CN108034656A

CN108034656A - 与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用

Info

Publication number: CN108034656A
Application number: CN201711258265.1A
Authority: CN
Inventors: 蒲志刚; 向小利; 王平
Original assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2018-05-15

Abstract

本发明公开与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPRCas9载体、载体构建、应用，克服需要在OsCHI两个等位基因都突变才得到褐壳水稻的缺陷。本发明：提供sgRNA片段，包含特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因第五个外显子的gRNA。该sgRNA具体是T1、T2、T3。提供包含上述sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其构建方法，该载体可编辑水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因。提供这些片段与载体在获得具有红褐色颖壳和茎结性状水稻材料中的应用。提供用于检测CRISPR/Cas9‑CAD基因重组的引物序列。本发明可降低传统育种成本，提高杂交水稻制种机械化水平，缩短育种周期。

Description

与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用

技术领域

本发明涉及与红褐色颖壳性状水稻有关的一种sgRNA片段、 CRISPR/Cas9编辑载体、载体构建方法，及应用。属于基因工程领域。

背景技术

利用自然突变和人工突变，水稻种质资源中能够获得少量不同颖壳颜色的育种材料。借助颖壳的不同颜色可以在水稻机械化制种中将不育系上结的杂种与一同用收割机收获的恢复系种子准确地分开，因而不同颖壳颜色在杂交水稻制种中具有很高的技术价值。但是如果利用传统常规杂交、回交的方法将壳色性状转育到恢复系、保持系且不改变原有材料的特性，需要近十年的时间才能实现。

授权公告号为CN 104017821 B的中国发明专利公开了一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法。该方法主要内容包括在颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段并构建植物 CRISPR/Cas9打靶重组载体，将该重组载体导入水稻细胞并再生成苗，在载体中的表达框的作用下对水稻细胞进行剪切，触发水稻细胞DNA 的自我修复功能。再通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位OsCHI基因同时发生功能缺失突变的株系，经过颖壳颜色鉴定，即为所创制的褐壳水稻材料。该方法不足之处在于：需要在OsCHI两个等位基因都突变才能产生褐壳水稻，同时对两个基因进行突变的效率较低，难以获得两个基因突变的纯合突变体。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种可以快速获得红褐色颖壳性状水稻材料的技术方案。

为实现上述目的，本发明首先提供一种sgRNA片段，该sgRNA片段能够针对同一基因进行编辑，其技术方案如下：

一种sgRNA片段，其特征在于：包含特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶 CAD基因的第五个外显子的gRNA。

上述sgRNA片段包含的gRNA特异性靶向于水稻肉桂醇脱氢酶 CAD基因(Oryzasativa(indica cultivar-group)cinnamyl-alcohol dehydrogenase(CAD)gene，GenBank:DQ234272.1)的第五个外显子，碱基序列如SEQ ID NO.6。

上述sgRNA片段，包括三个sgRNA片段，分别是：命名为T1的 sgRNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.1；命名为T2的sgRNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.2；命名为T3的sgRNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.3。

上述三个sgRNA片段是选择水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因(Oryza sativa(japonicacultivar-group)cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD)gene) 上的三个sgRNA靶向位点，参考http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR靶位点预测而设计，用http://www.rgenome.net/cas-offinder/网址分析脱靶效应，最终选择确定。

上述sgRNA片段可用于制备水稻肉桂醇脱氢酶基因CRISPR/Cas9 基因编辑载体。本发明进一步提供技术方案：上述sgRNA在制备水稻肉桂醇脱氢酶基因CRISPR/Cas9基因编辑载体中的应用。

本发明同时提供包含上述sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

上述CRISPR/Cas9基因编辑载体是Cas9核酸酶介导的水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因编辑载体，包括三个分别由OsU6a、OsU6b、OsU6c 启动子调控T1、T2、T3sgRNA表达的表达框、由玉米泛素Ubiquitin(Ubi) 启动子调控Cas9表达的表达框。

本发明同时提供包含上述CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，其技术方案如下：

上述CRISPR/Cas9基因编辑载体构建方法，其特征在于：将分别连接启动子的T1、T2、T3通过Bsa I酶连入pYLCRISPR/Cas 9P_ubi-H质粒，构建得到Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3表达盒，获得 pYLCRISPR/Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3编辑基因的最终载体。

本发明同时提供上述CRISPR/Cas9基因编辑载体在特异针对水稻肉桂醇脱氢酶基因进行基因编辑的应用。

进一步地，上述CRISPR/Cas9基因编辑载体的应用方法，是将构建好的载体转入农杆菌EHA105用于农杆菌介导的水稻日本晴愈伤组织遗传转化，并将愈伤组织诱导培养获得再生植株。

进一步地，所得再生植株可经自交筛选获得不含转基因片段的红褐色颖壳性状的水稻株系/材料；也可经回交转育获得改良恢复系。

本发明sgRNA片段、CRISPR/Cas9基因编辑载体在制备红褐色颖壳性状水稻株系/材料中的应用；所述红褐色颖壳性状的水稻株系/材料含有或者不含有SgRNA:Cas9:HPT转基因片段。该应用方法具体是通过构建 SgRNA:Cas9:HPT片段应用于水稻肉桂醇脱氢酶基因突变水稻株系。

为检测CRISPR/Cas9-CAD基因重组，本发明还提供相应的引物序列，其技术方案如下：

用于检测CRISPR/Cas9-CAD基因重组的引物组合1F、1R，其特征在于，1F、1R碱基序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种 sgRNA片段，其包含的gRNA特异性靶向于水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因的第五个外显子(SEQ IDNO.6)。该sgRNA片段具体包括T1(SEQ IDNO.6的第156～176位)、T2(SEQ IDNO.6第226～246位)、T3(SEQIDNO.6第516～536位)三个sgRNA片段。(2)包含本发明sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体可对水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因 (SEQ IDNO.7)进行基因编辑。(3)本发明sgRNA片段与CRISPR/Cas9 基因编辑载体应用于获得具有红褐色颖壳和茎结性状的水稻材料。(4) 本发明提供了用于检测CRISPR/Cas9-CAD基因重组的引物组合。(5)本发明方法只需要诱导一个等位基因的突变便能获得红褐色颖壳和茎结性状水稻材料，无需获得纯合突变体，方法效率高。(6)本发明获得的突变体可通过杂交和自交分离SgRNA:Cas9:HPT转基因片段，一方面是去除该转基因片段从而获得无转基因成分的基因编辑突变体；另一方面可以将SgRNA:Cas9:HPT转基因片段导入新的水稻不育系或恢复系中，可继续对新的受体进行CAD基因的编辑，从而获得具有红褐色颖壳的新的不育系、恢复系。本发明应用于农业生产，可节约传统育种的人力和时间成本，提高提高杂交水稻制种的机械化水平，缩短育种周期。

附图说明

图1是基因编辑载体构建图。

图2转基因株系鉴定。

图3基因编辑位点举例(T2和T3分别是设计的两个sgRNA编辑位点，同图1a)。

图4是CAD基因编辑后表型(WT是日本晴，cad是CAD基因发生突变后的突变体)。

图5是水稻种子表型(WT是日本晴，cad是CAD基因突变后的突变体)。

图6是Crispr/Cas9基因编辑株系自交去除转基因成分分析图。

图7是回交转育改良恢复系分析图。

图8是水稻机械化制种褐色颖壳筛选技术线路图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。

实施例一

如图1a所示，本发明sgRNA片段设计。

基因材料：水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因，该基因全名为Oryza sativa(japonicacultivar-group)cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD)gene， GenBank:BK003969.1，见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/64519465。基因编码区碱基序列如SEQ ID NO.7。

选择水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因上的三个sgRNA靶向位点，参考http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR靶位点预测而设计，用 http://www.rgenome.net/cas-offinder/网址分析脱靶效应。最后选择了三个 sgRNA分别命名为T1、T2、T3(图1a)。T1、T2、T3的碱基序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示。

该三个sgRNA片段包含的gRNA均特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶 CAD基因的第五个外显子(SEQ IDNO.6)。T1是SEQ IDNO.6的第156～ 176位、T2是SEQ IDNO.6第226～246位、T3是SEQ IDNO.6第516～ 536位。

实施例二

如图1所示，构建包含本发明sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

将实施例一所得的三个sgRNA片段分别连入水稻OsU6a(SEQ ID NO.8中1～485位)、OsU6b(SEQ ID NO.13中1～371位)、OsU6c(SEQ ID NO.18中1～780位)三个启动子下游，后面分别紧跟Ploy-T终止子 (SEQ ID NO.8中505～628位、SEQ ID NO.13中391～515位、SEQ ID NO.18中800～923位)。具体操作以T1为例，先分别用含有T1序列的引物SEQ IDNO.10和SEQ IDNO.9的引物以及SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12进行第一轮PCR，获得两个PCR产物，然后再以这两个PCR 产物为模板，SEQ IDNO.9和SEQ IDNO.12为引物进行第二轮PCR，获得OsU6a::T1(SEQ ID NO.8)。同理可通过两轮PCR获得OsU6b::T2(SEQ ID NO.13)、OsU6c::T3(SEQ ID NO.18)。测序正确后获得表达框OsU6a::T1(SEQ ID NO.8)、OsU6b::T2(SEQ ID NO.13)、OsU6c::T3 (SEQ ID NO.18)。三个表达框两端都有末端两两配对的Bsa I酶切位点。

将所得表达框通过Bsa I酶连入质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(参见参考文件1)的Bsa I酶切位点上(SEQ ID NO.23中6471～6176位置和 7148～7152位置)，构成Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3表达盒，获得pYLCRISPR/Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3编辑基因的最终载体(图1)。质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中Cas9(SEQID NO.23中1973～6175位置)基因由玉米泛素启动子Ubiqutin(SEQ ID NO.23中1～1972位置)驱动。同一Bsa I酶切后产生的不同粘性末端见图1b。

参考文件1：Ma,X.,Zhang,Q.,Zhu,Q.,Liu,W.,Chen,Y.,Qiu,R.,Wang,B.,Yang,Z.,Li,H.,Lin,Y.,Xie,Y.,Shen,R.,Chen,S.,Wang,Z.,Chen,Y.,Guo,J.,Chen,L.,Zhao,X.,Dong,Z.and Liu,Y.G.(2015)A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant8,1274-1284.

实施例三

本发明CRISPR/Cas9基因编辑载体在特异针对水稻肉桂醇脱氢酶基因进行基因编辑的应用。

植物材料：水稻日本晴(Oryza.Sativa L.spp.japonica)

采用实施例二所得最终载体转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序，将测序正确的菌株扩繁，提取质粒转入到农杆菌菌株EHA105中，获得用于浸染的菌液。

以日本晴成熟种子为材料，种子用1‰升汞灭菌，无菌水洗五次后培养在MS培养基上，诱导愈伤组织。30℃光照培养两星期得水稻日本晴成熟胚愈伤组织。将愈伤组织切成2mm～3mm大小的颗粒，培养于新鲜的MS培养基上。

4天后，用EHA105菌液浸染水稻日本晴成熟胚愈伤组织颗粒，具体浸染操作方法参见参考文件2。

培养结束获得60株转基因株系。提取转基因株系基因组DNA，用引物1F(SEQ IDNO.4)、1R(SEQ ID NO.5)扩增包含sgRNA突变位点的序列(长580bp)，进行转基因株系鉴定。

从图2、图3可知，目的片段有缺失突变和***图标。将图2获得的含有突变位点的片段割胶测序，用DSDecodeM (http://skl.scau.edu.cn/home/)分析60个转基因株系的编辑情况，其中有一个株系没有发生编辑，其余均有不同程度的编辑(图3)。其中7号和55号为发生了约200bp缺失的纯合突变体。

鉴定结果显示，采用本发明CRISPR/Cas9基因编辑载体，能成功在水稻日本晴中对目的水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因进行编辑，该基因的编辑目标位点已发生了***或缺失突变。

图4是水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因编辑后表型(WT为日本晴， cad为CAD基因发生突变后的突变体)、图5是水稻种子表型(WT为日本晴，cad为CAD基因突变后的突变体)。图4、图5显示，发生基因编辑后，水稻日本晴的茎结和颖壳都为红褐色。该基因突变后的表型并不影响植株的正常生长和产量，因此可以在不影响其它性状的情况下，将该基因在其它不育系和恢复系中进行突变，从而在育种中加以利用。尤其可以在水稻机械制种中用颖壳颜色为筛选标记中应用。

参考文件2：Agrobacterium-mediated transformation of Japonicacv.Nipponbare callus tissue and recovery of transgenic rice plants. http://ptf.agron.iastate.edu/protocol/Rice.PDF

应用例一

图6是Crispr/Cas9基因编辑株系自交去除转基因成分分析图。分析表明，本发明获得的对目的基因完成编辑的重组水稻株系可通过自交筛选出不含有SgRNA:Cas9:HPT转基因片段的植株。

应用例二

图7是回交转育改良恢复系分析图。分析表明，可以将SgRNA:Cas9:HPT转基因片段导入新的材料中完成对新材料的目标基因水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因的编辑。

应用例三

本发明sgRNA片段、CRISPR/Cas9编辑载体应用于水稻机械制种，其与应用例一、二相同之处不再重复。

如图8所示，在水稻机械制种中，用该发明技术方案对保持系进行遗传转化，导入CRISPR/Cas9编辑载体，对保持系中目的基因水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因进行编辑；编辑完成后通过自交分离出纯合的cad 突变株，并且保留含有SgRNA:Cas9:HPT转基因片段株系；在与不育系杂交的过程中，使不育系中的水稻肉桂醇脱氢酶(CAD)基因发生编辑，并从中筛选出纯合的突变体，同时摒弃含有SgRNA:Cas9:HPT转基因片段的株系，从而使其获得红褐色颖壳性状，并且不含有转基因成分。

以此改良的不育系和恢复系混播制种，机械收割之后可以通过颖壳的颜色除去恢复系自交的种子，留下的都是杂交制种F1代。

目前水稻机械化制种面临的最大难点在于如何把不育系上结的杂种与一同用收割机收获的恢复系种子准确地分开。采用本发明方法可以为解决机械制种中的这一难题提供有效手段，大大提高机制制种效率和种子纯度。

序列表

SEQ ID NO.1：

gctgctgtgcgccgggctga

SEQ ID NO.2：

cgcggcggcgtcctggggct

SEQ ID NO.3：

gctgagcttcatctcgccca

SEQ ID NO.4：

5’-atccacctgcctaatctgaaag-3’

SEQ ID NO.5：

5’-agttgagcacctcctccgtct-3’

SEQ ID NO.6：

aatccacctgcctaatctgaaagttgtcacgtcttaaaaagattaaaatatttggttagtgagatggtaagaaactagtaaaaaaagtaatgaatttgtgtgcaggaagtttgtggtgaagatcccggcggggctagcgccggagcaggcggcgccgctgctgtgcgccgggctgacggtgtacagcccactgaagcacttcgggctgatgtcgccaggtctccgcggcggcgtcctggggctcggcggcgtggggcacatgggcgtgaaggtggccaagtcgatggggcaccacgtgacggtgatcagctcgtcggcgaggaagcgcggcgaggccatggacgacctgggcgccgacgcctacctcgtcagctccgacgcggcggcgatggcggccgccggcgactcgctggactacatcatcgacaccgtgccggtgcaccacccgctggagccgtacctggcgctgctgaagctggacgggaagctgatcctgatgggggtgatcaaccagccgctgagcttcatctcgcccatggtgatgctcggccggaaggccatcaccggcagcttcatcgggagcatggccgagacggaggaggtgctcaacttctgcgtcgacaaggggctcacctcccagatcgaggtcgtcaagatggactacgtcaaccaggccctcgagcgcctcgagcgcaacgacgtccgctaccgcttcgtcgtcgacgtcgccggcagcaacatcgacgacgccgacgcgccgcccgcctga

SEQ ID NO.7：

atgggcagcctcgccgccgagaagaccgtcaccgggtgggccgccagggacgcctccggccacctcaccccctacaactacaccctcaggaagactgggcctgaagatgtggtggtgaaggttttgtattgtggtatctgccatactgacatccaccaggccaagaaccaccttggtgcttccaagtaccccatggtccctggccatgaggtggtcggcgaggtggtggaggtcgggccggaggtgaccaagtacagcgccggcgacgtcgtcggcgtcggcgtcatcgtcggctgctgccgcgagtgccatccgtgcaaggccaatgtggagcagtactgcaacaagaggatttggtcctacaacgacgtctacaccgacggccggccaacccagggcggcttcgcctccgccatggtcgtcgaccagaagtttgtggtgaagatcccggcggggctagcgccggagcaggcggcgccgctgctgtgcgccgggctgacggtgtacagcccactgaagcacttcgggctgatgtcgccaggtctccgcggcggcgtcctggggctcggcggcgtggggcacatgggcgtgaaggtggccaagtcgatggggcaccacgtgacggtgatcagctcgtcggcgaggaagcgcggcgaggccatggacgacctgggcgccgacgcctacctcgtcagctccgacgcggcggcgatggcggccgccggcgactcgctggactacatcatcgacaccgtgccggtgcaccacccgctggagccgtacctggcgctgctgaagctggacgggaagctgatcctgatgggggtgatcaaccagccgctgagcttcatctcgcccatggtgatgctcggccggaaggccatcaccggcagcttcatcgggagcatggccgagacggaggaggtgctcaacttctgcgtcgacaaggggctcacctcccagatcgaggtcgtcaagatggactacgtcaaccaggccctcgagcgcctcgagcgcaacgacgtccgctaccgcttcgtcgtcgacgtcgccggcagcaacatcgacgacgccgacgcgccgcccgcctga

SEQ ID NO.8：

Ttcagaggtctctctcgaactggaatcggcagcaaaggattttttcctgtagttttcccacaaccattttttaccatccgaatgataggataggaaaaatatccaagtgaacagtattcctataaaattcccgtaaaaagcctgcaatccgaatgagccctgaagtctgaactagccggtcacctgtacaggctatcgagatgccatacaagagacggtagtaggaactaggaagacgatggttgattcgtcaggcgaaatcgtcgtcctgcagtcgcatctatgggcctggacggaataggggaaaaagttggccggataggagggaaaggcccaggtgcttacgtgcgaggtaggcctgggctctcagcacttcgattcgttggcaccggggtaggatgcaatagagagcaacgtttagtaccacctcgcttagctagagcaaactggactgccttatatgcgcgggtgctggcttggctgccgctgctgtgcgccgggctgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggatggtgtgttgcgagacccacgct

SEQ ID NO.9：

5’gcgcggtctctctcgaactggaatcggcagcaaagga 3’

SEQ ID NO.10：

5’tcagcccggcgcacagcagcgaccaatgttgctccctc3’

SEQ ID NO.11：

5’gctgctgtgcgccgggctgagttttagagctagaaatag 3’

SEQ ID NO.12：

5’gcgcggtctcgcaacacaccatccactccaagctc 3’

SEQ ID NO.13：

Ttcagaggtctctgttgaactggaatcggcagcaaaggatgcaagaacgaactaagccggacaaaaaaaaaaggagcacatatacaaaccggttttattcatgaatggtcacgatggatgatggggctcagacttgagctacgaggccgcaggcgagagaagcctagtgtgctctctgcttgtttgggccgtaacggaggatacggccgacgagcgtgtactaccgcgcgggatgccgctgggcgctgcgggggccgttggatggggatcggtgggtcgcgggagcgttgaggggagacaggtttagtaccacctcgcctaccgaacaatgaagaacccaccttataaccccgcgcgctgccgcttgtgttggcggcgtcctggggctcgggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggatggtgttcagcgagacccacgct

SEQ ID NO.14：

5’gcgcggtctctgttgaactggaatcggcagcaaagga 3’

SEQ ID NO.15：

5’ccgagccccaggacgccgccaacacaagcggcagcgc 3’

SEQ ID NO.16：

5’ggcggcgtcctggggctcgggttttagagctagaaatag3’

SEQ ID NO.17：

5’gcgcggtctcgctgaacaccatccactccaagctc 3’

SEQ ID NO.18：

ttcagaggtctcttcagaactggaatcggcagcaaaggactcattagcggtatgcatgttggtagaagtcggagatgtaaataattttcattatataaaaaaggtacttcgagaaaaataaatgcatacgaattaattctttttatgttttttaa accaagtatatagaatttattgatggttaaaatttcaaaaatatgacgagagaaaggttaaacgtacggcatatac ttctgaacagagagggaatatggggtttttgttgctcccaacaattcttaagcacgtaaaggaaaaaagcacatt atccacattgtacttccagagatatgtacagcattacgtaggtacgttttctttttcttcccggagagatgatacaat aatcatgtaaacccagaatttaaaaaatattctttactataaaaattttaattagggaacgtattattttttacatgaca ccttttgagaaagagggacttgtaatatgggacaaatgaacaatttctaagaaatgggcatatgactctcagtac aatggaccaaattccctccagtcggcccagcaatacaaagggaaagaaatgagggggcccacaggccacg gcccacttttctccgtggtggggagatccagctagaggtccggcccacaagtggcccttgccccgtgggacggtgggattgcagagcgcgtgggcggaaacaacagtttagtaccacctcgctcacgcaacgacgcgaccacttgcttataagctgctgcgctgaggctcagctgagcttcatctcgcccagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggatggtgtcggtcgagacccacgct

SEQ ID NO.19：

5’gcgcggtctcttcagaactggaatcggcagcaaagga 3’

SEQ ID NO.20：

5’tgggcgacctcagctgagcctcagcgcagcag 3’

SEQ ID NO.21：

5’gctgagcttcatctcgcccagttttagagctagaaatag 3’

SEQ ID NO.22：

5’gcgcggtctcgaccgacaccatccactccaagctc 3’

SEQ ID NO.23：

gcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagt actacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtatttt gacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataata cttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttat tctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaa ataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagta gataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgt cgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccac cgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcag gcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcct cgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacaca cacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccc cccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgtt agatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgat tgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatg attttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcat cttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgttt caaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgat ggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgtt cgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaact acctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaa tatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattc atatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatga 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ctctccaaggatacctacgacgatgatctcgacaacctcctcgctcagattggagatcagtacgctgatctcttc cttgctgctaagaacctctccgatgctatcctcctttcggatatccttagggttaacactgagatcactaaggctcc tctttctgcttccatgatcaagcgctacgacgagcaccaccaggacctcaccctcctcaaggctcttgttcgtca gcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggttacattgacggt ggagctagccaggaggagttctacaagttcatcaagccaatccttgagaagatggatggtactgaggagcttc tcgttaagcttaaccgtgaggacctccttaggaagcagaggactttcgataacggctctatccctcaccagatc caccttggtgagcttcacgccatccttcgtaggcaggaggacttctaccctttcctcaaggacaaccgtgagaagatcgagaagatccttactttccgtattccttactacgttggtcctcttgctcgtggtaactcccgtttcgcttggat gactaggaagtccgaggagactatcaccccttggaacttcgaggaggttgttgacaagggtgcttccgcccagtccttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctccccaacgagaaggtcctccccaagcactccctcctctacgagtacttcacggtctacaacgagctcaccaaggtcaagtacgtcaccgagggtatgcgcaagcctgccttcctctccggcgagcagaagaaggctatcgttgacctcctcttcaagaccaaccgcaaggtcaccgtcaagcagctcaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgactccgtcgagatcagcggcgttgaggaccgtttcaacgcttctctcggtacctaccacgatctcctcaagatcatcaaggacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtcctcactcttactctcttcgaggatagggagatgatcgaggagaggctcaagacttacgctcatctcttcgatgacaaggttatgaagcagctcaagcgtcgccgttacaccggttggggtaggctctcccgcaagctcatcaacggtatcagggataagcagagcggcaagactatcctcgacttcctcaagtctgatggtttcgctaacaggaacttcatgcagctcatccacgatgactctcttaccttcaaggaggatattcagaaggctcaggtgtccggtcagggcgactctctccacgagcacattgctaaccttgctggttcccctgctatcaagaagggcatccttcagactgttaaggttgtcgatgagcttgtcaaggttatgggtcgtcacaagcctgagaacatcgtcatcgagatggctcgtgagaaccagactacccagaagggtcagaagaactcgagggagcgcatgaagaggattgaggagggtatcaaggagcttggttctcagatccttaaggagcaccctgtcgagaacacccagctccagaacgagaagctctacctctactacctccagaacggtagggatatgtacgttgaccaggagctcgacatcaacaggctttctgactacgacgtcgaccacattgttcctcagtctttccttaaggatgactccatcgacaacaaggtcctcacgaggtccgacaagaacaggggtaagtcggacaacgtcccttccgaggaggttgtcaagaagatgaagaactactggaggcagcttctcaacgctaagctcattacccagaggaagttcgacaacctcacgaaggctgagaggggtggcctttccgagcttgacaaggctggtttcatcaagaggcagcttgttgagacgaggcagattaccaagcacgttgctcagatcctcgattctaggatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctcatccgcgaggtcaaggtgatcaccctcaagtccaagctcgtctccgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtccgcgagatcaacaactaccaccacgctcacgatgcttaccttaacgctgtcgttggtaccgctcttatcaagaagtaccctaagcttgagtccgagttcgtctacggtgactacaaggtctacgacgttcgtaagatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctcgccaacggcgagatccgcaagcgccctcttatcgagacgaacggtgagactggtgagatcgtttgggacaagggtcgcgacttcgctactgttcgcaaggtcctttctatgcctcaggttaacatcgtcaagaagaccgaggtccagaccggtggcttctccaaggagtctatccttccaaagagaaactcggacaagctcatcgctaggaagaaggattgggaccctaagaagtacggtggtttcgactcccctactgtcgcctactccgtcctcgtggtcgccaaggtggagaagggtaagtcgaagaagctcaagtccgtcaaggagctcctcggcatcaccatcatggagcgctcctccttcgagaagaacccgatcgacttcctcgaggccaagggctacaaggaggtcaagaaggacctcatcatcaagctccccaagtactctcttttcgagctcgagaacggtcgtaagaggatgctggcttccgctggtgagctccagaagggtaacgagcttgctcttccttccaagtacgtgaacttcctctacctcgcctcccactacgagaagctcaagggttcccctgaggataacgagcagaagcagctcttcgtggagcagcacaagcactacctcgacgagatcatcgagcagatctccgagttctccaagcgcgtcatcctcgctgacgctaacctcgacaaggtcctctccgcctacaacaagcaccgcgacaagcccatccgcgagcaggccgagaacatcatccacctcttcacgctcacgaacctcggcgcccctgctgctttcaagtacttcgacaccaccatcgacaggaagcgttacacgtccaccaaggaggttctcgacgctactctcatccaccagtccatcaccggtctttacgagactcgtatcgacctttcccagcttggtggtgataagcgtcctgctgccaccaaaaaggccggacaggctaagaaaaagaagtaggatcctcccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacg 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序列表

<110> 四川省农业科学院生物技术核技术研究所

<120> 与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用

<130> 20170816

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> “人工序列”()

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gctgctgtgc gccgggctga 20

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<212> DNA

<213> “人工序列”()

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<212> DNA

<213> “人工序列”()

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<212> DNA

<213> “人工序列”()

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atccacctgc ctaatctgaa ag 22

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<212> DNA

<213> “人工序列”()

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agttgagcac ctcctccgtc t 21

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<212> DNA

<213> Oryza sativa (japonica cultivar-group)

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gagatggtaa gaaactagta aaaaaagtaa tgaatttgtg tgcaggaagt ttgtggtgaa 120

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<212> DNA

<213> Oryza sativa (japonica cultivar-group)

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<212> DNA

<213> Oryza sativa

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ttcagctctc caaggatacc tacgacgatg atctcgacaa cctcctcgct cagattggag 2880

atcagtacgc tgatctcttc cttgctgcta agaacctctc cgatgctatc ctcctttcgg 2940

atatccttag ggttaacact gagatcacta aggctcctct ttctgcttcc atgatcaagc 3000

gctacgacga gcaccaccag gacctcaccc tcctcaaggc tcttgttcgt cagcagctcc 3060

ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc ggttacattg 3120

acggtggagc tagccaggag gagttctaca agttcatcaa gccaatcctt gagaagatgg 3180

atggtactga ggagcttctc gttaagctta accgtgagga cctccttagg aagcagagga 3240

ctttcgataa cggctctatc cctcaccaga tccaccttgg tgagcttcac gccatccttc 3300

gtaggcagga ggacttctac cctttcctca aggacaaccg tgagaagatc gagaagatcc 3360

ttactttccg tattccttac tacgttggtc ctcttgctcg tggtaactcc cgtttcgctt 3420

ggatgactag gaagtccgag gagactatca ccccttggaa cttcgaggag gttgttgaca 3480

agggtgcttc cgcccagtcc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag aacctcccca 3540

acgagaaggt cctccccaag cactccctcc tctacgagta cttcacggtc tacaacgagc 3600

tcaccaaggt caagtacgtc accgagggta tgcgcaagcc tgccttcctc tccggcgagc 3660

agaagaaggc tatcgttgac ctcctcttca agaccaaccg caaggtcacc gtcaagcagc 3720

tcaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgactc cgtcgagatc agcggcgttg 3780

aggaccgttt caacgcttct ctcggtacct accacgatct cctcaagatc atcaaggaca 3840

aggacttcct cgacaacgag gagaacgagg acatcctcga ggacatcgtc ctcactctta 3900

ctctcttcga ggatagggag atgatcgagg agaggctcaa gacttacgct catctcttcg 3960

atgacaaggt tatgaagcag ctcaagcgtc gccgttacac cggttggggt aggctctccc 4020

gcaagctcat caacggtatc agggataagc agagcggcaa gactatcctc gacttcctca 4080

agtctgatgg tttcgctaac aggaacttca tgcagctcat ccacgatgac tctcttacct 4140

tcaaggagga tattcagaag gctcaggtgt ccggtcaggg cgactctctc cacgagcaca 4200

ttgctaacct tgctggttcc cctgctatca agaagggcat ccttcagact gttaaggttg 4260

tcgatgagct tgtcaaggtt atgggtcgtc acaagcctga gaacatcgtc atcgagatgg 4320

ctcgtgagaa ccagactacc cagaagggtc agaagaactc gagggagcgc atgaagagga 4380

ttgaggaggg tatcaaggag cttggttctc agatccttaa ggagcaccct gtcgagaaca 4440

cccagctcca gaacgagaag ctctacctct actacctcca gaacggtagg gatatgtacg 4500

ttgaccagga gctcgacatc aacaggcttt ctgactacga cgtcgaccac attgttcctc 4560

agtctttcct taaggatgac tccatcgaca acaaggtcct cacgaggtcc gacaagaaca 4620

ggggtaagtc ggacaacgtc ccttccgagg aggttgtcaa gaagatgaag aactactgga 4680

ggcagcttct caacgctaag ctcattaccc agaggaagtt cgacaacctc acgaaggctg 4740

agaggggtgg cctttccgag cttgacaagg ctggtttcat caagaggcag cttgttgaga 4800

cgaggcagat taccaagcac gttgctcaga tcctcgattc taggatgaac accaagtacg 4860

acgagaacga caagctcatc cgcgaggtca aggtgatcac cctcaagtcc aagctcgtct 4920

ccgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtccgcga gatcaacaac taccaccacg 4980

ctcacgatgc ttaccttaac gctgtcgttg gtaccgctct tatcaagaag taccctaagc 5040

ttgagtccga gttcgtctac ggtgactaca aggtctacga cgttcgtaag atgatcgcca 5100

agtccgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctactcc aacatcatga 5160

acttcttcaa gaccgagatc accctcgcca acggcgagat ccgcaagcgc cctcttatcg 5220

agacgaacgg tgagactggt gagatcgttt gggacaaggg tcgcgacttc gctactgttc 5280

gcaaggtcct ttctatgcct caggttaaca tcgtcaagaa gaccgaggtc cagaccggtg 5340

gcttctccaa ggagtctatc cttccaaaga gaaactcgga caagctcatc gctaggaaga 5400

aggattggga ccctaagaag tacggtggtt tcgactcccc tactgtcgcc tactccgtcc 5460

tcgtggtcgc caaggtggag aagggtaagt cgaagaagct caagtccgtc aaggagctcc 5520

tcggcatcac catcatggag cgctcctcct tcgagaagaa cccgatcgac ttcctcgagg 5580

ccaagggcta caaggaggtc aagaaggacc tcatcatcaa gctccccaag tactctcttt 5640

tcgagctcga gaacggtcgt aagaggatgc tggcttccgc tggtgagctc cagaagggta 5700

acgagcttgc tcttccttcc aagtacgtga acttcctcta cctcgcctcc cactacgaga 5760

agctcaaggg ttcccctgag gataacgagc agaagcagct cttcgtggag cagcacaagc 5820

actacctcga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgcgtc atcctcgctg 5880

acgctaacct cgacaaggtc ctctccgcct acaacaagca ccgcgacaag cccatccgcg 5940

agcaggccga gaacatcatc cacctcttca cgctcacgaa cctcggcgcc cctgctgctt 6000

tcaagtactt cgacaccacc atcgacagga agcgttacac gtccaccaag gaggttctcg 6060

acgctactct catccaccag tccatcaccg gtctttacga gactcgtatc gacctttccc 6120

agcttggtgg tgataagcgt cctgctgcca ccaaaaaggc cggacaggct aagaaaaaga 6180

agtaggatcc tcccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg 6240

ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa 6300

ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga ggtgggtttt tatgattaga gtcccgcaat 6360

tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc 6420

gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg agcaccggta aggcgcgccg tagtgctcga 6480

gagacctctg aagtggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 6540

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 6600

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 6660

cacaagaaac agctatgacc atgattacgc caagctattt aggtgacact atagaatact 6720

caagctatgc atcaagctca atgggtctag tctgtagata cccatcacac tggcgaccgc 6780

tcgaacatca gtttaaggtt tacacctata aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg 6840

atgtacagag tgatattatt gacacgccgg ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg 6900

cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg 6960

aaagctggcg catgatgacc accgatatgg ccagtgtgcc tgtctccgtt atcggggaag 7020

aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct 7080

ggggaatata aatgtcaggc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 7140

cgcggcgggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgg 7176

Claims

1.sgRNA片段，其特征在于：包含特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因的第五个外显子的gRNA。

2.根据权利要求1所述的sgRNA片段，其特征在于：包括命名为T1、碱基序列如SEQ IDNO.1的sgRNA，命名为T2、碱基序列如SEQ ID NO.2的sgRNA，命名为T3、碱基序列如SEQ IDNO.3的sgRNA。

3.包含权利要求2所述的sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：包括由OsU6a启动子调控T1 sgRNA片段表达的表达框OsU6a::T1、由OsU6b启动子调控T2 sgRNA片段表达的表达框OsU6b::T2、由OsU6c启动子调控T3 sgRNA片段表达的表达框OsU6c::T3、由玉米泛素Ubiqutin启动子调控Cas9表达的表达框。

5.权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，其特征在于：将分别连接OsU6a、OsU6b、OsU6c启动子与Ploy-T终止子的T1、T2、T3通过Bsa I酶连入pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H质粒，构建得到Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3表达盒，获得pYLCRISPR/Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3编辑基因的最终载体。

6.权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在特异针对水稻肉桂醇脱氢酶基因进行基因编辑的应用。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于：将构建好的载体转入农杆菌EHA105用于农杆菌介导的水稻日本晴愈伤组织遗传转化，并将愈伤组织诱导培养获得再生植株。

8.权利要求1或2所述的sgRNA片段、权利要求4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在制备红褐色颖壳性状水稻材料中的应用；所述红褐色颖壳性状水稻材料含有或者不含有SgRNA:Cas9:HPT转基因片段。

9.权利要求1或2所述的sgRNA片段、权利要求4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在水稻机械制种中的应用。

10.用于检测CRISPR/Cas9-CAD基因重组的引物组合1F、1R，其特征在于，1F、1R碱基序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。