CN104357526B - 以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法 - Google Patents
以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,⑴静息细胞在发酵培养基中培养好以后,离心,加入无菌磷酸缓冲液重悬作为转化液;所述静息细胞具有将胆固醇氧化生成胆甾烯酮的能力;⑵在转化液中投入胆固醇,并添加低共熔物为促溶剂,乙酸乙酯萃取转化液,采用HPLC法检测产物胆甾‑4‑烯‑3‑酮的产率;⑶用柱层析分离法将底物胆固醇与产物胆甾烯酮进行分离,并纯化得到胆甾烯酮纯品。本发明采用低共熔物(DES)代替甲醇等有机溶剂作为绿色添加剂,添加低共熔物后,提高底物的分散率,有效促进底物胆固醇与菌体的接触,有效提高了静息细胞的转化效率,在加入和转化过程中操作条件温和,步骤简单。
Description
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域,尤其是一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法。
技术背景
胆甾-4-烯-3-酮(4-Cholesten-3-one),又名胆甾烯酮,分子式为C27H44O,是胆固醇经过化学合成法、微生物转化法等手段得到的重要产物之一,是胆固醇的氧化产物。胆甾烯酮可用于治疗肝病,可以作为减肥促进剂,具有防止皮肤角质化等作用。除此之外,胆甾烯酮的特定结构可以作为甾体药物的中间体,广泛用于医药行业。
曾有文献报道从土样中筛选出来的镰刀孢菌,优化菌株发酵过程的培养基以及发酵条件,将胆固醇转化成胆甾烯酮。也有专利CN1328133A报道采用一种短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82为产酶菌株,以葡萄糖与酵母膏作为最合适碳源与氮源,以醋酸铵作为产酶促进剂,以胆固醇作为产酶诱导剂和菌体生长营养因子,生物合成胞外型胆固醇氧化酶,进而通过微生物发酵培养得到胆甾-4-烯-3-酮。
胆固醇也叫胆甾醇,属于甾体类药物。这一类底物在水中的溶解度很低,其范围在10-5~10-6mol/L之间,这种难溶性使得甾体与生物酶的有效接触十分困难,严重影响甾体转化反应的速度和产率。因此,在甾体生物转化的过程中,添加一些促溶剂可以有利于底物与生物酶的有效接触,提高反应速度或增大反应速率。在甾体药物微生物转化的过程中,大多数采用甲醇、丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂作为促溶剂。低共熔物的化学性质与离子液体相似,室温下为液体状态,它们无蒸汽压,不会对大气造成污染。与传统的有机溶剂相比,低共熔物具有不可燃性,在操作过程中增加了其安全性。因此,研究低共熔物代替有机溶剂进行微生物转化实验具有更重要的意义。
发明内容
本发明提供了以一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,并将菌体采用静息细胞培养,进行胆固醇的转化,在转化溶剂中加入低共熔物,有效提高转化效率。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,步骤如下:
⑴静息细胞在发酵培养基中培养好以后,离心,加入无菌磷酸缓冲液重悬作为转化液;所述静息细胞具有将胆固醇氧化生成胆甾烯酮的能力;
⑵在转化液中投入胆固醇,并添加低共熔物为促溶剂,乙酸乙酯萃取转化液,采用HPLC法检测产物胆甾-4-烯-3-酮的产率;
⑶用柱层析分离法将底物胆固醇与产物胆甾烯酮进行分离,并纯化得到胆甾烯酮纯品。
而且,所述静息细胞为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)。
而且,所述简单节杆菌的斜面培养基为g/L:葡萄糖8~10,玉米浆8~9,蛋白胨4~5,KH2PO42,琼脂20,pH7.0~7.2,115℃高压灭菌20min;发酵培养基为g/L:葡萄糖8~10,玉米浆8~9,蛋白胨4~5,KH2PO42,pH7.0~7.2,115℃高压灭菌20min。
而且,所述简单节杆菌的培养方法为将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440~0.520的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应,菌种发酵培养时间为18h~22h,温度为25℃~35℃,摇床转速为150rpm~200rpm。
而且,所述无菌磷酸缓冲液的pH为7.0~7.2,浓度为的磷酸缓冲液。
而且,加入无菌磷酸缓冲液重悬后的转化液其菌体浓度为0.35-0.45gDW/mL。
而且,所述低共熔物为氯化胆碱/乙二醇混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种,或氯化胆碱/甘油混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种,或氯化胆碱/尿素混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种。
而且,所述低共熔物的添加浓度为1%~5%。
而且,所述底物胆固醇的投料浓度后,采用转化温度为25℃~35℃,摇床转速为150rpm~200rpm,反应时间为48~72h的方式进行微生物转化培养。
而且,所述柱层析分离法分离底物产物,采用石油醚:乙酸乙酯=10:1V:V的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压旋蒸法进行产物的纯化收集。
本发明的优点和积极效果:
1、本发明采用低共熔物(DES)代替甲醇等有机溶剂作为绿色添加剂,添加低共熔物后,提高底物的分散率,有效促进底物胆固醇与菌体的接触,有效提高了静息细胞的转化效率,在加入和转化过程中操作条件温和,步骤简单。
2、本发明解决了微生物转化实验中甾体底物溶解度低,难与生物酶有效接触进行转化反应,添加的有机溶剂毒性大、易挥发、对菌体毒性大等问题,为胆甾-4-烯-3-酮的生产开辟了新的途径,同时对于甾体药物的绿色环保、高效生产提供了一条新的途径,工业化意义重大。
附图说明
图1为本发明底物胆固醇在205nm下检测,保留时间为25.455min;
图2为本发明产物胆甾烯酮在240nm下检测,保留时间为22.989min;
图3为本发明不同DES百分含量的转化率对比图;
图4为本发明底物浓度不同的转化率对比图;
图5为本发明的转化率随菌体添加量的变化情况图。
具体的实施方式
为了理解本发明,下面结合实施例对本发明作进一步说明:下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明采用的静息细胞为简单节杆菌进行发酵实验,以胆固醇为底物,添加低共熔物为促溶剂的微生物转化反应式如下:
本申请中所述低熔点共熔物的合成方法如下:按摩尔比为1~2:1~2称取氯化胆碱、尿素,在95~105℃的油浴中搅拌2~3h,直至混合物形成均一、透明的液体,即为深度共熔溶剂(DES)。同理,氯化胆碱/甘油、氯化胆碱/乙二醇也按照上述方法进行合成。
斜面培养基(g/L):葡萄糖8,玉米浆8~9,蛋白胨4~5,KH2PO42,琼脂20,pH7.0~7.2,115℃高压灭菌20min。
发酵培养基(g/L):葡萄糖8,玉米浆8~9,蛋白胨4~5,KH2PO42,pH7.0~7.2,115℃高压灭菌20min。
本方法的操作步骤如下:
⑴静息细胞菌体培养:将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应。菌种发酵培养时间为18~22h,温度为30~32℃,摇床转速为160rpm。
⑵发酵转化实验:将50ml/250ml摇瓶中的菌体培养好之后,5000r,10min离心收集菌体,采用20ml磷酸缓冲液重悬菌体,调整菌体浓度为0.3~0.5(gDW/mL)将底物胆固醇投入转化液中,并添加低共熔物进行微生物转化反应。转化时间为48~-72h,温度为30~32℃,摇床转速为180rpm。
⑶胆甾烯酮产率的测定:采用高效液相色谱法测定,分离柱为Waters C18柱(4.6×250mm,5μm),底物检测波长为205nm,保留时间为25.455min(如图1所示),产物检测波长为240nm,保留时间为22.989min(如图2所示),流动相是甲醇:水(V/V)=95:5,流速为1mL/min。采用面积归一法计算底物转化率。转化率是反应过程中转化为产物的底物峰面积占初始底物总峰面积的百分比结果来表示。
⑷纯化回收:柱层析分离法分离并纯化回收:采用石油醚:乙酸乙酯(V:V)=10:1的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压旋蒸法进行产物的纯化收集。
本发明使用的简单节杆菌的菌体的名称:A.simplex1 56,保藏编号为:IFO12069,购买自日本大阪发酵研究所,本发明采用其他具有发酵转化胆甾烯酮的菌种均可实现,不仅限于本发明提供的菌种。
实施例1:
一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,本实施例通过改变DES混合比例,来检测其不同种类DES的催化转化效果,具体如下:
⑴将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应。菌种发酵培养时间为18~-22h,温度为30℃,摇床转速为160rpm。
⑵菌体培养好之后,离心收集菌体,采用20ml磷酸缓冲液重悬菌体,使其浓度为0.4gDW/mL。将5‰的底物胆固醇投入转化液中,并添加低共熔物进行微生物转化反应,其中添加的低共熔物为氯化胆碱/乙二醇混合摩尔比为1:2、1:1、2:1,或氯化胆碱/甘油混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种,或氯化胆碱/尿素混合摩尔比为1:2、1:1、2:1,共九种优化方案。转化时间为48~-72h,温度为30℃,摇床转速为180rpm。转化结束后,取500μl样品添加200μl乙酸乙酯,振荡萃取,静置2min后,取20μl晾干,添加色谱甲醇过膜,待HPLC检测得转化率。
⑶如表1所示,添加氯化胆碱/尿素,且摩尔比为1:1的转化结果较好。收集转化液,采用石油醚:乙酸乙酯(V:V)=10:1的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压旋蒸法进行产物的纯化收集。
表1不同DES转化率
实施例2:
一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,本实施例通过改变DES百分含量不同,来检测其不同浓度DES的催化转化效果,具体如下:
⑴将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应。菌种发酵培养时间为18~-22h,温度为30℃,摇床转速为160rpm。
⑵菌体培养好之后,离心收集菌体,使其浓度为0.4gDW/mL采用20ml磷酸缓冲液重悬菌体。将5‰的底物胆固醇投入转化液中,并添加低共熔物氯化胆碱/尿素(摩尔比为1:1)反应进行转化,其中低共熔溶剂占DES/磷酸缓冲液体系的百分含量分别为0%、2%、4%、6%、8%。转化时间为48~72h,温度为30℃,摇床转速为180rpm。转化结束后,取500μl样品添加200μl乙酸乙酯,振荡萃取,静置2min后,取20μl晾干,添加色谱甲醇过膜,待HPLC检测得转化率。
⑶如图3所示,DES百分含量为2%时转化结果较高。收集转化液,采用石油醚:乙酸乙酯(V:V)=10:1的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压悬蒸法进行产物的纯化收集。
实施例3:
一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,本实施例通过改变底物浓度,来检测其底物浓度变化的催化转化效果,具体如下:
⑴将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应。菌种发酵培养时间为18-22h,温度为30℃,摇床转速为160rpm。
⑵菌体培养好之后,离心收集菌体,采用20ml磷酸缓冲液重悬菌体,使其浓度为0.4gDW/mL。将底物胆固醇投入转化液中,其中底物添加量为1‰、5‰、1%、2%、3%,并添加2%氯化胆碱/尿素(摩尔比为1:1)的低共熔物进行微生物转化反应。转化时间为48~-72h,温度为30℃,摇床转速为180rpm。转化结束后,取500μl样品添加200μl乙酸乙酯,振荡萃取,静置2min后,取20μl晾干,添加色谱甲醇过膜,待HPLC检测得转化率如图5所示,采用2%底物添加量时其转化率最高。
⑶收集转化液,采用石油醚:乙酸乙酯(V:V)=10:1的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压旋蒸法进行产物的纯化收集。
实施例4:
一种以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,本实施例通过改变菌体浓度,来检测不同菌体浓度的催化转化效果,具体如下:
⑴将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应。菌种发酵培养时间为18-22h,温度为30℃,摇床转速为160rpm。
⑵菌体培养好之后,离心收集菌体,采用20ml磷酸缓冲液重悬菌体,使菌体浓度(gDW/mL)为0.35、0.4、0.45、0.5。将底物胆固醇投入转化液中,并添加2%氯化胆碱/尿素(摩尔比为1:1)的低共熔物进行微生物转化反应。转化时间为48-72h,温度为30℃,摇床转速为180rpm。转化结束后,取500μl样品添加200μl乙酸乙酯,振荡萃取,静置2min后,去20μl晾干,添加色谱甲醇过膜,待HPLC检测得转化率如图5所示。
⑶收集转化液,采用石油醚:乙酸乙酯(V:V)=10:1的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压旋蒸法进行产物的纯化收集。
需要说明的是:本实验利用传统离子液体如[PrMIM][PF6]、[BMIM][PF6]、[HMIM][PF6]、[PrMIM][NTf2]、[BMIM][NTf2]、[HMIM][NTf2]、[AMIM][NTf2]等进行胆固醇脱氢的生物催化尝试,结果发现该离子液体对菌体毒性较大,且转化率为0。不同离子液体对于简单节杆菌的毒性在浙江大学Huang Jing的研究中也得到证实。
Claims (8)
1.以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:步骤如下:
⑴静息细胞在发酵培养基中培养好以后,离心,加入无菌磷酸缓冲液重悬作为转化液;所述静息细胞具有将胆固醇氧化生成胆甾烯酮的能力;
⑵在转化液中投入胆固醇,并添加低共熔物为促溶剂,乙酸乙酯萃取转化液,采用HPLC法检测产物胆甾-4-烯-3-酮的产率;
⑶用柱层析分离法将底物胆固醇与产物胆甾烯酮进行分离,并纯化得到胆甾烯酮纯品;
所述静息细胞为简单节杆菌(Arthrobactersimplex);所述低共熔物为氯化胆碱/乙二醇混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种,或氯化胆碱/甘油混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种,或氯化胆碱/尿素混合摩尔比为1:2、1:1、2:1中的一种。
2.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:所述简单节杆菌的斜面培养基为g/L:葡萄糖8~10,玉米浆8~9,蛋白胨4~5,KH2PO42,琼脂20,pH7.0~7.2,115℃高压灭菌20min;发酵培养基为g/L:葡萄糖8~10,玉米浆8~9,蛋白胨4~5,KH2PO42,pH7.0~7.2,115℃高压灭菌20min。
3.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:所述简单节杆菌的培养方法为将简单节杆菌刮一环到无菌水中,振荡混匀,按照OD为0.440~0.520的浓度算好比例加入到50ml/250ml摇瓶中进行反应,菌种发酵培养时间为18h~22h,温度为25℃~35℃,摇床转速为150rpm~200rpm。
4.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:所述无菌磷酸缓冲液的pH为7.0~7.2。
5.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:加入无菌磷酸缓冲液重悬后的转化液其菌体浓度为0.35~0.45gDW/mL。
6.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:所述低共熔物的添加浓度为1%~5%。
7.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:所述底物胆固醇的投料后,采用转化温度为25℃~35℃,摇床转速为150rpm~200rpm,反应时间为48~72h的方式进行微生物转化培养。
8.根据权利要求1所述以低共熔物作为促溶剂利用静息细胞转化制备胆甾烯酮的方法,其特征在于:所述柱层析分离法分离底物产物,采用石油醚:乙酸乙酯=10:1(V:V)的比例进行分离,将收集得到的液体采用减压旋蒸法进行产物的纯化收集。
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