CN117723682B - 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 - Google Patents
一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117723682B CN117723682B CN202311544108.2A CN202311544108A CN117723682B CN 117723682 B CN117723682 B CN 117723682B CN 202311544108 A CN202311544108 A CN 202311544108A CN 117723682 B CN117723682 B CN 117723682B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glycerol
- sample
- solution
- gel
- hyaluronic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 34
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 32
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 32
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 597
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 143
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 112
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims description 52
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims description 52
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims description 47
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 40
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 29
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 29
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 21
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 claims description 21
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 10
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 claims 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 40
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 18
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 16
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 16
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 2
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 206010060932 Postoperative adhesion Diseases 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical group O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000013267 controlled drug release Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，属于化学分析技术领域。本发明所述的检测方法是将交联透明质酸或其盐凝胶在110～150℃下酸解，进行冻干，得到冻干样品；将冻干样品使用乙酸乙酯进行萃取，离心后取上清，过滤后，得到供试品溶液；然后根据交联透明质酸或其盐凝胶酸解后的丙三醇浓度来计算交联透明质酸或其盐凝胶的交联度。本发明提供的检测方法通过提高酸解温度，并将酸解后的交联透明质酸或其盐凝胶进行冻干，后续采用乙酸乙酯进行萃取提取，可以极大程度地降低无机盐和水在溶剂中的溶解度，增加了溶液稳定性和提取率，有效地提高了检测结果的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，属于化学分析技术领域。
背景技术
透明质酸(HA)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1-3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单元组成的线性多糖，每个双糖单元通过β-(1-4)糖苷键与另一个双糖单元连接起来。由于HA具有良好的保湿性、润滑性、黏弹性、非免疫原性以及对药物吸收的促进作用，因此在临床上得到了广泛应用。但是天然的HA存在水溶性强、在组织中易扩散和被酶降解、体内存留时间短等缺点，而经修饰和交联后得到的HA衍生物则可弥补这些缺陷。一些交联HA产品已被成功应用于预防术后粘连、治疗骨关节炎、软组织填充、组织工程和药物控释。
透明质酸一般以盐形式存在，即大多数情况下通过透明质酸钠进行使用。交联剂是用于透明质酸钠交联的物质，例如说1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。交联反应是大分子包含空间多位点的复杂反应。交联透明质酸钠的理化性质与交联度的大小密切相关。交联透明质酸钠是交联透明质酸钠上糖环活性基团与交联剂在一定条件下反应，交联形成的凝胶大分子，是交联HA衍生物的一种。交联透明质酸钠的交联度是指其分子间通过化学键结合的程度，交联度越高分子间的结合越紧密，材料的稳定性和耐用性就越好，体内降解速率相对来说就会越慢。但同时交联度过高会导致材料僵硬，失去一定的弹性和柔软性。因此，交联度是控制交联透明质酸钠产品质量的指标之一。
中国专利文献CN107561179A提供了一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法，公开了通过透明质酸酶酶解交联透明质酸或其盐，生成寡糖和二糖；再用液相色谱联合紫外吸收，分离和检测所述寡糖和二糖的色谱峰面积；最后经计算得出交联度。但是该专利方法需要先确定凝胶的酶解产物，检测过程中用到的精密仪器较多，过程繁琐，因此不适合工业生产过程中对产品质量的快速把控。
中国专利文献CN114280193A提供了一种凝胶交联度的检测方法，公开了根据凝胶酸解后的丙三醇浓度来计算凝胶的交联度，包括绘制丙三醇标准工作曲线、测定样品中丙三醇浓度以及计算样品的交联度等三个步骤。然而该专利方法存在以下几个明显的缺陷：第一、其测定过程中将凝胶样品酸解后于50～60℃下蒸干，再进行超声提取，但是蒸干后的样品状态坚硬且不易磨成粉末状态，超声提取过程中会损失部分的酸解样品，导致测试结果不准确。第二、该专利提取过程的超声时间过短的话，提取不完全；超声时间过长的话，提取溶剂易损失且影响溶液稳定性，导致测试结果不准确。第三、该专利的提取溶剂为无水乙醇，酸碱中和过程中产生大量的无机盐，部分未蒸干的水分及无机盐会溶解在无水乙醇中，进样采集的过程中会使仪器响应变低甚至无响应，既会导致测试结果不准确，还会损伤色谱柱。第四、该专利酸解温度为室温到100℃，实际检测时100℃以下酸解效果并不明显，导致测试结果不准确。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法。本发明的测定方法相较于现有技术检测过程更加简单，结果更为准确。
本发明的技术方案如下：
一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，包括步骤如下：
(1)供试品溶液制备
将交联透明质酸或其盐凝胶在110～150℃下酸解12～36h，冷却至20～30℃后中和至中性，再进行冻干，得到冻干样品；然后将冻干样品使用乙酸乙酯进行萃取，离心后取上清，过滤后，得到供试品溶液；
(2)丙三醇标准溶液制备
将丙三醇标准品用乙酸乙酯逐级稀释，得到不同浓度的丙三醇标准溶液；
(3)交联度的检测
将供试品溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液和丙三醇标准溶液的峰面积，然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中丙三醇的浓度；最后根据样品中丙三醇的浓度计算样品的交联度，计算公式如下：
式中：
C丙三醇——交联透明质酸钠凝胶中丙三醇的浓度，μg/mL；
V——加入乙酸乙酯的体积，mL；
ρ——交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/mL计；
ω——交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量，mg/mL；
m——交联透明质酸钠凝胶的质量，g；
92.094——丙三醇的相对分子质量；
401.3——透明质酸钠重复双糖单元相对分子质量。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述酸解为：向交联透明质酸或其盐凝胶中加入氢溴酸或硫酸，在120～130℃下酸解18～24h。
进一步优选的，所述氢溴酸或硫酸的浓度为0.4～1M；所述交联透明质酸或其盐凝胶与氢溴酸或硫酸的质量体积比为(2～3)：(5～10)，单位：g/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述冻干的具体程序为：在-30℃预冻5～10h，升温至-10℃保持2～5h，再升至-2℃下保持2～5h，继续升至20℃保持6～10h，最后升至40℃保持20～45h，将样品中的水分除尽。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述交联透明质酸或其盐凝胶与乙酸乙酯的质量体积比为(2～3)：(10～20)，单位：g/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述萃取的时间为5～10min；所述离心为在8000～14000r/min下离心5～10min。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述丙三醇标准溶液的浓度设置为6～96μg/ml中的系列浓度。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述气相色谱条件如下：
色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250～270℃；检测器：氢火焰离子化检测器；检测器温度：270～290℃；流速：0.5～1.0ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：70～90℃，保持5min，以10～20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1。
有益效果：
1、本发明提供的检测方法将交联透明质酸或其盐凝胶在110～150℃下酸解，改善了供试品溶解度低的问题，提高了检测结果的准确度。
2、本发明提供的检测方法将酸解后的交联透明质酸或其盐凝胶进行了冻干，得到的冻干样品状态松散，易提取，并且后续采用乙酸乙酯进行萃取提取，可以极大程度地降低无机盐和水在溶剂中的溶解度，增加了溶液稳定性和提取率，进一步地提高了检测结果的准确度。
3、本发明提供的检测方法优化了气相色谱条件，采用RBX-5色谱柱进行气相色谱，并设置分流比为1:1，有效改善了气相色谱峰型及分离度，更进一步地提高了检测结果的准确度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，包括步骤如下：
(1)供试品溶液制备
分别称取2.5140g、2.5066g、2.5230g交联透明质酸钠凝胶(交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量为19.42mg/mL)于顶空瓶中(记为样品1、样品2和样品3)，分别加入5ml的0.5M硫酸，压盖后在120℃下酸解18h，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着向冻干样品中加入10mL乙酸乙酯萃取5min，于14000r/min下离心5min，取上清液，过滤，得到供试品溶液，分别装于进样小瓶中备用；
(2)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇12.21mg置100ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为122.1μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入乙酸乙酯，分别逐级稀释成梯度浓度为6.10μg/ml、12.21μg/ml、24.42μg/ml、48.84μg/ml、97.68μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，分别装于进样小瓶中备用；
(3)空白溶液制备
量取5ml的0.5M硫酸于顶空瓶中，平行制备3份(标记为空白1～3)，压盖后在120℃下酸解18h，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着加入10mL乙酸乙酯萃取5min，于14000r/min下离心5min，取上清液，过滤，得到空白溶液，装于进样小瓶中备用；所述空白溶液指的是不加供试品的其他成分；
(4)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表1所示。
(5)交联度的检测
将供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：1ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：80℃，保持5min，以20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表2所示；
表1、***适用性结果
由表1可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.013％和0.012％，峰面积的RSD分别为0.84％和1.10％，说明***适用性结果良好。
表2、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 6.758 | 62.05 |
| 2 | 6.758 | 114.98 |
| 3 | 6.759 | 242.61 |
| 4 | 6.757 | 507.06 |
| 5 | 6.759 | 960.75 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表2数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝9.8949x+2.9614，R2＝0.9989；
然后根据标准工作曲线的线性方程计算供试品中丙三醇的浓度；最后根据供试品中丙三醇的浓度计算交联透明质酸钠凝胶的交联度，计算公式如下：
式中：
C丙三醇——交联透明质酸钠凝胶中丙三醇的浓度，μg/mL；
V——加入乙酸乙酯的体积，mL；
ρ——交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/mL计；
ω——交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量，19.42mg/mL；
m——交联透明质酸钠凝胶的质量，g；
92.094——丙三醇的相对分子质量；
401.3——透明质酸钠重复双糖单元相对分子质量。
空白溶液(指不含供试品的其他成分)、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果具体如表3所示。
表3、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果
| 供试品 | 保留时间 | 称样量/g | 峰面积 | 交联度％ |
| 空白1 | / | / | / | / |
| 空白2 | / | / | / | / |
| 空白3 | / | / | / | / |
| 样品1 | 6.757 | 2.5140 | 47.19 | 0.20 |
| 样品2 | 6.759 | 2.5066 | 45.77 | 0.19 |
| 样品3 | 6.757 | 2.5230 | 48.11 | 0.20 |
实施例2
一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，包括步骤如下：
(1)供试品溶液制备
称取2.5114g、2.5127g、2.5168g交联透明质酸钠凝胶(交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量为19.42mg/mL)于顶空瓶中(记为样品1、样品2和样品3)，分别加入5ml的1M氢溴酸，压盖后在130℃下酸解18h，取出后冷却至25℃，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着向冻干样品中加入10mL的乙酸乙酯萃取5min，于10000r/min下离心5min，取上清液，过滤，得到供试品溶液，分别装于进样小瓶中备用；
(2)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇12.17mg置100ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为121.7μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入乙酸乙酯，分别逐级稀释成梯度浓度为6.08μg/ml、12.17μg/ml、24.34μg/ml、48.68μg/ml、97.36μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，分别装于进样小瓶中备用；
(3)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表4所示。
(4)交联度的检测
将供试品溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：1ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：80℃，保持5min，以20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表5所示；
表4、***适用性结果
由表4可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.014％和0.013％，峰面积的RSD分别为0.21％和0.34％，说明***适用性结果良好。
表5、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 6.765 | 57.61 |
| 2 | 6.764 | 121.07 |
| 3 | 6.765 | 238.50 |
| 4 | 6.765 | 510.39 |
| 5 | 6.764 | 992.17 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表5数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝10.2813x-3.9354，R2＝0.9995；
然后根据线性方程计算供试品中丙三醇的浓度；最后根据供试品中丙三醇的浓度计算交联透明质酸钠凝胶的交联度，计算公式如下：
式中：
C丙三醇——交联透明质酸钠凝胶中丙三醇的浓度，μg/mL；
V——加入乙酸乙酯的体积，mL；
ρ——交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/mL计；
ω——交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量，19.42mg/mL；
m——交联透明质酸钠凝胶的质量，g；
92.094——丙三醇的相对分子质量；
401.3——透明质酸钠重复双糖单元相对分子质量。
供试品溶液的峰面积和交联度计算结果具体如表6所示。
表6、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果
| 供试品 | 保留时间 | 称样量/g | 峰面积 | 交联度％ |
| 样品1 | 6.765 | 2.5114 | 121.92 | 0.55 |
| 样品2 | 6.765 | 2.5127 | 124.75 | 0.56 |
| 样品3 | 6.766 | 2.5168 | 128.87 | 0.58 |
对比例1
参照中国专利文献CN114280193A提供的凝胶交联度的检测方法测定交联透明质酸钠凝胶的交联度，具体如下：
(1)供试品溶液制备
称取2.5480g、2.5405g、2.5490g交联透明质酸钠凝胶(交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量为19.42mg/mL)于顶空瓶中(记为样品1、样品2和样品3)，分别加入5ml的0.5M硫酸，压盖后常温酸解15h，加氢氧化钠溶液中和至中性，在恒温磁力搅拌器(55℃)蒸干，冷却至25℃，加10ml无水乙醇萃取，14000r/min离心5min，取上清液，过滤，得到供试品溶液，装于进样小瓶中备用；
(2)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇11.91mg置100ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为119.1μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入无水乙醇，分别逐级稀释成梯度浓度为5.96μg/ml、11.91μg/ml、23.82μg/ml、47.64μg/ml、95.28μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，分别装于进样小瓶中备用；
(3)空白溶液制备
量取5ml的0.5M硫酸于顶空瓶中，平行制备3份(标记为空白1～3)，压盖后常温酸解15h，加氢氧化钠溶液中和至中性，在恒温磁力搅拌器(55℃)蒸干，冷却至25℃，加10ml无水乙醇萃取，14000r/min离心5min，取上清液，过滤，得到空白溶液，装于进样小瓶中备用；所述空白溶液指的是不加供试品的其他成分；
(4)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表7所示。
(5)交联度的检测
将供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：DB-FFAP，30m×320μm×0.5μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：2ml/min；进样量：2μl；柱温：起始温度：70℃，以30℃/min升至220℃，保持5min；分流比：不分流；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表8所示；
表7、***适用性结果
由表7可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.021％和0.018％，峰面积的RSD分别为1.13％和41.39％。说明对比例1所述方法的***适用性结果较差，仪器响应降低。
表8、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 8.216 | 8953.89 |
| 2 | 8.218 | 18210.56 |
| 3 | 8.216 | 37695.86 |
| 4 | 8.215 | 79161.31 |
| 5 | 8.217 | 150406.48 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表8数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝1591.7978x+114.8514，R2＝0.9990；
然后根据线性方程计算供试品中丙三醇的浓度；最后根据供试品中丙三醇的浓度和中国专利文献CN114280193A提供的公式计算交联透明质酸钠凝胶的交联度。
空白溶液(指不含供试品的其他成分)、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果具体如表9所示。
表9、空白、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果
| 供试品 | 保留时间 | 称样量/g | 峰面积 | 交联度％ |
| 空白1 | 8.266 | / | 23.11 | / |
| 空白2 | 8.264 | / | 28.89 | / |
| 空白3 | 8.268 | / | 21.07 | / |
| 样品1 | 8.214 | 2.5480 | 1300.08 | 0.033 |
| 样品2 | 8.216 | 2.5405 | 970.63 | 0.024 |
| 样品3 | 8.214 | 2.5490 | 265.08 | 0.004 |
通过对比例1和实施例1的数据对比可以发现，对比例1中空白溶液在供试品出峰附近有干扰，且对比例1中的3份供试品溶液中丙三醇的峰面积逐步明显降低，说明随着样品采集次数的增加，仪器的响应逐渐降低，***适用性结果与供试品溶液采集前差距较大。而采用实施例1的方法所得的空白溶液基本无干扰，3份供试品溶液中丙三醇的峰面积正常，且仪器响应正常，供试品溶液采集前后的***适用性均合格。
试验例1、重复性验证
1、对照品重复性验证：
(1)测试溶液制备
分别称取12.20mg、11.63mg、12.50mg、11.51mg、12.30mg、12.02mg丙三醇于顶空瓶中(记为样品1～6)，分别加入5ml的1M氢溴酸，压盖后在120℃下酸解18h，取出后冷却至25℃，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着向冻干样品中加入100mL的乙酸乙酯萃取5min，于8000r/min下离心10min，取上清液，过滤，得到测试溶液，分别装于进样小瓶中备用；
(2)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇25.07mg置100ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为250.7μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入乙酸乙酯，分别逐级稀释成梯度浓度为50.14μg/ml、100.28μg/ml、120.34μg/ml、150.42μg/ml、250.70μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，分别装于进样小瓶中备用；
(3)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表10所示。
(4)交联度的检测
将测试溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到测试溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：1ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：80℃，保持5min，以20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表11所示；
表10、***适用性结果
由表10可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.043％和0.040％，峰面积的RSD分别为0.47％和0.53％，***适用性结果良好。
表11、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 6.764 | 502.49 |
| 2 | 6.761 | 1021.32 |
| 3 | 6.763 | 1256.23 |
| 4 | 6.765 | 1545.16 |
| 5 | 6.766 | 2512.45 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表11数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝9.9922x+24.8299，R2＝0.9991；
然后根据线性方程计算测试溶液中丙三醇的浓度；最后根据测试溶液中丙三醇的浓度计算回收率，计算公式如下：
式中：
C丙三醇——供试品中丙三醇的浓度，μg/mL；
m——丙三醇的质量，mg。
测试溶液的峰面积和回收率计算结果具体如表12所示。
表12、测试溶液的峰面积和回收率计算结果
由表12可知，6份测试溶液连续进样测定，平均回收率为100.4％，RSD为0.80％，表明本发明提供的检测方法重复性良好。
2、供试品重复性验证：
(1)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇12.59mg置100ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为125.9μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入乙酸乙酯，分别逐级稀释成梯度浓度为6.30μg/ml、12.59μg/ml、25.18μg/ml、50.36μg/ml、100.72μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，分别装于进样小瓶中备用；
(2)测试溶液制备
分别称取2.5106g、2.5119g、2.5006g、2.5214g、2.5149g、2.5318g交联透明质酸钠凝胶于顶空瓶中(记为样品1～6)，分别加入1ml丙三醇标准溶液2，再分别加入5ml的1M氢溴酸，压盖后在130℃下酸解18h，取出后冷却至25℃，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着向冻干样品中加入10mL的乙酸乙酯萃取5min，于10000r/min下离心5min，取上清液，过滤，得到测试溶液，分别装于进样小瓶中备用；
(3)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表13所示。
(4)交联度的检测
将测试溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到测试溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：1ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：80℃，保持5min，以20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表14所示；
表13、***适用性结果
由表13可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.013％和0.018％，峰面积的RSD分别为0.86％和1.16％，***适用性结果良好。
表14、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 6.761 | 62.18 |
| 2 | 6.761 | 124.36 |
| 3 | 6.760 | 261.16 |
| 4 | 6.763 | 496.21 |
| 5 | 6.759 | 1044.65 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表14数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝10.3668x-6.8918，R2＝0.9992；
然后根据线性方程计算测试溶液中丙三醇的浓度；最后根据供试品中丙三醇的浓度计算测试溶液的回收率，计算公式如下：
式中：
C测得量——测试溶液中丙三醇的浓度，μg/mL；
C检出量——供试品中丙三醇的浓度，12.5583μg/mL；
C加入量——加入的丙三醇浓度，μg/mL；
测试溶液的峰面积和回收率计算结果具体如表15所示。
表15、测试溶液的峰面积和回收率计算结果
由表15可知，6份测试溶液连续进样测定，平均回收率为98.9％，RSD为0.87％，表明本发明提供的检测方法重复性良好。
试验例2、准确性验证
本发明采用市售交联度为1％的交联透明质酸钠凝胶(交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量为20.13mg/mL)进行准确度验证，分别采用本发明方法和中国专利文献CN114280193A方法进行验证，具体过程如下：
1、本发明方法，具体如下：
(1)供试品溶液制备
称取2.5084g、2.5153g、2.5065g、2.5206g、2.5332g、2.5184g交联透明质酸钠凝胶于顶空瓶中(记为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5和样品6)，分别加入5ml的1M氢溴酸，压盖后在120℃下酸解24h(样品1、样品2、样品3)和36h(样品4、样品5、样品6)，取出后冷却至25℃，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着向冻干样品中加入10mL的乙酸乙酯萃取5min，于14000r/min下离心5min，取上清液，过滤，得到供试品溶液，分别装于进样小瓶中备用；
(2)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇12.36mg置100ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为123.6μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入乙酸乙酯，分别逐级稀释成梯度浓度为6.18μg/ml、12.36μg/ml、24.72μg/ml、49.44μg/ml、98.88μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，装于进样小瓶中备用；
(3)空白溶液制备
量取5ml的1M氢溴酸于顶空瓶中，平行制备3份(标记为空白1～3)，压盖后在120℃下酸解36h，加氢氧化钠溶液中和至中性，在-30℃预冻5h，升温至-10℃保持2h，再升至-2℃下保持2h，继续升至20℃保持6h，最后升至40℃保持22h，将样品中的水分除尽，接着加入10mL乙酸乙酯萃取5min，于14000r/min下离心5min，取上清液，过滤，得到空白溶液，装于进样小瓶中备用；所述空白溶液指的是不加供试品的其他成分；
(4)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表16所示。
(5)交联度的检测
将供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：1ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：80℃，保持5min，以20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表17所示；
表16、***适用性结果
由表16可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.014％和0.013％，峰面积的RSD分别为0.77％和0.69％，说明***适用性结果良好。
表17、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 6.757 | 62.31 |
| 2 | 6.757 | 119.31 |
| 3 | 6.756 | 251.74 |
| 4 | 6.757 | 498.45 |
| 5 | 6.758 | 979.27 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表17数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝9.9122x+2.4193，R2＝0.9998；
然后根据线性方程计算供试品中丙三醇的浓度；最后根据供试品中丙三醇的浓度计算交联透明质酸钠凝胶的交联度，计算公式如下：
式中：
C丙三醇——交联透明质酸钠凝胶中丙三醇的浓度，μg/mL；
V——加入乙酸乙酯的体积，mL；
ρ——交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/mL计；
ω——交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量，20.13mg/mL；
m——交联透明质酸钠凝胶的质量，g；
92.094——丙三醇的相对分子质量；
401.3——透明质酸钠重复双糖单元相对分子质量。
空白溶液(指不含供试品的其他成分)、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果具体如表18所示。
表18、空白、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果
2、中国专利文献CN114280193A方法，具体如下：
(1)供试品溶液制备
称取2.5067g、2.5055g、2.5149g、2.5142g、2.5231g、2.5160g交联透明质酸钠凝胶于顶空瓶中(记为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5和样品6)，分别加入5ml的1M氢溴酸，压盖后在120℃酸解24h(样品1、样品2、样品3)和36h(样品4、样品5、样品6)，加氢氧化钠溶液中和至中性，在恒温磁力搅拌器(55℃)蒸干，冷却至25℃，加10ml无水乙醇萃取，14000r/min离心5min，取上清液，过滤，得到供试品溶液，装于进样小瓶中备用；
(2)丙三醇标准溶液制备
精密称取丙三醇12.24mg置100ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为122.4μg/ml的标准品储备液；取标准品储备液加入无水乙醇，分别逐级稀释成梯度浓度为6.12μg/ml、12.24μg/ml、24.48μg/ml、48.96μg/ml、97.92μg/ml的丙三醇标准溶液，分别记为1、2、3、4、5，分别装于进样小瓶中备用；
(3)空白溶液制备
量取5ml的1M氢溴酸于顶空瓶中，平行制备3份(标记为空白1～3)，压盖后在压盖后在120℃下酸解36h，加氢氧化钠溶液中和至中性，在恒温磁力搅拌器(55℃)蒸干，冷却至25℃，加10ml无水乙醇萃取，14000r/min离心5min，取上清液，过滤，得到空白溶液，装于进样小瓶中备用；所述空白溶液指的是不加供试品的其他成分；
(4)***适用性测定
精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，连续测定5次(每次为一针，记为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)，计算5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％；所有供试品采集完成后，精密量取1μl丙三醇标准溶液3，注入气相色谱仪，作为回针对照，计算回针对照与之前5针丙三醇标准溶液3的保留时间和峰面积的RSD％，结果如表19所示。
(5)交联度的检测
将供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液、空白溶液和丙三醇标准溶液的峰面积；
气相色谱条件如下：色谱柱：DB-FFAP，30m×320μm×0.5μm；进样口温度：250℃；检测器：FID；检测器温度：270℃；流速：2ml/min；进样量：2μl；柱温：起始温度：70℃，以30℃/min升至220℃，保持5min；分流比：不分流；
然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，丙三醇标准溶液的峰面积具体如表20所示；
表19、***适用性结果
由表20可知，连续5针和回针对照的丙三醇标准溶液3保留时间的RSD分别为0.024％和0.023％，峰面积的RSD分别为0.80％和47.50％。说明中国专利文献CN114280193A所述方法的***适用性结果较差，仪器响应降低。
表20、丙三醇标准溶液的保留时间和峰面积
| 丙三醇标准溶液 | 保留时间/min | 峰面积 |
| 1 | 8.211 | 9158.58 |
| 2 | 8.213 | 18915.46 |
| 3 | 8.211 | 37641.77 |
| 4 | 8.211 | 79047.71 |
| 5 | 8.214 | 150190.65 |
以丙三醇的峰面积为Y轴，丙三醇标准溶液的浓度为X轴，根据表20数据绘制丙三醇标准工作曲线，曲线为y＝1542.0453x+479.4669，R2＝0.9991；
然后根据线性方程计算供试品中丙三醇的浓度；最后根据样品中丙三醇的浓度和中国专利文献CN114280193A提供的公式计算样品的交联度。
空白溶液(指不含供试品的其他成分)、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果具体如表21所示。
表21、空白、供试品溶液的峰面积和交联度计算结果
| 供试品 | 保留时间 | 称样量/g | 峰面积 | 交联度％ |
| 空白1 | 8.221 | / | 1986.24 | / |
| 空白2 | 8.220 | / | 1793.76 | / |
| 空白3 | 8.219 | / | 1680.51 | / |
| 样品1 | 8.210 | 2.5067 | 80835.83 | 1.14 |
| 样品2 | 8.213 | 2.5055 | 60963.52 | 0.86 |
| 样品3 | 8.212 | 2.5149 | 45632.28 | 0.64 |
| 样品4 | 8.212 | 2.5142 | 40667.35 | 0.57 |
| 样品5 | 8.214 | 2.5231 | 28943.07 | 0.40 |
| 样品6 | 8.216 | 2.5160 | 9365.66 | 0.13 |
通过本实验例的表18和表21的数据对比可知，本发明提供的检测方法中空白溶液在丙三醇出峰处无干扰，供试品在120℃下酸解24h和36h的交联度无明显差异，说明供试品在24h已完全酸解，最终测定的交联度为1.09～1.10％，误差不超过10％。而中国专利文献CN114280193A所述方法中空白溶液在丙三醇出峰位置处明显出现了干扰，最终测定的交联度为0.13～1.14％，误差明显超过了10％，且随着采集次数的增多误差越来越大。说明本发明提供的检测方法通过提高酸解温度，并将酸解后的交联透明质酸或其盐凝胶进行冻干，使得样品状态松散，易提取，并且后续采用乙酸乙酯进行萃取提取，可以极大程度地降低无机盐和水在溶剂中的溶解度，增加了溶液稳定性和提取率，有效地提高了检测结果的准确度。
Claims (5)
1.一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法，其特征在于，包括步骤如下：
（1）供试品溶液制备
将交联透明质酸或其盐凝胶在在120~130℃下酸解18~24h，冷却至20~30℃后中和至中性，再进行冻干，得到冻干样品；然后将冻干样品使用乙酸乙酯进行萃取，离心后取上清，过滤后，得到供试品溶液；
所述酸解为：向交联透明质酸或其盐凝胶中加入氢溴酸或硫酸；所述交联透明质酸或其盐凝胶和乙酸乙酯的质量体积比为（2~3）：（10~20），单位：g/mL；
（2）丙三醇标准溶液制备
将丙三醇标准品用乙酸乙酯逐级稀释，得到不同浓度的丙三醇标准溶液；
（3）交联度的检测
将供试品溶液和丙三醇标准溶液进行气相色谱测定，得到供试品溶液和丙三醇标准溶液的峰面积，然后根据丙三醇标准溶液的峰面积绘制丙三醇标准工作曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中丙三醇的浓度；最后根据样品中丙三醇的浓度计算样品的交联度，计算公式如下：
式中：
C丙三醇——交联透明质酸钠凝胶中丙三醇的浓度，μg/mL；
V——加入乙酸乙酯的体积，mL；
ρ——交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/mL计；
ω——交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠的含量，mg/mL；
m——交联透明质酸钠凝胶的质量，g；
92.094——丙三醇的相对分子质量；
401.3——透明质酸钠重复双糖单元相对分子质量；
所述气相色谱条件如下：
色谱柱：RBX-5，30m×320μm×0.25μm；进样口温度：250~270℃；检测器：氢火焰离子化检测器；检测器温度：270~290℃；流速：0.5~1.0ml/min；进样量：1μl；柱温：起始温度：70~90℃，保持5min，以10~20℃/min升至260℃，保持15min；分流比1:1。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氢溴酸或硫酸的浓度为0.4~1M；所述交联透明质酸或其盐凝胶与氢溴酸或硫酸的质量体积比为（2~3）：（5~10），单位：g/mL。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述冻干程序为：在-30℃预冻5~10h，升温至-10℃保持2~5h，再升至-2℃下保持2~5h，继续升至20℃保持6~10h，最后升至40℃保持20~45h，将样品中的水分除尽。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述萃取的时间为5~10min；所述离心为在8000~14000r/min下离心5~10min。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述丙三醇标准溶液的浓度设置为6~96μg/ml中的系列浓度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311544108.2A CN117723682B (zh) | 2023-11-20 | 2023-11-20 | 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311544108.2A CN117723682B (zh) | 2023-11-20 | 2023-11-20 | 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117723682A CN117723682A (zh) | 2024-03-19 |
| CN117723682B true CN117723682B (zh) | 2024-06-11 |
Family
ID=90209674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311544108.2A Active CN117723682B (zh) | 2023-11-20 | 2023-11-20 | 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117723682B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009270966A (ja) * | 2008-05-08 | 2009-11-19 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 哺乳動物由来の生体液試料中のヒアルロン酸の分子量分布の測定方法 |
| CN103910886A (zh) * | 2014-03-24 | 2014-07-09 | 海南大学 | 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 |
| CN107561179A (zh) * | 2017-08-18 | 2018-01-09 | 上海景峰制药有限公司 | 一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法 |
| CN112147095A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-29 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法 |
| CN112206207A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-01-12 | 平顶山学院 | 负载抗菌剂的透明质酸纳米胶束的制备方法 |
| EP3838927A1 (fr) * | 2019-12-17 | 2021-06-23 | Commissariat À L'Énergie Atomique Et Aux Énergies Alternatives | Acide hyaluronique réticulé et son utilisation pour limiter la récidive d'une tumeur |
| CN113504321A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-15 | 杭州协合医疗用品有限公司 | 一种同时检测残留清洗剂正己烷和乙酸乙酯的方法 |
| WO2022060235A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Pharmfactor Sp. Z O.O. | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes |
| CN114280193A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-05 | 青岛琛蓝海洋生物工程有限公司 | 一种凝胶交联度的检测方法 |
| CN114646708A (zh) * | 2022-05-23 | 2022-06-21 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种测定透明质酸钠含量的方法 |
-
2023
- 2023-11-20 CN CN202311544108.2A patent/CN117723682B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009270966A (ja) * | 2008-05-08 | 2009-11-19 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 哺乳動物由来の生体液試料中のヒアルロン酸の分子量分布の測定方法 |
| CN103910886A (zh) * | 2014-03-24 | 2014-07-09 | 海南大学 | 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 |
| CN107561179A (zh) * | 2017-08-18 | 2018-01-09 | 上海景峰制药有限公司 | 一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法 |
| EP3838927A1 (fr) * | 2019-12-17 | 2021-06-23 | Commissariat À L'Énergie Atomique Et Aux Énergies Alternatives | Acide hyaluronique réticulé et son utilisation pour limiter la récidive d'une tumeur |
| WO2022060235A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Pharmfactor Sp. Z O.O. | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes |
| CN112147095A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-29 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法 |
| CN112206207A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-01-12 | 平顶山学院 | 负载抗菌剂的透明质酸纳米胶束的制备方法 |
| CN113504321A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-15 | 杭州协合医疗用品有限公司 | 一种同时检测残留清洗剂正己烷和乙酸乙酯的方法 |
| CN114280193A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-05 | 青岛琛蓝海洋生物工程有限公司 | 一种凝胶交联度的检测方法 |
| CN114646708A (zh) * | 2022-05-23 | 2022-06-21 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种测定透明质酸钠含量的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Purification of crosslinked, highly viscous and viscoelastic hyaluronic acid hydrogels by dynamic diafiltration;Patrik Vukovic et al.;Separation andPurificationTechnology;20221006;全文 * |
| 强化交联促进透明质酸凝胶的抗酶解能力;陆柳伸 等;食品与生物技术学报;20191231;全文 * |
| 顶空气相色谱法测定交联透明质酸钠凝胶中异丙醇的残留量;李红梅 等;生物医学工程研究;20150915(第03期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117723682A (zh) | 2024-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Männel et al. | Isolation and chemical characterization of the enterobacterial common antigen | |
| Takeuchi et al. | Variation in glycosaminoglycan components of breast tumors | |
| Restaino et al. | A multi-analytical approach to better assess the keratan sulfate contamination in animal origin chondroitin sulfate | |
| Mathews et al. | The molecular weight and viscosity of chondroitin-sulfuric acid | |
| US20080188585A1 (en) | Photocrosslinked-polysaccharide composition and production process of the same | |
| CN110331178A (zh) | 一种酶切法制备小分子透明质酸的方法及所得小分子透明质酸与其应用 | |
| CN105131153A (zh) | 绵羊依诺肝素钠化合物的制备方法及其化合物与应用 | |
| CN117723682B (zh) | 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 | |
| EP3398971A1 (en) | Sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof | |
| CN114236014B (zh) | 隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法 | |
| Spelta et al. | SAX-HPLC and HSQC NMR spectroscopy: orthogonal methods for characterizing heparin batches composition | |
| Cheetham et al. | An HPLC method for the determination of acetyl and pyruvyl groups in polysaccharides | |
| Linhardt et al. | New methodologies in heparin structure analysis and the generation of LMW heparins | |
| BRPI0708989A2 (pt) | processo para isolamento e estabilizaÇço de aminoglicanos de baixo peso molecular a partir de restos de casca de ovo | |
| Lamari et al. | Profiling of the eye aqueous humor in exfoliation syndrome by high-performance liquid chromatographic analysis of hyaluronan and galactosaminoglycans | |
| Bartold et al. | Molecular weight estimation of sulfated glycosaminoglycans in human gingivae | |
| Bendazzoli et al. | Determination of dermatan sulfate and chondroitin sulfate as related substances in heparin by capillary electrophoresis | |
| ES2843492T3 (es) | Método de purificación del sulfato de condroitina | |
| Lee et al. | NMR of heparin API: investigation of unidentified signals in the USP-specified range of 2.12–3.00 ppm | |
| CN110431155A (zh) | 低分子量透明质酸的制备方法 | |
| CN114280193A (zh) | 一种凝胶交联度的检测方法 | |
| Chaidedgumjorn et al. | Conductivity detection for molecular mass estimation of per-O-sulfonated glycosaminoglycans separated by high-performance size-exclusion chromatography | |
| CN111057115B (zh) | 一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用 | |
| Tuvikene et al. | Structure and thermal stability of pyruvated carrageenans from the red alga Coccotylus truncatus | |
| Pippen et al. | Effect of degree of esterification on viscosity and gelation behavior of pectin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |