CN102978249A - 6-氰基-（3r,5r）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 - Google Patents

6-氰基-（3r,5r）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 Download PDF

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Abstract

一种6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.5~7.5的水相缓冲液中进行。本发明方法只需要一种重组酮还原酶即可同时完成底物还原和辅酶再生循环，大大降低了生产成本，且反应条件温和，常温、常压、水相条件下即可进行，无需使用危险试剂。反应中产生的副产物丙酮易挥发，很容易从反应体系中除去，大大简化了后处理工作。

Description

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术
降胆固醇的他汀类药物是目前世界最畅销的药物大类。2010年世界最畅销药物——辉瑞公司的立普妥(商品名称Lipitor，年销售额119亿美元)有效活性成分为阿托伐他汀(atorvastatin)(Nature 2012, 485:185-194)，而6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯则是用于合成此类降胆固醇他汀类药物的关键手性中间体。目前可以通过化学法或酶法制备6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯(Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44:362-365 )。
美国专利US 2009/0216029 A1中公开了一种化学法工艺生产6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯，具体是利用硼烷类化合物在-70摄氏度以下的条件下将6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯还原。该工艺需要极端反应条件，易燃，能耗严重并且产品的立体异构纯度只能达到98%。
美国的科德克希思公司开发的合成路线则是利用源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因工程改造的酮还原酶(ketone reductase, KRED)催化从6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的还原反应，同时利用一种葡萄糖脱氢酶完成辅酶（NADPH）的再生反应。通过该工艺路线可以获得立体异构纯的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯（de值大于99%）（WO 2008/042876 A2），但是该工艺需要两种酶联合作用才能完成辅酶循环，从而造成生产成本升高。同时反应中产生的葡萄糖酸会改变反应体系的pH值，需要通过补加碱溶液加以调控，增加了反应条件控制的难度，另溶解在反应体系中的副产物葡萄糖酸也大大增加了后处理工艺的难度。
本专利公开了一种利用重组酮还原酶(ketone reductase, KRED)催化从6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的还原反应。只需要一种酶即可同时完成底物还原和辅酶再生循环，大大降低了生产成本。且反应条件温和，常温、常压、水相条件下即可进行，无需使用危险试剂。反应中产生的副产物丙酮易挥发，很容易从反应体系中除去，大大简化了后处理工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，其特征在于：所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床扩大培养，培养至OD600值达到0.6~0.8时，加入诱导剂，于25~33℃下继续培养8~12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8~12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10~-25℃，然后再冻干24~48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.5~7.5的水相缓冲液中进行。
在反应起始时的反应体系中，重组酮还原酶与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为1~5%，辅因子与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为0.1~0.5%，所述的异丙醇相对所述的6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的物质的量百分比为100~150%。。
所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
所述的辅因子为NADP/NADPH。
所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液。
所述的还原反应在pH为7.5的水相缓冲液中进行。
所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，异丙醇，所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶和辅因子，在25~35℃下，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯产品。
根据本发明，除重组酮还原酶外，其余原料均可商购获得。
本发明的有益效果在于:
本发明方法只需要一种重组酮还原酶即可同时完成底物还原和辅酶再生循环，大大降低了生产成本，且反应条件温和，常温、常压、水相条件下即可进行，无需使用危险试剂。反应中产生的副产物丙酮易挥发，很容易从反应体系中除去，大大简化了后处理工作。
附图说明：
附图1为转化率随反应时间变化图。
具体实施方式：
本发明的反应式如下：
Figure 2012104666281100002DEST_PATH_IMAGE001
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例一：重组酮还原酶（KRED）酶粉摇瓶生产工艺
从甘油管或转化平板单菌落接种到4ml含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜（37℃，200rpm）。从过夜培养物以1/100接种量转接100ml含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10ml磷酸缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟。离心，上清液预冻过夜。冻干24h-48h。
实施例二：辅因子再生体系验证
取重组酮还原酶（KRED）酶粉1 mg，加入1 mL 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0，50 mM)，异丙醇0.01 mL，NAD 15 mg，于5 mL离心管中，30℃水浴恒温磁力搅拌1 min，加入1 mL乙酸丁酯萃取，气相色谱分析。检测结果表明有丙酮生成，异丙醇被转化，根据峰面积计算转化率为10.5%。
实施例三：反应监测方法
采用LC-MS检测方法测定6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化。样品处理：取不同时间点反应液50 μL，加入甲醇950 μL，混匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，然后进样检测（进样量 1 μL）。色谱条件为：色谱柱  SB-C18 2.1×50 mm，3.5 μm，流动相 A 水（10 mM HCOONH4-0.1% HCOOH）-B 乙腈，流速 0.3 mL/min，0-5 min 22%B。质谱条件 干燥气流速 12 L/min，鞘气压力 40 PSI，干燥气温度350℃，毛细管电压3500 V，检测模式为正离子模式。检测离子 172.1, 174.2, 228.1, 230.1, 245.3, 247.2,250.1,252.1, 239.1，6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯保留时间 2.7min, 6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯保留时间 1.8 min。
实施例四：转化含量测定
通过配备ELSD检测器的HPLC测定6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯和6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的含量。对照品溶液制备：称取6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯对照品 125mg，并称取6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯对照品至50 mL容量瓶，用用甲醇溶解定容。别从母液中取3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL加入10 mL容量瓶，定容至刻度，过滤至液相小瓶，进样8 μL。样品溶液制备：称取6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯样品各100 mg，至50 mL容量瓶，用甲醇溶解定容。过滤至液相小瓶，进样8 μL。按照外标法计算含量。色谱条件：色谱柱 eclipse XDB-C18, 4.6×150 mm, 5 μm；流动相 A 水（0.1%HCOOH），B 乙腈；0-10min 25% B；ELSD条件：温度50 ℃，气体流速 1.5 L/min，增益值 1。
实施例五：克级制备工艺
向50 mL三口瓶中添加1000 mg 6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯和2000 μL异丙醇，再向反应瓶中加入8.5 mL事先已配好的pH为7.5，0.1 M PBS缓冲液。反应体系置于35 ℃，600 rpm磁力搅拌水浴锅中搅拌。待温度稳定后，向反应瓶中加入50 mg酮还原酶和5 mg NADP粗粉，开始计时反应。反应温度保持在30 ℃。反应到4小时，取反应液50 μL加入1 mL无水甲醇终止反应。混合均匀经0.45 μm有机滤膜过滤供LC-MS分析。继续反应到24小时，加入无水甲醇终止反应。底物转化率大于99%，产物光学纯度大于99%。反应进程曲线见图1。
实施例六：百克级制备工艺
向反应器中添加100 g 6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯和200 mL异丙醇，再向反应瓶中加入850 mL事先已配好的pH为7.5，0.1 M PBS缓冲液。反应体系置于35 ℃，机械搅拌水浴锅中搅拌。待温度稳定后，向反应瓶中加入5 g酮还原酶和0.5 g NADP粗粉，开始计时反应。反应温度保持在30 ℃。反应24小时后，底物转化率大于98%，产物光学纯度大于99%。反应结束后，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物96克左右。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，其特征在于：所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床扩大培养，培养至OD600值达到0.6~0.8时，加入诱导剂，于25~33℃下继续培养8~12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8~12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10~-25℃，然后再冻干24~48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.5~7.5的水相缓冲液中进行。
2.根据权利要求1所述的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：在反应起始时的反应体系中，重组酮还原酶与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为1~5%，辅因子与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为0.1~0.5%，所述的异丙醇相对所述的6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的物质的量百分比为100~150%。
3.根据权利要求1所述的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
4.根据权利要求1所述的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为NADP/NADPH。
5.根据权利要求1所述的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的还原反应在pH为7.5的水相缓冲液中进行。
7.根据权利要求1或2所述的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，异丙醇，所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶和辅因子，在25~35℃下，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯产品。
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