CN102965403A - (3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.0~9.0的水相缓冲液中进行。本发明方法通过采用重组的酮还原酶，避免了因添加辅助的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖而导致的使酶失活和产品提取困难等问题；并且采用改进的工艺，使得反应条件温和，反应效率提高，操作简便。

Description

(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术：
利用生物酶催化剂制备手性药物中间体，在医药工业中有着重要的应用。在生产世界上畅销的降胆固醇他汀类药物，即羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂类化合物的研究中，其手性侧链的生产步骤是最关键的。其中，在尝试制备关键中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的研究中，利用还原酶从(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯一步还原得到目标产物，以其高效率、高选择性的特点成为化学和制药工业界重点研究的对象。
在已经公开的制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法中，化学还原方法的反应条件往往需要低温(如-70℃)，及易燃的硼烷类化合物参与，是极为危险和难以实用化的(Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39: 4306-4307)。相比较而言，生物法的应用条件更加温和，因此也更加实用和环保。例如美国专利US2008/0248539 A1公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。为了实现辅酶的原位循环，该专利采用了添加辅助的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的方法。该方法虽然较化学法有诸多优势，但是其辅酶循环体系会产生与产物等当量的葡萄糖酸，为了维持反应体系的pH，需要加入等当量的碱进行中和，不但影响反应的工艺经济性和原子经济性，反应体系中产生的酸和添加的碱还可能对酶的活力产生一定的影响，并非该路线的最佳选择。
本专利公开了一种改进的利用酮还原酶生产(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，不仅避免了化学法中存在的种种问题，还对生物法进行了合理的改进，具有重要的工业应用价值。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种改进的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡纳霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含卡纳霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床扩大培养，培养至OD600值达到0.6~0.8时，加入诱导剂，于25~33℃下继续培养8~12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8~12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10~-25℃，然后再冻干24~48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.0~9.0的水相缓冲液中进行。
在反应起始时的反应体系中，重组酮还原酶与(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯的质量百分比为2~4%，辅因子与(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯的质量百分比为0.05~0.2%，所述的异丙醇相对所述的(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯的物质的量百分比为100~150%。
所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖。
所述的辅因子为NAD/NADH 。
所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
所述的还原反应在pH为8.0的水相缓冲液中进行。
所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入底物(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯，异丙醇，所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶和辅因子，在25~45℃下，搅拌反应，利用HPLC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯产品。
根据本发明，除重组酮还原酶，其余原料均可由通用渠道商购获得。
本发明的有益效果在于:
本发明方法通过采用重组的酮还原酶，避免了因添加辅助的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖而导致的使酶失活和产品提取困难等问题；并且采用改进的工艺，使得反应条件温和，反应效率提高，操作简便。
附图说明：
附图1为转化率随pH变化图。
具体实施方式：
本发明的反应式如下：
Figure 805366DEST_PATH_IMAGE001
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例一：重组酮还原酶酶粉摇瓶生产工艺
将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落从甘油管或转化平板接种到4 mL含卡纳抗性的液体LB培养基活化过夜（37℃，200 rpm）。从过夜培养物以1/100接种量转接100 mL含卡纳抗性的液体LB培养基，37℃、200 rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG 0.5 mM于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10 mL磷酸盐缓冲液（2 mM，pH 7.0）悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟。离心，上清液预冻过夜。冻干48h后得到重组酮还原酶粉。
实施例二：辅因子再生体系验证
取重组酮还原酶酶粉1 mg，加入1 mL 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0，50 mM)，异丙醇0.01 mL，NAD 15 mg，于5 mL离心管中，30℃水浴恒温磁力搅拌1 min，加入1 mL乙酸丁酯萃取，气相色谱分析。检测结果表明有丙酮生成，异丙醇被转化，根据峰面积计算转化率为10.5%。
实施例三：反应监测方法
采用HPLC-MS检测方法测定(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯到(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的转化。样品处理：取不同时间点反应液50 μL，加入甲醇950 μL，混匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，然后进样检测（进样量 1 μL）。色谱条件为：色谱柱  SB-C18 2.1×50 mm，3.5 μm，流动相 A 水（0.1%HCOOH）-B 乙腈，流速 0.3 mL/min，0-5 min 32%B。质谱条件 干燥气流速 12 L/min，鞘气压力 40 PSI，干燥气温度350℃，毛细管电压3500 V，检测模式为正离子模式。检测离子 181.1, 183.1, 185.1, 203.1, 205.1, 237.1, 239.1，(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯保留时间3.8 min, (3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯保留时间2.6 min。
实施例四：pH条件优化
取重组酮还原酶酶粉10 mg，加入10 mL 磷酸盐缓冲溶液(100 mM，pH分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5)，底物1 g，异丙醇0.65 mL，NAD 5 mg，于50 mL离心管中，35oC水浴恒温磁力搅拌5小时，取0.1 mL加入1 mL甲醇淬灭反应，HPLC-MS分析，如图1所示，转化率分别为39.1%，49.8%，51.0%，54.2%，60.3%，57.2%。根据此结果，选取规格为pH 8.0的缓冲液作为最优选。
实施例五：克级制备工艺
在100 mL三口烧瓶中依次加入5 g (S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯，3.75 mL异丙醇，42 mL 磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)，搅拌均匀，之后加入0.2 g重组酮还原酶冻干粉，NAD+ 5 mg，30℃下800 rpm磁力搅拌开始计时反应，取样HPLC-MS分析监控反应进程，反应24 h后，转化率>99%，产物立体构型纯度(d.e.)>99%。
实施例六：百克级制备工艺
在反应器中依次加入500 g (S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯，375 mL异丙醇，4.2 L 磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0，100 mM)，搅拌均匀，之后加入20 g重组酮还原酶冻干粉，NAD+ 0.5 g，30℃下机械搅拌开始计时反应，取样HPLC-MS分析监控反应进程，反应24 h后，转化率>99%，产物立体构型纯度(d.e.)>99%。反应结束后，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物490~500 g。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1. 一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，其特征在于：所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡纳霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含卡纳霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下摇床扩大培养，培养至OD600值达到0.6~0.8时，加入诱导剂，于25~33℃下继续培养8~12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8~12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10~-25℃，然后再冻干24~48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.0~9.0的水相缓冲液中进行。
2. 根据权利要求1所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：在反应起始时的反应体系中，重组酮还原酶与(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯的质量百分比为2~4%，辅因子与(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯的质量百分比为0.05~0.2%，所述的异丙醇相对所述的(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯的物质的量百分比为100~150%。
3. 根据权利要求1所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。
4. 根据权利要求1所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为NAD/NADH 。
5. 根据权利要求1所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
6. 根据权利要求1所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的还原反应在pH为8.0的水相缓冲液中进行。
7. 根据权利要求1或2所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入底物(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯，异丙醇，所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶和辅因子，在25~45℃下，搅拌反应，利用HPLC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯产品。
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