CN103923957A - 一种手性n-保护哌啶醇的生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组重组酮还原酶的蛋白序列，以及利用该系列酮还原酶制备手性N-保护哌啶醇的方法，其以N-保护哌啶酮为底物，使该底物在重组酮还原酶、辅因子及异丙醇的存在下发生不对称还原反应生成手性N-保护哌啶醇，所述不对称还原反应在pH为7.0~9.0的水相缓冲液中、温度20℃~45℃下进行。本发明方法通过采用特定的重组酮还原酶来代替现有生物法所用的来源不稳定的催化剂，成功制备出光学纯度高的手性N-保护哌啶醇。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便，特别是，反应底物的浓度可提高至10%以上，大大提高了制备手性N-保护哌啶醇的效率和降低了反应的成本，具有重要的实际工业应用价值。

Description

一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法。
背景技术
大量具备重要生物活性的天然和非天然物质的结构中都包含有一个哌啶环。因此，在3-位上的碳原子衍生化之后形成的手性中心对于这些生物活性物质的性质有着非常重要的影响。在如何引入此手性中心的问题上，大量工作研究了还原3-位上的酮酯(J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1998,22,3673–3684,Acta Chem.Scand.1998,52,461–468.)。然而，对于并不含有酯结构的手性哌啶醇，特别是手性N-保护哌啶醇这类具有重要药物合成价值的化合物，对其如何合成却缺乏必要的研究。
(S)-N-Boc-3-羟基哌啶醇(结构式：)可以用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林(Bio.Med.Chem.2003,11,581–590)、BTK抑制剂ibrutinib、天然物质异白刺啉淋胺(isonitramine)和小果白刺碱(sibirine)等药物前体(Tetrahedron Lett.1989,30,2301–2304,J.Org.Chem.1984,49,1688–1691等)，因此该类化合物具有广泛的应用前景。
(S)-N-Boc-3-羟基哌啶醇可以由N-Boc-3-羟基哌啶酮制得，同时引入手性中心。传统的酮合成法有化学还原和生物还原。利用化学催化方法实现这一过程已有报道，但是由于效率较低，反应条件苛刻，产生的三废较多，没有能够实现工业化应用(US patent2011092698A1,WO2011036280A1)。
虽然利用生物转化实现还原反应生产手性仲醇已经成为成熟可靠的技术，但是通过文献检索，只有一个利用胡萝卜整细胞催化该还原反应的实例(Org.Lett.2009,11,1245–1248)，所用催化剂较多(占底物质量的23.4％)，且来源不稳定。植物细胞反应涉及到品种、产地和季节，含有复杂的成分，对下游分离提取不利。更重要的是，该反应底物浓度较低(3.3mM)，产物光学纯度只有98％，与现有的技术标准相比，不具备实际工业应用价值(Biotechnol.Bioeng.2008,101,647–653文中提出了具有工业化应用前景的酶反应参数标准)。由于该分子具备特殊的生物活性，因此尚不清楚是否可以利用目前相对先进的重组酮还原酶技术开发具备工业化参数标准的生物过程制备获得产物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，所述手性N-保护哌啶醇的结构式如下：
其中R代表保护基；
所述方法以N-保护哌啶酮为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成手性N-保护哌啶醇，所述生物催化剂为重组酮还原酶，所述重组酮还原酶由氨基酸序列如SEQ ID No.1～25中任一项所示的酮还原酶重组得到，所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中、温度20℃～45℃下进行。
SEQ ID No.1
MRAVQYRTIGGGPEVVEVPTPEPGPGQIRLRVTAAGLCHSDWFVMDLPADKYAYGLPLTLGHEGTGVVDALGDGVTGVAVGDPVAVYGPWGCGLCSACARGAENYCPRAASLGIQPPGLGAPGALAEYMVVDDVRHLVPLGDLDPVEAVSLTDAGLTPYHAIVSSLDKLAAGSTAVVIGAGGLGHVGIQVLRAVTGATVVALDISEEKLALASEVGAHSVLRSDDAAVGAIRSLTGGVGAQAVFDFVGAAPTVEIARKSVALDGVIQIVGIGGGLLPTGFFSTPMGASVRAPYWGTRTELMEVLDLARAGAVHVEVEKYTLDEAPEAYRRLHEGAVRGRAVVVPGD
SEQ ID No.2
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SEQ ID No.3
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SEQ ID No.4
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SEQ ID No.5
MKALQYTEIGSEPVVVDVPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYIYGLPLTLGHEGVGTVAELGAGVTGFETGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAAELGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAVPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGEGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAIDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMDVVDLARAGRLDIHTETFTLDEGPTAYRRLREGSIRGRGVVVPG
SEQ ID No.6
MKALQYRTVGAAPEVVTVPDPEPGPGQILLKVTAAGVCHSDIAVMSRPAEALTFPLPLTLGHEGVGTVAALGAGVTGLAEGDQVAVYGPWGCGACAKCAEGKENYCLRAGALGIRPPGLGAPGAMAEYLLVDDPRHLVPLDGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRALPRLVPGSTAVVIGAGGLGHVAVQLLRALSPARVVALDISEDKLRLAREVGAHETVRSDERAAAAVRELTGGLGAEAVFDFVGAAPTVAVAGAVAAVEGEISVVGLGGGALPVGFGRLPHEVTVSSPYWGSRGELAEVLALARSGALAVHTETFTLDEAPLAYERLHAGRVDGRAVVLPNG
SEQ ID No.7
MKALQYRTIGAPPEVVTVPDPEPGPGQVLLKVTAAGVCHSDIAVMSWPAEGFPYELPLTLGHEGVGTVAALGAGVTGLSEGDAVAVYGPWGCGTCAKCAEGKENYCLRADELGIRPPGLGRPGSMAEYLLVDDPRHLVPLDGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLVPGSTAVVIGTGGLGHVAIQLLRALTSARVVALDVSEDKLRLAREVGAHEAVLSDAKAADAVRELTGGLGAEAVFDFVGVAPTVKTAGAVAAVEADVTLVGIGGGSLPVGFGLLPFEVSVNAPYWGSRSELVEVLALARSGAVSVHTETYSLDDAPLAYERLHEGRVNGRAVILAHG
SEQ ID No.8
MKALQYRSVGAAPEVVTVPDPEPGPGQVLLKVTAAGVCHSDIAVMSWPAEEFPYELPLTLGHEGVGTVAALGAGVTGLSVGDPVAVYGPWGCGTCANCAQGKENYCLRADELGIRPPGLGAPGSMAEYMIVDDPRHLVPIDGLDPVATVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLVPGSTAVVIGTGGLGHVAIQLLRAMTAARVVALDVTEEKLALARTVGAHEALLSDSEAAAKVRELTGGRGAEAVFDFVGVQPTVETAGAVAAIEGDVTIVGIGGGTLPVGFGKTNFEVSVTAPYWGSRGELIEVLDLARAGAVSVHTETFTLDEAPLAYERLHDGKINGRAVILPNG
SEQ ID No.9
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SEQ ID No.10
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SEQ ID No.11
MKAVQYTEIGSEPVVVDIPTPTPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGDGVTGFETGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAAELGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAVPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGEGATVVFDFVGAQSTIDMAQQVVAIDGHISIVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMEVVDLARAGRLDIHTETFTLDEGPTAYRRLREGSIRGRGVVVPG
SEQ ID No.12
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SEQ ID No.13
MKALQYTEIGSEPVVVDVPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYIYGLPLTLGHEGVGTVAELGAGVTGFETGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAAELGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAVPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVMSGAGAADAIRELTGGEGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAIDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMDVVALARAGRLDIHTETFTLDEGPTAYRRLREGSIRGRGVVVPG
SEQ ID No.14
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SEQ ID No.15
MRALQYTEIGSEPVVVDLPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYAYGLPLTLGHEGVGTIAELGAGVTGFEKGDAVAVYGPWGCGTCAKCAEGKENYCLRADELGIRPPGLGAPGAIAEYLVVDDPRHLVPLGGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLTPGSTAVVIGAGGLGHVAIQLLRALTPARVVALDVSDDKLRLAREMGAHEAVRSDSGAADAVRELTGGIGAQAVFDFVGAAPTVATAAAVAAIEADVSLVGIGGAALPVGFGQLPFEVSVSAPYWGSRGELLEVLALARSGAVSVHTETFSLDDAPLAYERLHAGLIDGRAVILPNG
SEQ ID No.16
MRALQYTEIGSEPVVVDLPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYAYGLPLTLGHEGVGTIAELGAGVTGFEKGDQVAVYGPWGCGACAKCAEGKENYCLRAGALGIRPPGLGAPGAMAEYLLVDDPRHLVPLDGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRALPRLVPGSTAVVIGAGGLGHVAVQLLRALSPARVVALDISEDKLRLAREVGAHETVRSDERAAAAVRELTGGLGAEAVFDFVGAAPTVAVAGAVAAVEGEISVVGLGGGALPVGFGRLPHEVTVSSPYWGSRGELAEVLALARSGALAVHTETFTLDEAPLAYERLHAGRVDGRAVVLPNG
SEQ ID No.17
MKALQYTEIGSEPVVVDVPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYIYGLPLTLGHEGVGTVAELGAGVTGFETGDPVAVYGPWGCGLCSACARGAENYCPRAASLGIQPPGLGAPGALAEYMVVDDVRHLVPLGDLDPVEAVSLTDAGLTPYHAIVSSLDKLAAGSTAVVIGAGGLGHVGIQVLRAVTGATVVALDISEEKLALASEVGAHSVLRSDDAAVGAIRSLTGGVGAQAVFDFVGAAPTVEIARKSVALDGVIQIVGIGGGLLPTGFFSTPMGASVRAPYWGTRTELMEVLDLARAGAVHVEVEKYTLDEAPEAYRRLHEGAVRGRAVVVPGD
SEQ ID No.18
MKALQYTEIGSEPVVVDVPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYIYGLPLTLGHEGVGTVAELGAGVTGFETGDAVAVYGPWGCGTCAKCAEGKENYCLRADELGIRPPGLGAPGAIAEYLVVDDPRHLVPLGGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLTPGSTAVVIGAGGLGHVAIQLLRALTPARVVALDVSDDKLRLAREMGAHEAVRSDSGAADAVRELTGGIGAQAVFDFVGAAPTVATAAAVAAIEADVSLVGIGGAALPVGFGQLPFEVSVSAPYWGSRGELLEVLALARSGAVSVHTETFSLDDAPLAYERLHAGLIDGRAVILPNG
SEQ ID No.19
MKALQYTEIGSEPVVVDVPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYIYGLPLTLGHEGVGTVAELGAGVTGFETGDQVAVYGPWGCGACAKCAEGKENYCLRAGALGIRPPGLGAPGAMAEYLLVDDPRHLVPLDGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRALPRLVPGSTAVVIGAGGLGHVAVQLLRALSPARVVALDISEDKLRLAREVGAHETVRSDERAAAAVRELTGGLGAEAVFDFVGAAPTVAVAGAVAAVEGEISVVGLGGGALPVGFGRLPHEVTVSSPYWGSRGELAEVLALARSGALAVHTETFTLDEAPLAYERLHAGRVDGRAVVLPNG
SEQ ID No.20
MSSQTMKAVQYREIGKGPEVVEIDVPQPGPGQIRLKVTAAGLCHSDWFVMDLPEDQYTYGLPLTLGHEGAGVVDKLGEGVEGIEVGEAYAIYGPWGCGQCHACSQGRENYCPYAADLGITPPGLGAPGAMAEYVIVDDRRHLVPLGGLDPVEVVSLTDAGLTPYHAITSAQHKLYPGSTAVVIGVGGLGHVGIQIIRAISAATVIAVDISEDKLALATDVGAHHTVVSGPDAADRIRELTGGLGAQTVFDFAGVQPTVDLSKAVVAIDGFVHIVGIGGGVMSAGFFQTPMGAAVRAPYWGSRSELIEVLDLARVGAVGVHVERYGIDGAVEAYERLHHGEVQGRAVVVP
SEQ ID No.21
MRALQYTEIGSEPVVVDLPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGDGVTGFETGDPVAVYGPWGCGLCSACARGAENYCPRAASLGIQPPGLGAPGALAEYMVVDDVRHLVPLGDLDPVEAVSLTDAGLTPYHAIVSSLDKLAAGSTAVVIGAGGLGHVGIQVLRAVTGATVVALDISEEKLALASEVGAHSVLRSDDAAVGAIRSLTGGVGAQAVFDFVGAAPTVEIARKSVALDGVIQIVGIGGGLLPTGFFSTPMGASVRAPYWGTRTELMEVLDLARAGAVHVEVEKYTLDEAPEAYRRLHEGAVRGRAVVVPGD
SEQ ID No.22
MRALQYTEIGSEPVVVDLPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGDGVTGFETGDQVAVYGPWGCGACAKCAEGKENYCLRAGALGIRPPGLGAPGAMAEYLLVDDPRHLVPLDGLDPVAAVPLTDAGLTPYHAIKRALPRLVPGSTAVVIGAGGLGHVAVQLLRALSPARVVALDISEDKLRLAREVGAHETVRSDERAAAAVRELTGGLGAEAVFDFVGAAPTVAVAGAVAAVEGEISVVGLGGGALPVGFGRLPHEVTVSSPYWGSRGELAEVLALARSGALAVHTETFTLDEAPLAYERLHAGRVDGRAVVLPNG
SEQ ID No.23
MRAVQYTEIGSEPVVVDIPTPTPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAAQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGAGVTGFGVGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAADLGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAAPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGQGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAVDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMEVVALARAGRLDIHTETFTLDEGPAAYRRLREGSIRGRGVVVPGD
SEQ ID No.24
MKAVQYTEIGSEPVVVDIPTPTPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAAQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGEGVTGFGVGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAADLGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAAPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVMSGAGAADAIRELTGGQGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAVDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMEVVALARAGRLDIHTETFTLDEGPAAYRRLREGSIRGRGVVVPGD
SEQ ID No.25
MRAVQYTEIGSEPVVVDIPTPTPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAAQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGEGVTGFGVGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAADLGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAAPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGQGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAVDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMEVVALARAGRLDIHTETFTLDEGPAAYRRLREGSIRGRGVVVPGD
本发明的SEQ ID No.1～10是已知的，它们的在NCBI上的accessionnumber分别如下：
SEQ ID No.1为YP_003410662.1；
SEQ ID No.2为AFU52890.1；
SEQ ID No.3为YP_008978521.1；
SEQ ID No.4为WP_016693432.1；
SEQ ID No.5为WP_010594839.1；
SEQ ID No.6为EYT82674.1；
SEQ ID No.7为CAJ89749.1；
SEQ ID No.8为WP_018528978.1；
SEQ ID No.9为WP_019181658.1；
SEQ ID No.10为WP_018551046.1。
SEQ ID No.11～25是未公布的。
SEQ ID No.11～25的酮还原酶可通过蛋白质工程方法得到，SEQ IDNo.1～25的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。
可采用本领域常规的重组方法来对上述酮还原酶进行重组获得重组酮还原酶。一个具体的重组方法是：将含有酮还原酶基因的基因片段，与pET28a质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。从过夜培养物以1/100接种量转接100mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，离心，上清液预冻过夜，冻干24h-48h，即得冻干粉状的重组酮还原酶。
根据本发明的进一步实施方案：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为3％～15％(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的2％～8％(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的1.5～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.02％～1％(w/w)。
优选地，反应起始时底物的浓度为3％～12％(w/v)。
进一步优选地，反应起始时的反应体系中，底物的浓度为4％～10％(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的4％～6％(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的4～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.4％～0.6％(w/w)。
根据一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下：先将部分N-保护哌啶酮溶解在一部分异丙醇中，然后加入水相缓冲液，搅拌均匀后，加入重组酮还原酶与辅因子，维持在25℃～45℃，开始反应，同时开启充气泵向反应体系中鼓入空气，恒速流加剩余的N-保护哌啶酮和异丙醇，HPLC监控，至反应转化率达到99.0％以上，终止反应。
进一步地，反应终止后，向反应液中加入硅藻土搅拌，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，滤饼返回反应釜，加入乙酸乙酯搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤2～3次，浓缩后得到黄色油状物，加石油醚于黄色油状物中，于45～50℃下搅拌至均相，于-10℃～-20℃下静置，过滤后得到手性N-保护哌啶醇。
根据本发明，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
所述的水相缓冲液可以为Tri-HCl缓冲液、TEA-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。所述的水相缓冲液的pH优选为7～7.5。所述不对称还原反应的温度优选为20℃～35℃。
根据一个具体和优选方面，所述的手性N-保护哌啶醇的结构式如下：
其化学名称为1-叔丁氧羰基-3-哌啶醇或N-Boc-3-羟基哌啶。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明方法通过采用特定的重组酮还原酶来代替现有生物法所用的来源不稳定的催化剂，成功制备出光学纯度高的手性N-保护哌啶醇。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便，特别是，反应底物的浓度可提高至10％以上，大大提高了制备手性N-保护哌啶醇的效率和降低了反应的成本，具有重要的实际工业应用价值。
附图说明
图1为本发明的合成路线；
图2为实施例2中，反应1h取样所得样品的HPLC图谱；
图3为实施例2中，反应20h取样所得样品的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明旨在提供一种利用重组酮还原酶和异丙醇不对称还原N-保护哌啶酮制备手性N-保护哌啶醇的方法，所述手性N-保护哌啶醇的结构式如下：
其中R代表保护基，可以是叔丁氧羰基，苄氧羰基，乙酰基，苄基等。
不对称还原反应可以在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中、温度25℃～45℃下进行，反应条件温和，操作简便。
以R代表叔丁氧羰基的手性N-保护哌啶醇为例，其合成路线如图1所示。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1重组酮还原酶(KRED)酶粉摇瓶生产工艺
将含有酮还原酶基因(SEQ ID No.4、5、18、19或25)的基因片段(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)，与pET28a质粒(购自Invitrogen)的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到4mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。从过夜培养物以1/100接种量转接100mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，离心，上清液预冻过夜，冻干24h-48h，即得冻干粉状的重组酮还原酶KRED。
实施例2百毫克级制备工艺
在5ml反应瓶中加入150mg N-Boc-哌啶酮及0.1ml异丙醇，搅拌至底物完全溶解，随后加入1.2ml TEA-HCl缓冲液(0.1M，pH7.0)、7.5mg酮还原酶粉(0.5U/mg，溶于0.1ml缓冲液)、NAD+0.75mg(溶于0.1ml缓冲液)，在30℃下磁力搅拌反应1h和20h后取样进行HPLC分析，图谱分别见图2(反应1小时样品，保留时间5.86分钟为产物，10.75分钟为底物)和图3(反应20小时样品，5.86分钟为产物)，最终转化率>99.5％。
实施例3百克级制备工艺
将450g(2.26mol)N-Boc-3-哌啶酮加至20L反应釜中，加入0.3L异丙醇，搅拌至完全溶解；加入9.0L Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH7.0)，于30℃下搅拌(450rpm)均匀；然后依次加入22.5g酮还原酶粉(0.5u/mg)与2.25g NAD+，开始反应；同时开启充气泵向反应体系中鼓入空气，恒速流加溶解有550g N-Boc-3-哌啶酮的异丙醇0.6L，20h滴完。HPLC监控，反应24h后，转化率99.3％，终止反应。
向反应液中加入硅藻土(50g)搅拌0.5h，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取(3.0L×2)，滤饼返回反应釜，加入乙酸乙酯搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤两次，浓缩后得到0.49kg黄色油状物。加0.5L石油醚于黄色油状物中，于50℃下搅拌至均相，于-20℃下静置8h，过滤后得到N-Boc-3-羟基哌啶0.37kg，收率81.4％，GC纯度98.7％，ee值99.5％；1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ＝1.443-1.458[m,11H,-(CH3)3,-CH2],1.727-1.883[d,2H,-CH2],3.039–3.125[m,2H,-CH2],3.539[s,1H,-CHOH],3.731–3.765[m,2H,-CH2]；MS(ESI):202(M+H)+。
实施例4公斤级制备工艺
将1.35kg(6.78mol)N-Boc-3-哌啶酮加至50L反应釜中，加入0.9L异丙醇，搅拌至完全溶解；加入27.0L Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH7.0)，于30℃下搅拌(450rpm)均匀；然后依次加入67.5g酮还原酶粉(0.5u/mg)与6.75g NAD+，开始反应；同时开启充气泵向反应体系中鼓入空气，恒速流加溶解有1.65kg N-Boc-3-哌啶酮的异丙醇1.8L，20h滴完。HPLC监控，反应24h后，转化率99.2％，终止反应。
向反应液中加入硅藻土(150g)搅拌0.5h，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取(9.0L×2)，滤饼返回反应釜，加入乙酸乙酯搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤两次，浓缩后得到1.45kg黄色油状物。加1.45L石油醚于黄色油状物中，于50℃下搅拌至均相，于-20℃下静置8h，过滤后得到N-Boc-3-羟基哌啶1.09kg，收率80.1％，GC纯度99.2％，ee值99.5％。1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ＝1.443-1.458[m,11H,-(CH3)3,-CH2],1.727-1.883[d,2H,-CH2],3.039–3.125[m,2H,-CH2],3.539[s,1H,-CHOH],3.731–3.765[m,2H,-CH2]；MS(ESI):202(M+H)+。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，所述手性N-保护哌啶醇的结构式如下：
其中R代表保护基；
其特征在于：所述方法以N-保护哌啶酮为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成手性N-保护哌啶醇，所述生物催化剂为重组酮还原酶，所述重组酮还原酶由氨基酸序列如SEQ IDNo.1～25中任一项所示的酮还原酶重组得到，所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中、温度20℃～45℃下进行。
2.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为3％～15％(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的2％～8％(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的1.5～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.02％～1％(w/w)。
3.根据权利要求2所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为4％～10％(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的4％～6％(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的4～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.4％～0.6％(w/w)。
4.根据权利要求2或3所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述制备方法的实施过程如下：先将部分N-保护哌啶酮溶解在一部分异丙醇中，然后加入水相缓冲液，搅拌均匀后，加入重组酮还原酶与辅因子，维持在25℃～45℃，开始反应，同时开启充气泵向反应体系中鼓入空气，恒速流加剩余的N-保护哌啶酮和异丙醇，HPLC监控，至反应转化率达到99.0％以上，终止反应。
5.根据权利要求4所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：反应终止后，向反应液中加入硅藻土搅拌，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，滤饼返回反应釜，加入乙酸乙酯搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤2～3次，浓缩后得到黄色油状物，加石油醚于黄色油状物中，于45～50℃下搅拌至均相，于-10℃～-20℃下静置，过滤后得到手性N-保护哌啶醇。
6.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
7.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为Tri-HCl缓冲液、TEA-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1或7所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液的pH为7～7.5。
9.根据权利要求1至3中任一项权利要求所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述不对称还原反应的温度为20℃～35℃。
10.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的手性N-保护哌啶醇的结构式如下：
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