CN102342928A

CN102342928A - 牛蒡苷元的医药用途

Info

Publication number: CN102342928A
Application number: CN201010241038XA
Authority: CN
Inventors: 赵志全; 姚景春
Original assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2012-02-08

Abstract

本发明涉及中药牛蒡子提取物牛蒡苷元的医药用途，特别是牛蒡苷元在制备治疗癌症方面的用途，属于化合物的治疗活性领域。通过体外试验可以看出，牛蒡苷元可以诱导人源慢性髓性白血病细胞K562、人源急性早幼粒白血病细胞HL-60、人源胃癌细胞SGC7901和人源肺癌细胞A549的分化。

Description

牛蒡苷元的医药用途

技术领域

本发明涉及中药牛蒡子提取物牛蒡苷元的医药用途，特别是牛蒡苷元在制备治疗癌症方面的用途，属于化合物的治疗活性领域。

背景技术

癌症是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。癌症与心脑血管疾病和意外事故一起，构成当今世界所有国家三大死亡原因。因此，世界卫生组织和各国政府***门都把攻克癌症列为一项首要任务。世界上治疗癌症的方法主要有三种，一是采用手术切除法，切除病变组织，防止癌细胞扩散；二是采用化疗或放疗，以杀死癌细胞；三是用药物治疗。采用手术切除的方法增加了病人的痛苦，伤其元气，费用巨大。用化疗或放疗的方法，在杀死癌细胞的同时，也伤及红细胞和白细胞，病人苦不堪言。

白血病是严重危害人类生命健康的造血***恶性肿瘤，是一类起源于造血(或淋巴)干细胞的恶性疾病。由于干细胞受损，白血病细胞失去进一步分化成熟的能力，或者增值与分化能力不平衡，而停止在细胞发育的不同阶段，具体表现为细胞在体内无限增值，而其分化成熟和凋亡受阻。因此，白血病的治疗可从三个方面入手：诱导细胞凋亡、诱导细胞分化及干细胞移植重建造血功能。迄今白血病的治疗仍主要采用传统的联合化疗，但此疗法副作用甚大，复发率高，尤其对机体免疫与造血***有较大的损害。

牛蒡苷与牛蒡苷元均来源于牛蒡的干燥成熟果实牛蒡子，牛蒡苷活性很小，必须经过代谢转化为牛蒡苷元才能被人体吸收，而牛蒡苷元是可以被人体直接吸收的有效成分。目前，已有文献报道牛蒡苷元具有如下药理活性：1)抗炎及免疫调节作用；2)抗病毒作用，包括HIV-1与流感病毒；3)诱导肿瘤细胞凋亡的作用；4)肾病及糖尿病、糖尿病并发症治疗作用；5)热休克反应抑制作用；6)神经保护作用；7)扩张血管作用；8)血小板活化因子拮抗作用；9)抗老年性痴呆的作用；10)抑制K⁺挛缩的作用等。比如，Cho J Y，etal.Immunomodulatory effect of arctigenin，a lignan compound on tumor necrosisfactor-α and nitric oxide production，and lymphocyte proliferation[J].J PharmPharmcol.1999；51(11)：1267-1273.公开了牛蒡苷元具有抗炎及免疫调节作用；Gao Y，et al.Activity of in vitro anti-influenza virus of arctigenin[J].ChineseTraditional and Herbal Drugs(中草药).2002；33(8)：724-726.公开了牛蒡苷元具有抗病毒的作用；Kim S H，et al.Hepatoprotective dibenzylbutyrolactone lignans ofTorreya nucifera against CCl4-induced toxicity in primary cultured rathepatocytes[J].Biol Pharm Bull.2003；26(8)：1202-1205.公开了牛蒡苷元具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

发明内容

恶性肿瘤细胞在诱导分化剂作用下，可以向正常或接近正常的细胞方向分化逆转。癌细胞的诱导分化和分化治疗作为肿瘤治疗的一条新的途径，近年来研究非常活跃。体内外实验表明，在一些制剂诱导下，肿瘤细胞可发生分化，有的出现类似正常细胞的表型，有的恢复了正常细胞的某些功能，这是对“一旦成为癌细胞，永远是癌细胞”的传统观念提出的有力挑战，为抗肿瘤研究开辟了一条崭新的途径。

本发明的目的就是公开牛蒡苷元在制备癌细胞或白血病细胞分化的药物中的用途。形态学上的分化成熟是表明肿瘤细胞分化的标志。发明人通过大量的体外试验意外地发现，当癌细胞与牛蒡苷元共同培养后，可明显出现细胞形态向成熟方向转化，细胞表现出核固缩，核浆比降低，核仁减少等特征。这个意外的发现促使发明人将牛蒡苷元制备成癌细胞或白血病细胞分化的药物。

通过如下体外试验可以看出，牛蒡苷元可以诱导人源慢性髓性白血病细胞K562、人源急性早幼粒白血病细胞HL-60、人源胃癌细胞SGC7901和人源肺癌细胞A549分化。具体地，在牛蒡苷元诱导白血病细胞分化的试验中，无论是K562细胞，还是HL-60细胞，其与牛蒡苷元共同培养后，可出现细胞形态明显向成熟方向转化，细胞表现出体积减小，核染色质浓缩，核浆比降低，核仁减少等特征，分化抗原试验表明，K562细胞向粒系方向分化，HL-60向红系、粒系方向分化。在牛蒡苷元诱导人源胃癌细胞SGC7901分化的试验中，经牛蒡苷元处理后的SGC7901细胞由椭圆形转变成长圆形或近似菱形，细胞核浆比例下降等变化，细胞周期动力学发生改变，提示牛蒡苷元可诱导胃癌细胞出现一定程度的分化。在牛蒡苷元诱导人源肺癌细胞A549分化的试验中，牛蒡苷元抑制A549细胞在软琼脂中形成集落的能力。并抑制A549细胞的DNA合成和有丝***，使细胞发生G1/Go期阻滞，证明了牛蒡苷元对A549细胞具有诱导分化的作用。

一、牛蒡苷元诱导白血病细胞分化试验

试验分组和给药终浓度如下：

阴性对照组：赋形剂

牛蒡苷元A组：0.1μmol/L

牛蒡苷元B组：0.5μmol/L

牛蒡苷元C组：1.0μmol/L

取常规培养的处于对数生长期的人源慢性髓性白血病细胞K562、人源急性早幼粒白血病细胞HL-60，以2×10⁵/ml接种于24孔板中，和分化诱导剂牛蒡苷元共同培养，培养条件为RPMI 1640(含体积分数为10％的胎牛血清)，37℃，5％CO2，饱和湿度培养6天。此后收集细胞检测细胞形态的变化及其它分化指标的检测。取500μL新鲜配置含100g/mlTPA的0.1％NBT溶液，分别与牛蒡苷元处理后的细胞悬液混合，37℃孵育30min后，离心去上清，沉淀涂片。胞质含蓝灰色颗粒的细胞为阳性细胞，计数200个细胞，计算NBT阳性率。NBT阳性率＝(NBT阳性细胞数/细胞总数)×100％。取牛蒡苷元作用后的细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，加入PE标记的鼠抗人CDm单克隆抗体，混匀后室温孵育20min，加入500μL PBS溶液，流式细胞仪检测2×10⁵个细胞中的抗原表达。

(1)细胞形态变化

阴性对照组K562细胞体积大，核大而明显，核仁清楚，核质比例大，经牛蒡苷元处理6天后，K562细胞直径和体积有进一步变小的趋势，核质比减小，细胞向成熟方向分化较为明显。具体参见图1-4。

阴性对照组HL-60细胞体积大，外形不规则，且核大，染色质疏松细致，可见多个核仁。经牛蒡苷元处理后的HL-60细胞形态发生明显变化，细胞体积变小，核染色质浓缩，核质比例变小，核质呈灰蓝色，原始细胞减少。具体参见图5-8。

(2)NBT还原能力的测定。0.5μmol/L牛蒡苷元可显著增高两种白血病细胞的NBT还原能力，其中HL-60细胞的变化较为显著，NBT阳性细胞从对照组的42％升高至57％，而K562细胞NBT的阳性率为36％(对照21％)，P值均＜0.01，见图9。

(3)牛蒡苷元作用后细胞表面特异性分化抗原的变化。HL-60细胞与0.5μmol/L牛蒡苷元作用后，我们检测了细胞表面CD11b、CD13与CD14的表达，发现牛蒡苷元可诱导HL-60细胞向成熟粒、单细胞分化，细胞表面分化抗原CD11b、CD13与CD14明显高于对照组。K562细胞与牛蒡苷元作用后，粒系分化抗原CD15表达增强，而单核细胞系表面分化抗原CD14表达无明显变化，提示牛蒡苷元可能诱导K562细胞向粒系方向分化。参见表1、2。

表1 牛蒡苷元对HL-60白血病细胞分化抗原CD11b、CD13与CD14表达的影响

表2 牛蒡苷元对两种白血病细胞分化抗原CD14、CD15表达的影响

二、牛蒡苷元可有效诱导人源胃癌细胞SGC7901分化

试验分组和给药终浓度如下：

阴性对照组：赋形剂

牛蒡苷元组：1.0μmol/L

取常规培养的处于对数生长期的人源胃癌细胞SGC7901，以2×10⁵/ml接种于24孔板中，和诱导分化剂共同培养，培养条件为RPMI 1640(含体积分数为10％的胎牛血清)，37℃，5％CO2，饱和湿度培养6天。此后用0.25％的胰蛋白酶消化，PBS洗涤后，离心收集细胞，检测细胞形态的变化。取10⁶个/ml细胞悬液，以鸡红细胞作为内插标准、经碘化丙啶对样品细胞DNA荧光染色。然后进行流式细胞仪测定。从打印的DNA含量分布直方图，分析得到细胞周期各时相细胞的百分比率。

(1)细胞形态变化。阴性对照组SGC7901细胞多呈椭圆形，核大，核仁大，有时出现两个以上的核仁，核浆比例大，染色质物凝聚成块现象。牛蒡苷元处理后的SGC7901细胞多呈长圆形或近似菱形，核仁小，常出现单个核仁，核浆比下降，染色质凝聚成块。

(2)牛蒡苷元作用后细胞周期的变化。根据DNA含量直方图分析，牛蒡苷元处理胃癌细胞SGC7901后，其G1/0期细胞比率(％)高于阴性对照组胃癌细胞，P＜0.05；但S增殖期细胞比率(％)低于对照胃癌细胞，P＜0.01。细胞周期分析结果见表3。

表3 胃癌细胞周期分析

三、牛蒡苷元可有效诱导与人源肺癌细胞A549分化

试验分组和给药终浓度如下：

阴性对照组：赋形剂

牛蒡苷元组：2.0μmol/L

以经典方法取24孔培养板，铺双层软琼脂，置于培养箱中培养两周后计数集落数。采取溴化乙啶(EB)一步染色法。将EB染色的单细胞悬液用流式细胞仪测试10000个细胞，进行细胞计量术分析，同时将资料输入HP-300Consort30计算机，数据经用最小二乘法拟合得出。

(1)软琼脂集落形成率测定。牛蒡苷元实验组细胞的软琼脂集落形成率为3.31％±1.02，显著少于阴性对照组(15.62％2±0.96)，说明牛蒡苷元能明显抑制A549细胞在软琼脂中形成集落的能力。

(2)牛蒡苷元作用后细胞周期的变化。各浓度牛蒡苷元实验组S期细胞比例随时间的延长而减少，G1/Go期细胞比例增加。说明牛蒡苷元抑制了A549细胞的DNA合成和有丝***，使细胞发生G1/Go期阻滞，这是处于分化过程中的细胞所具有的共同特征，证明了牛蒡苷元对A549细胞有确切的诱导分化作用。

为提高牛蒡苷元的水溶性及其在体内的口服生物利用度，发明人提供了牛蒡苷元的一种新型微乳制剂。本发明所述的微乳粒径大小均匀，一般为10-100nm。本发明通过利用微乳作为牛蒡苷元的药物载体，将其制备成为牛蒡苷元微乳浓缩物，也可以进一步将其与赋形剂制备成含有牛蒡苷元的各种微乳制剂，包括固体微乳制剂和液体微乳制剂。

本发明牛蒡苷元的微乳制剂，它含有牛蒡苷元和微乳载体，平均粒径为15-90nm，牛蒡苷元与微乳载体组成牛蒡苷元的微乳浓缩物。牛蒡苷元的微乳制剂可以进一步含有赋形剂。本发明所述的牛蒡苷元微乳浓缩物在室温下可以为液体、固体或半固体。其中牛蒡苷元的微乳浓缩物包括牛蒡苷元、油相、乳化剂和助乳化剂，优选地，牛蒡苷元、油相、乳化剂和助乳化剂重量比为：牛蒡苷元1-10份、油相5-85份、乳化剂20-60份、助乳化剂5-60份。本发明还分别对油相、乳化剂和助乳化剂分别进行优选。

上述的微乳制剂可以作为自乳化药物传递***，含药的微乳浓缩物进入胃肠道后与胃肠道内的水接触后自动形成微乳，供人体吸收。也可以将微乳浓缩物加入赋形剂后制备成为各种微乳制剂。以增加患者对该药物微乳制剂的用药途径和剂型偏好的选择。所述的赋形剂为防腐剂、填充剂、PH调节剂、等渗调节剂、酸化剂、水或它们的混合物。赋形剂占微乳制剂重量的0.05％-10％。

通过上述技术方案制备的微乳浓缩物，发明人将其继续制备成含有牛蒡苷元的微乳口服液、微乳胶囊、注射用微乳。

附图说明：

图1阴性对照组(K562细胞瑞氏-吉木萨染色)

图2牛蒡苷元A组(K562细胞瑞氏-吉木萨染色)

图3牛蒡苷元B组(K562细胞瑞氏-吉木萨染色)

图4牛蒡苷元C组(K562细胞瑞氏-吉木萨染色)

图5阴性对照组(HL-60细胞瑞氏-吉木萨染色)

图6牛蒡苷元A组(HL-60细胞瑞氏-吉木萨染色)

图7牛蒡苷元B组(HL-60细胞瑞氏-吉木萨染色)

图8牛蒡苷元C组(HL-60细胞瑞氏-吉木萨染色)

图9人源慢性髓性白血病细胞K562、人源急性早幼粒白血病细胞HL-60NBT还原能力

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。

第一部分牛蒡苷元的微乳浓缩物及微乳制剂

实施例1 牛蒡苷元微乳的制备及质量评价

1、牛蒡苷元微乳浓缩物处方的确定

根据微乳三元相图研究，选择合适的油相、乳化剂和助乳化剂，并根据伪三元相图确定它们之间的量的关系，最终确定了以辛葵酸甘油脂为油相、以壬烷基酚聚氧乙烯醚作为乳化剂，以1，2-丙二醇作为助乳化剂的微乳载体。具体处方如下：

组分	重量/g
		牛蒡苷元	5
中链脂肪酸甘油酯	15
		聚氧乙烯蓖麻油EL-40	50
1，2-丙二醇	12.5
		无水乙醇	12.5

2、牛蒡苷元微乳的制备工艺

称取处方量中链脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油EL-40、1，2-丙二醇、无水乙醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。将上述所得的微乳浓缩物加水按照1∶10-20的重量比稀释至澄清溶液，即得微乳。

3、牛蒡苷元微乳理化性质的考察及其质量评价方法

3.1 外观性状

观察牛蒡苷元微乳的外观性状

3.2 微乳类型的鉴别

取少量的牛蒡苷元微乳浓缩液，分别加入亚甲基兰和苏丹红溶液，观察2种不同颜色的溶液在微乳中的扩散速度的快慢。

3.3 离心实验

将牛蒡苷元微乳于DT5-3离心机中离心30min，观察现象，考察其物理稳定性。

3.4 粒径及粒度分布的研究

取牛蒡苷元微乳适量，用激光粒度测定仪测定其粒径和粒度分布；取牛蒡苷元微乳适量，用水稀释50倍，用激光粒度测定仪测定其稀释液的粒径与粒度分布。

3.5 牛蒡苷元含量测定方法的建立

3.5.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C₁₈(size：5μm，-150mm×4.6mm)；流动相：甲醇-乙睛-水(40∶20∶40)；流速：0.8ml/min；紫外检测波长：280nm；柱温：室温。

3.5.2 标准曲线

精密称取牛蒡苷元对照品0.1562g(相当于牛蒡苷元0.1381g)，置于25ml棕色量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，摇匀；取1ml置于25ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；分别取此稀释液1、2、3、4、5、6ml置于10ml棕色瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到浓度为22.1、44.2、66.3、88.4、110.5、132.6μg/ml的系列标准溶液，按照色谱条件分别进样。

3.5.3 精密度与样品稳定性

取牛蒡苷元标准溶液66.3μg/ml，重复测定6次，计算峰面积RSD；分别在第0、2、4、6、8、12、24h分别进样，计算峰面积RSD。

3.5.4 含量测定

取牛蒡苷元微乳1ml，置于100ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，测定牛蒡苷元的含量。

4、牛蒡苷元微乳理化性质的考察及其质量评价结果

4.1 外观性状

4.2 微乳类型

红色在微乳中的扩散速度比蓝色快，说明该微乳为O/W型微乳。

4.3 离心试验

微乳仍为澄清透明，为产生沉淀，不出现分层、混浊现象。说明其物理稳定性良好，可间接说明自然静置较长时间后仍可保持较好的稳定性。

4.4 粒径及粒度分布

牛蒡苷元微乳浓缩液及稀释液的粒径及粒度分布测定结果表明，实验制备的牛蒡苷元微乳平均粒径25nm，多分散系数为0.105；牛蒡苷元微乳稀释液的平均粒径22nm，多分散系数为0.078；可见制备的牛蒡苷元微乳和微乳的稀释液的粒径较小，分布范围窄且均匀。符合微乳的关于粒径和粒度的分布要求。

4.5 牛蒡苷元的含量测定

在1.916×10^-4-4.79×10^-2μg/ml范围内，色谱峰面积与牛蒡苷元的进样量(μg)呈良好线性关系，回归方程为：Y＝1119986X+1508.8，r＝0.9993。

实施例2 微乳浓缩物

组分	重量/g
		牛蒡苷元	1
氢化椰油甘油酯	5
		聚氧乙烯蓖麻油EL-40	20
1，2-丙二醇	5

制备工艺：称取处方量氢化椰油甘油脂、聚氧乙烯蓖麻油EL-40、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为15nm。

实施例3 微乳浓缩物

组分	重量/g
		牛蒡苷元	10
PEG-2-硬脂酸酯	85
		聚氧乙烯蓖麻油EL-40	60
1，2-丙二醇	60

制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为35nm。

实施例4 微乳浓缩物

组分	重量/g
		牛蒡苷元	1
月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯	20
		聚氧乙烯蓖麻油EL-40	35
1，2-丙二醇	15

制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为90nm。

实施例5 微乳浓缩物

组分	重量/g
		牛蒡苷元	10
薄荷油	40
		月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯	55
1，2-丙二醇	45

制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为80nm。

实施例6 微乳浓缩物

组分	重量/g
		牛蒡苷元	1
氢化椰油甘油酯	5
		月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯	20
1，2-丙二醇	5
		聚乙二醇3350	20

制备工艺：称取处方量氢化椰油甘油脂、月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯、1，2-丙二醇、聚乙二醇3350，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为40nm。

实施例7 微乳浓缩物

组分	重量/g
		牛蒡苷元	10
PEG-2-硬脂酸酯	85
		月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯	60
1，2-丙二醇	60
		聚乙二醇1450	70

制备工艺同实施例6。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为35nm。

实施例8 牛蒡苷元的注射用微乳

组分	重量/g
		牛蒡苷元	1
月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯	35
		1，2-丙二醇	15
聚乙二醇4000	30
		注射用水	1000

微乳浓缩物的制备工艺同实施例6。制备好微乳浓缩物后，加入处方量的注射用水，配制成含有牛蒡苷元的注射用微乳。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为60nm。

实施例9 牛蒡苷元的口服液

组分	含量
		牛蒡苷元	5g
薄荷油	30g
		氢化椰油甘油酯	50g
1，2-丙二醇	20g
		乳糖	10g
5％苯扎溴铵溶液	10ml
		蒸馏水	加至100ml

制备工艺：称取处方量薄荷油、氢化椰油甘油酯、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，搅拌下缓慢加入适量的蒸馏水、处方量的乳糖和5％苯扎溴铵溶液，即得牛蒡苷元的微乳口服液。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为57nm。

实施例10 含牛蒡苷元的胶囊

组分	重量/g
		牛蒡苷元	5
辛酸油酸乙酯	30
		氢化椰油甘油酯	50
1，2-丙二醇	20
		PEG3350	100
二氧化硅	20

制备工艺：称取处方量的辛酸油酸乙酯、氢化椰油甘油酯、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，搅拌下缓慢加入处方量的PEG3350和二氧化硅，充分混合后将混合物加入至胶囊壳中，即得牛蒡苷元微乳胶囊。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为90nm。

实施例11 牛蒡苷元微乳制剂的口服生物利用度研究

1、实验材料

1.1 药品与试剂

牛蒡苷元注射液(自制，溶液中加20％丙二醇助溶并配成所需剂量)；

牛蒡苷元乳剂(制备工艺同CN101036643A说明书第4页实施例3)；

牛蒡苷元微乳剂(制备工艺同本发明实施例1)；

牛蒡苷元对照品(纯度99.5％)；肝素钠，生理盐水，甲醇，乙睛(均为色谱纯试剂)，其他均为分析纯试剂。

1.2 实验仪器

LC-10A高效液相色谱仪；SPD-10AV紫外检测器：ShimazuClass-vp Version 5.03 workingstation；KQ-100型超声波清洗器；台式离心机TGL-16C；手动匀浆器。

1.3 实验动物

新西兰家兔，体重1400-1500g，雌雄兼用，山东新时代药业动物中心提供。

2、实验方法

2.1 血浆中药物浓度的测定方法

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取牛蒡苷元对照品9.58mg，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得0.958mg/ml的对照品溶液。

2.1.2 血浆样品预处理

取样品0.5ml置于分液漏斗中，加入5ml二氯甲烷，摇匀，提取两次。分取二氯甲烷层并合并，40℃水浴蒸干二氯甲烷液，残渣加乙睛0.5ml溶解，作为供试品溶液，置于冰箱中(-20℃)待测，进样10μl。

2.1.3 生物样品中药物含量测定方法的建立

2.1.3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C₁₈(size：5μm，-150mm×4.6mm)；流动相：乙睛-水(35∶65)；流速：0.8ml/min；紫外检测波长：280nm；柱温：室温。

2.1.3.2 方法专属性考察

将实验动物的血浆按上述方法处理后，取10μl注入高效液相色谱仪。同法处理空白血浆样品。结果，在上述色谱条件下，牛蒡苷元色谱峰与其它峰有良好的分离度，与邻近峰分离度R：2.5，理论塔板数为3566块/米，空白血浆对其分析测定没有干扰。

2.1.3.3 最低检测浓度的测定

按峰高为基线噪音3倍计算，血浆中牛蒡苷元最低检测量为9.58×10^-3μg/ml。

2.1.3.4 线性范围

取空白生物样品，加入不同浓度牛蒡苷元标准溶液，使样品浓度为：1.916×10^-2、4.79×10^-2、9.58×10^-2、4.79×10^-1、9.58×10^-1、2.874、4.79μg/ml，各进样10μl，以进样量(μg)为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果：在1.916×10^-4-4.79×10^-2μg范围内，色谱峰面积与牛蒡苷元的进样量(μg)呈良好线性关系，回归方程为：Y＝1119986X+1508.8，r＝0.9993。

2.1.3.5 回收率和精密度

回收率：取空白生物样品，配制4.79×10^-2μg/ml、4.79×10^-1μg/ml、4.79μg/ml三个浓度生物样品及同样浓度的牛蒡苷元标准溶液，分别在前述HPLC色谱条件下各测定5次，并将测定结果进行比较，计算绝对回收率。结果表明：本方法在低、中、高三种浓度水平上的回收率最低为：75.6％，能满足生物样品的测试要求。

精密度：取4.79×10^-2μg/ml、4.79×10^-1μg/ml、4.79μg/ml三个浓度血浆在同一天内分别进行五次测定，计算其日内相对标准差，精密度RSD分别为2.22％，1.67％，0.98％。经测定其他生物样品的日内、日间相对标准差均小于5％，符合生物样品的测试要求。

2.1.4 血浆等生物样品预处理方法选择

血浆样品在注入色谱柱测定前需去除蛋白质等杂质，以防止堵塞色谱柱，造成柱效降低，一般采用加入水溶性有机溶媒如甲醇、乙腈等，或加入10％三氯醋酸等强酸除蛋白，或用有机溶媒提取。本实验中采用对牛蒡苷元有较好溶解度的二氯甲烷提取生物样品，考虑到二氯甲烷的挥发性较大，故将二氯甲烷液挥干后加较为稳定的乙腈来溶解，进样。

2.2 分组与给药

2.2.1 静脉注射组：

将禁食12小时，自由饮水的家兔10只，取1ml空白血后分别给10mg/kg牛蒡苷元溶液，耳缘静脉注射，于给药5min，10min，20min，30min，40min，50min，60min，75min，90min，105min，120min耳缘静脉血1ml，置涂有肝素的离心管中，离心(3000rpm)10min，取血浆0.5ml，保存于-20℃冰箱中，按前述生物样品制备方法进行处理，并制备，测定血药浓度时取10μl进样分析。

2.2.2 牛蒡苷元微乳剂组

将禁食12小时，自由饮水的家兔10只，取1ml空白血后分别给30mg/kg牛蒡苷元微乳灌胃剂灌胃，分别于给药后0.5小时、1小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、4.0小时、5.0小时、6.0小时耳缘静脉取血1ml，置涂有肝素的离心管中，离心(3000rpm)10min，取血浆0.5ml，保存于-20℃冰箱中，按前述生物样品制备方法进行处理，并制备，保存于-20℃冰箱中，测定血药浓度时取10μl进样分析。

2.2.3 牛蒡苷元乳剂组

将禁食12小时，自由饮水的家兔10只，取1ml空白血后分别给30mg/kg牛蒡苷元乳剂灌胃，分别于给药后0.5小时、1小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、4.0小时、5.0小时、6.0小时耳缘静脉取血1ml，置涂有肝素的离心管中，离心(3000rpm)10min，取血浆0.5ml，保存于-20℃冰箱中，按前述生物样品制备方法进行处理，并制备，保存于-20℃冰箱中，测定血药浓度时取10μl进样分析。

2.3 数据处理

将血药浓度-时间曲线用中国药学会数学药理专业委员会编写的3p87实用药代动力学程序进行处理，经计算机进行曲线拟合，求得主要药动力学参。

2.4 实验结果

家兔耳缘静脉注射牛蒡苷元10mg/kg，取血药浓度的平均值。用中国药学会数学药理专业委员会编写的3p87实用药代动力学程序进行处理，经计算机拟合，得拟合优度比较，房室间F检验，根据F检验和AIC值选择房室数，当F检验有显著意义时(P＜0.05或P＜0.01)，应取AIC值较小的房室数，当F检验无显著意义时p＞0.05)，则取房室数少者为宜。从房室间F检验各房室间F检验P均大于0.5，确定其动力学行为符合单室一级吸收模型。

另外在静注6-10mg/kg时，各剂量的Ke、T_1/2(Ke)、Vc、CL(s)等主要动力学参数十分接近，经统计学检验无显著性差异(P＞0.05)，且AUC随剂量增加而成比例增加，说明在此剂量范围内牛蒡苷元的消除为线性动力学。

家兔灌胃给药30mg/kg，血药浓度-时间数据见表1。取血药浓度的平均值，用中国药学会数学药理专业委员会编写的3p87实用药代动力学程序进行处理，经计算机拟合，得拟合优度比较、房室间F检验，根据F检验和AIC值选择房室数，当F检验有显著意义时(P＜0.05或P＜0.01)，应取AIC值较小的房室数，当F检验无显著意义时(P＞0.05)，则取房室数少者为宜。确定其动力学行为符合单室一级吸收模型。

按照上述确定的单室一级吸收模型计算所得到的药物动力学参数，见表4。

表4 注射和灌胃给药后牛蒡苷元的主要药动学参数

参数	乳剂组	微乳剂组	注射组
				Ke/h^-1	0.8888±0.0747	0.8206±0.0786	0.7974±0.0887
T_1/2/h	0.7798±0.0689	0.7980±0.0556	0.8694±0.0962
				Tmax/h	1.5645±0.1826	1.2633±0.1012	——
Cmax/μg·ml^-1	0.5013±0.0502	0.8222±0.0627	——
				AUC/μg·ml^-1·h	1.4978±0.1280	4.6520±0.5201	3.4278±0.5680

根据上表，分别计算牛蒡苷元乳剂和微乳剂灌胃给药的相对生物利用度F。结果见表5。由此可见，将牛蒡苷元制备成微乳制剂后，口服生物利用度较乳剂提高了2倍多。

表5 牛蒡苷元乳剂和微乳剂灌胃给药的相对生物利用度

组别	给药剂量(mg/kg)	AUC(μg·ml^-1·h)	AUC/D	F(％)
					注射组	10	3.4278	0.3430	——
乳剂组	30	1.4978	0.0499	14.56
					微乳剂组	30	4.6520	0.1550	45.21

将实施例2-10制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂替代实施例11中使用的实施例1的牛蒡苷元的微乳制剂，CN101036643A说明书公开实施例1-7替换实施例11中的乳剂重复实施例11，结果发现CN101036643A说明书公开实施例1-7牛蒡苷元的乳剂口服生物利用度为9.60％-16.23％，牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂的口服生物利用度为38.80％-55.02％，较牛蒡苷元的乳剂口服生物利用度明显提高了1.39-4.73倍。

Claims

1.牛蒡苷元在制备促进癌细胞分化的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，所述癌细胞是白血病细胞、胃癌细胞或肺癌细胞。

3.如权利要求1或2所述的用途，所述药物是牛蒡苷元的微乳制剂，它含有牛蒡苷元、微乳载体，微乳载体包含油相、乳化剂和助乳化剂，所述的微乳制剂的平均粒径为15-90nm。

4.如权利要求3所述的用途，所述药物是含牛蒡苷元的口服液、胶囊、注射剂。