT
OsCAD2KO1genomecheckRP:GTAGTAGAACGCATGTACCAGA
4、以OsCAD2KO1genomecheckFP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测18棵植株中，9棵植株带有OsCAD2基因靶标序列上的突变，突变效率为50％；突变的形式包括碱基的***和/或缺失。部分结果如图1所示；其中两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系为4株，同时出现等位基因效率为44.4％。图1中带阴影的CCGCCGAGAAGACCGT----CACC部分为打靶目标位。
5、观察具有两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系的种子颜色，所有4株水稻的种子均表现为深褐色，表明所述4株具有两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系的颖壳颜色成功获得改造。
本发明的育种方法相对于传统育种方法具有以下优点：
①，育种周期短，整个材料定向创制过程耗时约7个月，而传统杂交-回交方法至少需要3～5年时间。
②，只改变了受体品种的一个基因，所获材料除颖壳颜色外其他农艺性状不变，而传统回交方法会导入与OsCAD2连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状。
本发明采用特殊设计的载体进行CRISPR/Cas9打靶，定向地实现特定基因的突变，具有广泛的应用前景。经实验证明，采用这种方式，突变效率明显高于常规方法。
虽然上面参照本发明的优选实现方式对具体实施例进行了描述，但是本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是作为示例，而并不对本发明的范围带来限制。
Claims (6)
1.一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、在水稻颖壳颜色决定基因OsCAD2外显子区中选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶标片段，其中，N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，所述靶标片段位于所述OsCAD2基因外显子上；
步骤2、利用所述靶标片段，构建用于水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框能够在水稻细胞内表达，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，所述Cas9核酸酶表达框能够在水稻细胞内表达，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示；
步骤3、将所述重组载体导入水稻细胞，诱导含有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切OsCAD2基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机***或缺失碱基，实现水稻细胞内OsCAD2基因的功能缺失突变；
步骤4、用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；
步骤5、对再生的水稻植株中OsCAD2基因包含所述靶标片段的DNA区段测序；
步骤6、选择两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型观察，选取颖壳颜色变褐的株系。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述靶标片段中的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。
3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于，X为19或20。
4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述功能缺失突变为正常OsCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
5.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，
所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至246位所示；结构特征为(N)X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第351至358位所示。
6.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，
所述Cas9核酸酶表达框包括玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第1至2031位所示，植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第6347至6599位所示。
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Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
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| CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
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| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
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| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
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| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
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| DE112020001342T5 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-13 | President and Fellows of Harvard College | Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen |
| EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| CN116814841B (zh) * | 2023-08-16 | 2024-02-06 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 一种鉴定水稻黑褐色颖壳基因hk4的引物组及其方法和应用 |
-
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CRISPR／Cas9新型基因打靶***的研究进展;李辉等;《江苏农业学报》;20131231;第29卷(第4期);907-911 * |
| Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice;Rongfang Xu等;《Rice》;20140502;第7卷(第5期);1-4 * |
| GOLD HULL AND INTERNODE2 Encodes a Primarily Multifunctional Cinnamyl-Alcohol Dehydrogenase in Rice;Kewei Zhang等;《Plant Physiology》;20060331;第140卷;972–983 * |
| OsCAD2 is the major CAD gene responsible for monolignol biosynthesis in rice culm;Ko Hirano等;《Plant Cell Rep》;20121231;第31卷;91-101 * |
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