CN103969366B - 一种毛蚶的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种毛蚶蛋白多肽及多糖的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中是毛蚶，再测定毛蚶多肽和多糖的含量。毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范围内效果更好。使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。
Description
技术领域
本发明涉及药品检测方法，具体涉及一种毛蚶的含量测定方法，属药品技术领域。
背景技术
毛蚶肉含丰富的蛋白质、维生素及人体所必需的氨基酸，自古就有着食用、药用价值，《医林纂要》注“蚶肉补心血、散瘀血、除烦醒酒、破结消痰”，《日华子本草》注“蚶肉益血色”。近年来，研究报道显示毛蚶有抗肿瘤作用，具有清除体内自由基、提高机体免疫力的功效。毛蚶肉制剂对肺癌、肾癌、胃癌、肝癌等多种癌症具有较好的治疗作用，且安全性良好。
根据文献报道毛蚶多肽和多糖是毛蚶的主要生物活性成分，具有保肝、抗肿瘤、调节免疫的功效。暨南大学博士生导师于荣敏教授2011年1月5日报道，新鲜毛蚶去壳，经匀浆、离心、透析、冻干后制得毛蚶多肽提取物，法测定对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及对小鼠 NK 细胞杀伤活性的影响；对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响；小鼠脾淋巴细胞周期的变化；对主要细胞因子 IFN-γ和 IL-4分泌水平的影响。结果毛蚶多肽提取物能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红活性和小鼠 NK 细胞杀伤活性；促进脾淋巴细胞 G0/G1 期向 DNA 合成期(s期) 转化；协同 Con A 作用，能够增加 IFN-γ的分泌，并且能够抑制 IL-4 的分泌。中国药科大学窦昌贵等报道，用毛蚶肉水解液小鼠灌胃，结果：对四氯化碳、硫代乙胺和强的松龙引起的血清谷丙转氨酶活性升高均有明显的降低作用，表明毛蚶水解液对实验性肝损伤有显著的保护作用。
我们试验发现毛蚶多肽可明显抑制乙肝表面抗原和E抗原的表达，并对乙肝DNA有抑制作用。
蛋白质和多糖是生命活动的基本物质，所有动植物生命体都含有这两种基本物质，在无法确定来源的情况下，就不能保证药品的有效性，不能准确测定蛋白质和多糖的含量，就无法在生产和使用中保证产品质量，进而药品疗效得不到保证。
现有文献还没有毛蚶多肽和多糖专属性和含量测定的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种毛蚶多肽和多糖的含量测定方法，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量。
一种毛蚶的含量测定方法，其特征在于先通过凝胶色谱柱高效液相色谱法鉴别样品中的多肽和多糖,如果两项专属性都满足,则确定是毛蚶，再测定毛蚶中多肽和多糖的含量，具体步骤如下：
（1） 毛蚶多肽鉴别：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm；柱温：25℃；流速0.4ml/min；检测波长280nm；理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000；
称取样品10g，加12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60%（w/v）加入硫酸铵，0～4℃放置过夜，离心，取沉淀，加水10ml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，0～4℃条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，0～4℃保存，即得毛蚶多肽溶液；
取毛蚶多肽溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；图谱中如果在保留时间15.6min±5%之内有毛蚶多肽的特征峰，其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性，则继续进行以下操作，如无则判为伪品；
(2) 毛蚶多糖鉴别：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.1mol/L的硫酸钠溶液为流动相；示差折光检测器；柱温：40℃；流速：0.5ml /min；理论板数按葡萄糖峰计算应不低于5000。
称取含毛蚶提取物约2g的样品，加15倍的石油醚：乙醇=1：1的溶液，于40℃水浴保温3hr，超声提取30min，脱脂棉过滤，取滤渣，挥干；加去离子水20ml，用氢氧化钠溶液调pH至7.5～8，80℃水浴3hr，时时搅拌，过滤，滤液另器保存，滤渣加去离子水20ml，继续水浴2hr，时时搅拌，过滤，滤液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心，沉淀加去离子水20ml ，80℃水浴2hr，离心，取上清液；加1/4体积的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，剧烈振摇，离心，取上层液体，重复操作多次，至液面中间蛋白层完全消失，取上层液体，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心离心，取沉淀，80℃以下减压干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流动相使溶解，制成每1ml含10mg的溶液，即得。
取毛蚶多糖供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定记录图谱；图谱中如果以图谱中的S峰为参照，呈现2个特征峰，且以S峰为1，2个特征峰的相对保留时间在峰1为0.56±10%、峰2为0.68±10%，其重均分子量（Mw）在6.88～9.47×105之间，满足毛蚶多糖专属性。
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶，则继续进行以下操作，如无则判为伪品；
（3）毛蚶多肽含量测定：称取样品0.5-2g，加20-40倍水，超声使分散均匀，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混匀，静置20-50分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量；我们经过反复试验发现，制剂中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g。
（4）毛蚶多糖含量测定：称取含毛蚶提取物约1-4g样品，精密称定，置圆底烧瓶中，加30-50倍水，加热回流1-3小时，用脱脂棉滤过，滤液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1-5ml，加5-10倍乙醇，搅拌，离心5-20分钟，沉淀加水溶解，置20-50量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1-5ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸5-10ml，摇匀，于30-50℃水浴中保温20-60分钟，取出，置冰水浴中2-10分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品。取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量(mg)，计算含量。 我们经过反复试验发现，制剂中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖(C6H12O6)计，不得少于24mg。
毛蚶提取物经真空干燥后的样品蛋白质和多糖含量分别为60%和13%，其中蛋白质含量约是多糖含量的5倍，在毛蚶有效成分研究时，我们发现，小分子量的多肽和多糖为抗肿瘤的主要成分，而大分子量的蛋白生物活性低，药理效果较差。在对毛蚶提取物的研究中，我们经过多次试验发现，毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范围内效果更好。
本发明的方法测定毛蚶中多肽的含量不仅专属性强，而且提供了毛蚶多肽和多糖的比例，能够保证用毛蚶制备的药品有效和质量可控。
为了便于理解本发明，特通过下面试验例进一步说明：
一、两批毛蚶提取物片剂样品含量测定
（1）毛蚶多肽鉴别：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm；柱温：25℃；流速0.4ml/min；检测波长280nm；理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000；
分别称取样品10g，加12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60%（w/v）加入硫酸铵，0～4℃放置过夜，离心，取沉淀，加水10ml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，0～4℃条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，0～4℃保存，即得毛蚶多肽溶液；
分别取毛蚶多肽溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；A样品特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.58、峰2相对保留时间为0.69，其分子量为688036，B样品特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.55、峰2相对保留时间为0.63。其分子量为784503。结果显示两批毛蚶提取物片剂均满足毛蚶多糖专属性，继续进行以下操作。
(2)毛蚶多糖鉴别：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.1mol/L的硫酸钠溶液为流动相；示差折光检测器；柱温：40℃；流速：0.5ml /min；理论板数按葡萄糖峰计算应不低于5000。
分别称取含毛蚶提取物2g的样品，加15倍的石油醚：乙醇=1：1的溶液，于40℃水浴保温3hr，超声提取30min，脱脂棉过滤，取滤渣，挥干；加去离子水20ml，用氢氧化钠溶液调pH至7.5～8，80℃水浴3hr，时时搅拌，过滤，滤液另器保存，滤渣加去离子水20ml，继续水浴2hr，时时搅拌，过滤，滤液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心，沉淀加去离子水20ml ，80℃水浴2hr，离心，取上清液；加1/4体积的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，剧烈振摇，离心，取上层液体，重复操作多次，至液面中间蛋白层完全消失，取上层液体，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心离心，取沉淀，80℃以下减压干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流动相使溶解，制成每1ml含10mg的溶液，即得。
分别取毛蚶多糖供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定记录图谱；毛蚶提取物制剂片剂A样品图谱中在保留时间15.537min有一尖锐的特征峰，其分子量为88070；毛蚶提取物制剂片剂B样品特征图谱中在保留时间15.698min有一尖锐的特征峰，其分子量为88070。结果显示两批毛蚶提取物颗粒剂满足毛蚶多肽专属性。
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定；
（3）毛蚶多肽含量测定：分别称取样品各1.0g，精密称定，加30倍水，超声使分散均匀，加12%三氯乙酸30ml，混匀，静置30分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量，计算得：制剂A样品中每g毛蚶多肽0.45g；制剂B样品中每g毛蚶多肽0.15g。
（4）毛蚶多糖含量测定：分别称取含毛蚶提取物2.5g样品，精密称定，置圆底烧瓶中，加40倍水，加热回流2小时，用脱脂棉滤过，滤液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2ml，加9倍乙醇，搅拌，离心10分钟，沉淀加水溶解，置50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸7ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰水浴中5分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品。取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量(mg)，计算得：制剂A样品中每g毛蚶提取物含多糖53mg。制剂B样品中每g毛蚶提取物含多糖28mg。
制剂A样品中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的5倍，制剂B样品中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的10倍。
二、两批毛蚶提取物片剂药效比较
试验方法：选取健康小鼠10只，接种肺癌细胞株（2*105/只），接种14d后，无菌条件下剥离肿瘤，用组织匀浆器制成细胞悬液。将健康小鼠30只，随机分为3组，各组均尾静脉接受上述制备的细胞悬液0.2ml（含细胞数1*105/只）。分别给予制剂A、B 0.25g/kg静脉注射，空白对照组注射等量生理盐水。各组均每日一次，连续10天。
观察项目：停药后观察各组体重质量变化，生存天数，按以下公式计算生存延长率LS=[（用药组生存天数/对照组生存天数）]-1*100%。处死动物称肺重，计算肺重指数。肺重指数=小鼠肺重（mg）/体重量（10g）之比*100%。
结果见表：
制剂A、B在生存天数、生存延长率、肺重指数方面均优于空白对照组，制剂A疗效优于制剂B，表明毛蚶提取物片剂中毛蚶多肽和多糖含量在一定比例内疗效更好。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
取鲜毛蚶肉，破碎，过40目筛，加入1倍量水，在10℃以下搅拌提取4小时，提取液过滤，离心。取上述离心液冻干，得毛蚶提取物。
毛蚶提取物特征图谱中在保留时间15.564min有一尖锐的特征峰“峰S”。 其分子量为88070。满足毛蚶多肽专属性，继续进行以下操作；
毛蚶提取物特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.57、峰2相对保留时间为0.68，其分子量为696214，满足毛蚶多糖专属性。
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定；
取毛蚶提取物研细，精密称取2.012g，加30倍水，超声使分散均匀，加10%三氯乙酸45ml，混匀，静置45分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，即得供试品。将供试品照氮测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ L第一法）测定，毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.46g。
称取含毛蚶提取物2.601g，置圆底烧瓶中，加42倍水，加热回流2小时，用脱脂棉滤过，滤液移至50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2ml，加10倍乙醇，搅拌，离心10分钟，沉淀加水溶解，置50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸8ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰水浴中5分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品。取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量(mg)，计算得毛蚶提取物每g含多糖72mg。
制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的6.39倍。
实施例2
取干毛蚶肉，粉碎，过80目筛，加10倍量的水，加热提取2次，每次1小时，合并提取液，过滤，取滤液，浓缩至相对密度为1.04～1.06（60℃）时，离心（2000转/分）。取上述离心液80℃以下，减压干燥，粉碎，得毛蚶提取物。将提取物制备成片剂。
取片剂进行毛蚶多肽鉴别，特征图谱中在保留时间15.239min有一尖锐的特征峰“峰S”。 其分子量为88070。满足毛蚶多肽专属性，继续进行以下操作；
取片剂进行毛蚶多糖鉴别，特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.59、峰2相对保留时间为0.73，其分子量为725444，满足毛蚶多糖专属性。
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定；
取毛蚶提取物制备的片剂研细，精密称取1.512g，含毛蚶提取物1.218g，加21倍水，超声使分散均匀，加19%三氯乙酸30ml，混匀，静置33分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，即得供试品。将供试品照氮测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ L第一法）测定，毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.23g。
取毛蚶提取物制备的片剂研细，精密称取3.532g，含毛蚶提取物2.826g，置圆底烧瓶中，加39倍水，加热回流1小时，用脱脂棉滤过，滤液移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，加6倍乙醇，搅拌，离心10分钟，沉淀加水溶解，置20ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸5ml，摇匀，于40℃水浴中保温39分钟，取出，置冰水浴中50分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品。取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量(mg)，计算得毛蚶提取物每g含毛蚶多糖42mg。
制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的5.18倍。
实施例3
按照实施例2中的毛蚶提取物制备方法制备毛蚶提取物，将提取物制成胶囊剂。
取胶囊内容物进行毛蚶多肽鉴别，结果显示毛蚶提取物特征图谱中在保留时间15.933min有一尖锐的特征峰“峰S”， 其分子量为88070。满足毛蚶多肽专属性，继续进行以下操作；
取胶囊内容物进行毛蚶多肽鉴别，特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.53、峰2相对保留时间为0.63，其分子量为786213，满足毛蚶多糖专属性。
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定；
取胶囊内容物进行含量测定毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.35g。每g含毛蚶多糖65mg。
制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的5.38倍。
实施例4
按照实施例2中的毛蚶提取物制备方法指标毛蚶提取物，将提取物制备成颗粒剂。
取颗粒剂进行毛蚶多肽鉴别，具体步骤如下：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm；柱温：25℃；流速：0.4ml/min。理论板数按蛋白质分子量100000计算为8000。
毛蚶提取物溶液的制备 取胶囊内容物研细，称取10g，加12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60%（w/v）加入硫酸铵，0～4℃放置过夜，离心，取沉淀，加水10ml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，0～4℃条件下充分透析（用1％的BaCl2溶液检查硫酸根离子是否透析完全），将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，0～4℃保存，即得毛蚶毛蚶多肽供试品。
取毛蚶蛋白质（多肽）试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定。
特征图谱中在保留时间15.623min有一尖锐的特征峰“峰S”。其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性，继续进行以下操作；
取颗粒剂进行毛蚶多糖鉴别，具体步骤如下：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.1mol/L的硫酸钠溶液为流动相；示差折光检测器；柱温：40℃；流速：0.5ml /min；理论板数按葡萄糖峰计算应不低于5000。
称取含毛蚶提取物颗粒2g，分别加15倍的石油醚：乙醇=1：1的溶液，于40℃水浴保温3hr，超声提取30min，脱脂棉过滤，取滤渣，挥干；加去离子水20ml，用氢氧化钠溶液调pH至7.5～8，80℃水浴3hr，时时搅拌，过滤，滤液另器保存，滤渣加去离子水20ml，继续水浴2hr，时时搅拌，过滤，滤液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心，沉淀加去离子水20ml，80℃水浴2hr，离心，取上清液；加1/4体积的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，剧烈振摇，离心，取上层液体，重复操作多次，至液面中间蛋白层完全消失，取上层液体，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心离心，取沉淀，80℃以下减压干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流动相使溶解，制成每1ml含10mg的溶液，即得。
取毛蚶多糖供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定记录图谱；图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.61、峰2相对保留时间为0.72，其分子量为844021。满足毛蚶多糖专属性。
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定。
取颗粒剂进行含量测定毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.63g。每g含毛蚶多糖102mg。
制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的6.18倍。
实施例5
分别取不同产地的毛蚶，按实施例2的方法制备3批毛蚶提取物丸剂，分别抽取三批的样品A、样品B和样品C，进行鉴别和含量测定。3批测定结果为：
样品A毛蚶多肽鉴别特征图谱中在保留时间15.652min有一尖锐的特征峰“峰S”， 其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性。毛蚶多肽鉴别特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.54、峰2相对保留时间为0.66，其分子量为798745，满足毛蚶多糖专属性。同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定。含量测定毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.66g。每g含毛蚶多糖99mg。制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的6.67倍。
样品B毛蚶多肽鉴别特征图谱中在保留时间15.231min有一尖锐的特征峰“峰S”， 其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性。毛蚶多肽鉴别特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.56、峰2相对保留时间为0.69，其分子量为801214，满足毛蚶多糖专属性。同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定。取颗粒剂进行含量测定毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.53g。每g含毛蚶多糖102mg。制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的5.20倍。
样品C毛蚶多肽鉴别特征图谱中在保留时间15.762min有一尖锐的特征峰“峰S”， 其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性。毛蚶多肽鉴别特征图谱中呈现2个特征峰，以图谱中的S峰为1，峰1相对保留时间为0.53、峰2相对保留时间为0.65，其分子量为754102，满足毛蚶多糖专属性。同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶制得，继续进行含量测定。取颗粒剂进行含量测定毛蚶提取物每g含毛蚶多肽0.32g。每g含毛蚶多糖59mg。制剂中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的5.42倍。
Claims (6)
1.一种毛蚶的含量测定方法，先通过凝胶色谱柱高效液相色谱法鉴别样品中的多肽和多糖,如果两项专属性都满足,则确定是毛蚶，再测定毛蚶中多肽和多糖的含量，其特征在于：其中毛蚶多肽的鉴别方法使用凝胶色谱柱高效液相色谱法，具体步骤如下：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm；柱温：25℃；流速0.4ml/min；检测波长280nm；理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000；
称取样品10g，加12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60%，w/v，加入硫酸铵，0～4℃放置过夜，离心，取沉淀，加水10ml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，0～4℃条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，0～4℃保存，即得毛蚶多肽溶液；
取毛蚶多肽溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；图谱中如果在保留时间15.6min±5%之内有毛蚶多肽的特征峰，其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性，如无则判为伪品。
2.根据权利要求1所述的毛蚶的含量测定方法，其特征在于其中毛蚶多糖的鉴别方法使用凝胶色谱柱高效液相色谱法，具体步骤如下：
色谱条件及***适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.1mol/L的硫酸钠溶液为流动相；示差折光检测器；柱温：40℃；流速：0.5ml /min；理论板数按葡萄糖峰计算应不低于5000；
称取含毛蚶提取物约2g的样品，加15倍的石油醚：乙醇=1：1的溶液，于40℃水浴保温3hr，超声提取30min，脱脂棉过滤，取滤渣，挥干；加去离子水20ml，用氢氧化钠溶液调pH至7.5～8，80℃水浴3hr，时时搅拌，过滤，滤液另器保存，滤渣加去离子水20ml，继续水浴2hr，时时搅拌，过滤，滤液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心，沉淀加去离子水20ml ，80℃水浴2hr，离心，取上清液；加1/4体积的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，剧烈振摇，离心，取上层液体，重复操作多次，至液面中间蛋白层完全消失，取上层液体，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心离心，取沉淀，80℃以下减压干燥，制得毛蚶多糖；取毛蚶多糖，加流动相使溶解，制成每1ml含10mg的溶液，即得；
取毛蚶多糖供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定记录图谱；图谱中如果以图谱中的S峰为参照，呈现2个特征峰，且以S峰为1，2个特征峰的相对保留时间在峰1为0.56±10%、峰2为0.68±10%，其重均分子量Mw在6.88×105～9.47×105之间，满足毛蚶多糖专属性；
同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶，如无则判为伪品。
3. 根据权利要求1所述的毛蚶的含量测定方法，其特征在于其中毛蚶多糖的含量测定方法使用定氮法，具体步骤如下：
称取样品0.5-2g，加20-40倍水，超声使分散均匀，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混匀，静置20-50分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量；制剂中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g。
4.根据权利要求1所述的毛蚶的含量测定方法，其特征在于其中毛蚶多肽的含量测定方法使用分光光度法，具体步骤如下：
称取含毛蚶提取物1-4g样品，精密称定，置圆底烧瓶中，加30-50倍水，加热回流1-3小时，用脱脂棉滤过，滤液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1-5ml，加5-10倍乙醇，搅拌，离心5-20分钟，沉淀加水溶解，置20-50量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1-5ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸5-10ml，摇匀，于30-50℃水浴中保温20-60分钟，取出，置冰水浴中2-10分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品；取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度；从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量mg，计算含量；制剂中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖C6H12O6计，不得少于24mg。
5. 根据权利要求1或权利要求3或权利要求4所述的毛蚶的含量测定方法，其特征在于毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍。
6.根据权利要求1或权利要求3或权利要求4所述的毛蚶的含量测定方法，其特征在于用于毛蚶提取物各种制剂的含量测定。
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