CN109097385A - 一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产β‑胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法，该方法首先优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子，获得opt crtYPa基因，然后用含启动子prrnB的opt crtYPa基因和成团泛菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa基因无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3，再敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6‑磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，最后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶基因dxs，得到产β‑胡萝卜素类球红细菌工程菌，该菌株经发酵培养，β‑胡萝卜素的含量可达30mg/g DCW。

Description

一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法
技术领域
本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及一种利用代谢工程改造类球红细菌构建产β-胡萝卜素菌株的方法。
背景技术
β-胡萝卜素广泛存在于胡萝卜、枸杞等绿色蔬菜和黄色、橙色水果中，由于它的不饱和结构，使它具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，能够有效提高机体的免疫功能，目前已被广泛应用于功能食品、医药保健和化妆品等领域，国际市场需求日益扩增。
天然β-胡萝卜素主要来源于植物提取和微生物发酵，但植物来源的β-胡萝卜素生产成本因受原材料的限制而居高不下，而化学合成的β-胡萝卜素多为全反式结构、生物活性低且安全性备受质疑。微生物发酵法由于易于大规模可持续生产、环境友好和成本低等特性，且随着现代代谢工程技术的快速发展，利用微生物发酵生产β-胡萝卜素已成为必然趋势。
目前，唯一用于工业化生产β-胡萝卜素的菌株是三孢布拉霉(Blakesleatrispora)，但是三孢布拉霉缺乏有效的分子操作技术，且其菌体分为正负菌，代谢调控复杂，其发酵中也存在不少的问题，如发酵工艺较复杂，不稳定，周期长等。类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)作为一个新的平台细胞生产β-胡萝卜素具有许多天然优势：(1)类球红细菌属于光合细菌，具有光合作用基因簇，上面有7个类胡萝卜素合成基因，按照编码顺序依次为crtF、crtE、crtD、crtC、crtB、crtI和crtA，这几乎满足了β-胡萝卜素的生物合成；(2)类球红细菌具有丰富的内膜***，非常有利于脂溶性化合物β-胡萝卜素在细胞膜上的积累，同时在黑暗条件下，其细胞膜容易发生褶皱内陷，大大增加了β-胡萝卜素在细胞膜上的积累；(3)类球红细菌的遗传操作方法成熟，目前已成功用于辅酶Q10、脂肪酸和5-氨基乙酰丙酸等高附加值天然化合物的大规模发酵生产，为进一步探索利用类球红细菌生产β-胡萝卜素打下良好的基础；(4)类球红细菌自身可以在厌氧光照条件下合成类胡萝卜素，而利用厌氧光合发酵生产β-胡萝卜素必将大大节约发酵成本！
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种产β-胡萝卜素的类球红细菌工程菌株以及该菌株的构建方法。
解决上述技术问题所采用的类球红细菌工程菌株由下述方法构建得到：首先优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子，获得opt crtYPa基因，然后用含启动子prrnB的opt crtYPa基因和成团泛菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa基因无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3，再敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，最后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，得到产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌。
上述opt crtYPa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述用含启动子prrnB的opt crtYPa基因和crtIPa基因无痕替换crtI3基因的方法为：利用引物opt-crtYPa-F和opt-crtYPa-R，用保真酶Pfu PCR扩增含启动子prrnB的optcrtYPa基因；以成团泛菌CGMCC 1.2244的基因为模板，利用引物opt-crtIPa-F和opt-crtIPa-R，用保真酶Pfu PCR扩增成团泛菌CGMCC 1.2244的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa；利用引物opt-crtIPaYPa-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的含启动子prrnB的opt crtYPa基因与crtIPa基因，得到opt crtIPaYPa基因；以类球红细菌ATH2.4.1的基因为模板，利用引物opt-crtIPaYPa-up-F和opt-crtIPaYPa-up-R，用保真酶PfuPCR扩增crtI3基因的上游同源臂，利用引物opt-crtIPaYPa-down-F和opt-crtIPaYPa-down-R，用保真酶PfuPCR扩增crtI3基因的下游同源臂；利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的上游同源臂与opt crtIPaYPa基因，再利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-down-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的下游同源臂，实现crtI3基因的上游同源臂-optcrtIPaYPa基因-crtI3基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△crtI3::optcrtIPaYPa片段；将△crtI3::opt crtIPaYPa片段***到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和XbaI双酶切位点，获得质粒pK18-△crtI3::opt crtIPaYPa，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△crtI3::opt crtIPaYPa，以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合，得到菌株RC1。
上述敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC的方法为：以类球红细菌ATH2.4.1的基因为模板，利用引物crtC-up-F和crtC-up-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtC基因的上游同源臂，利用引物crtC-down-F和crtC-down-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtC基因的下游同源臂；利用引物crtC-up-F与crtC-down-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtC基因的上游同源臂与下游同源臂，得到△crtC片段；将△crtC片段***到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△crtC，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1Com△crtC，以RC1为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株RC2。
上述敲除类球红细菌内源的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的方法为：以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物zwf-up-F1和zwf-up-R1，用保真酶Pfu PCR扩增zwf基因的上游同源臂，利用引物zwf-down-F1和zwf-down-R1，用保真酶PfuPCR扩增zwf基因的下游同源臂；利用引物zwf-up-F1与zwf-down-R1，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂，得到△zwf片段；将△zwf片段***到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△zwf，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△zwf，以RC2为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株RC3。
上述在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的方法为：以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物dxs-F和dxs-R，用保真酶Pfu PCR扩增dxs基因，利用引物zwf-up-F2和zwf-up-R2，用保真酶PfuPCR扩增zwf基因的上游同源臂，利用引物zwf-down-F2和zwf-down-R2，用保真酶Pfu PCR扩增类zwf基因的下游同源臂；利用引物zwf-up-F2与dxs-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因，再利用引物zwf-up-F2与zwf-down-R2，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的下游同源臂，实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△zwf::dxs片段；将△zwf::dxs片段***到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△zwf::dxs，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△zwf::dxs，以RC3为受体菌株进行双亲接合，得到产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌。
上述各引物序列如下：
opt-crtYPa-F：CAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGGC
opt-crtYPa-R：TGTAGTTCTATTCATTCACTGCATCGCCTGCTG
opt-crtIPa-F：AGGCGATGCAGTGAATGAATAGAACT
opt-crtIPa-R：TCAAGCCAGATCCTCCAGCA
opt-crtIPaYPa-F：AGTTCGCGCCCAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGG
opt-crtIPaYPa-R：CAGAGGCAATCATTCAAGCCAGATCCTCCAGCAT
opt-crtIPaYPa-up-F：CCGGAATTCCTCTCGTCGGCCATCTTG
opt-crtIPaYPa-up-R：GTTTTTCGTTGGGCGCGAACTCCTGCA
opt-crtIPaYPa-down-F：GGATCTGGCTTGAATGATTGCCTCTGCCGATCT
opt-crtIPaYPa-down-R：CTAGTCTAGACGCCCGAGAAACTGTCGTAG
crtC-up-F：CCGGAATTCTCATCATGAACGGACCGCC
crtC-up-R：GGGATGTCAGGAAAAGGACACGCCGTCGATATACCA
crtC-down-F：ATCGACGGCGTGTCCTTTTCCTGACATCCCGGCC
crtC-down-R：CCCCAAGCTTGCCTTCAACACGCTCTGGAC
zwf-up-F1：CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGG
zwf-up-R1：GGCCTCTCAGCGGATAACCATGGGCTCTCCCGC
zwf-down-F1：GGAGAGCCCATGGTTATCCGCTGAGAGGCCGCCG
zwf-down-R1：CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC
zwf-up-F2：CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGGC
zwf-up-R2：GTCGGTCATGGGCTCTCCCGCTGCCT
dxs-F：GAGAGCCCATGACCGACAGACCCTGCAC
dxs-R：GGCGGCCTCTTCCGATCGCCCTCCTC
zwf-down-F2：CGATCGGAAGAGGCCGCCGGGC
zwf-down-R2：CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子，获得optcrtYPa基因，然后用含启动子prrnB的optcrtYPa基因和成团泛菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa基因无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3，在类球红细菌中构建了β-胡萝卜素合成通路。
2、本发明通过敲除类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，同时整合表达类球红细菌MEP途径的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，使类球红细菌生产β-胡萝卜素的含量达到30mg/gDCW。
3、本发明构建的产β-胡萝卜素工程菌株的遗传操作是在类球红细菌的染色体上进行的，不需要抗性或营养缺陷的维持，且菌株稳定性强。
附图说明
图1是构建类球红细菌生物合成β-胡萝卜素工程菌株整体策略图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例中所用的DNA Maker(MakerⅢ、MakerⅣ)、细菌基因组DNA提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒(离心柱型)及普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR所用的Tap、Pfu酶类购自北京汇天东方科技有限公司，高保真酶KOD-Plus购自日本TOYOBO公司；限制性内切酶类和pK18mobsacB质粒均购自Takara公司；引物合成均由上海Invitrogen|Thermo Fisher Scientific完成；DNA测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
实施例中各引物序列如下：
opt-crtYPa-F：CAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGGC
opt-crtYPa-R：TGTAGTTCTATTCATTCACTGCATCGCCTGCTG
opt-crtIPa-F：AGGCGATGCAGTGAATGAATAGAACT
opt-crtIPa-R：TCAAGCCAGATCCTCCAGCA
opt-crtIPaYPa-F：AGTTCGCGCCCAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGG
opt-crtIPaYPa-R：CAGAGGCAATCATTCAAGCCAGATCCTCCAGCAT
opt-crtIPaYPa-up-F：CCGGAATTCCTCTCGTCGGCCATCTTG
opt-crtIPaYPa-up-R：GTTTTTCGTTGGGCGCGAACTCCTGCA
opt-crtIPaYPa-down-F：GGATCTGGCTTGAATGATTGCCTCTGCCGATCT
opt-crtIPaYPa-down-R：CTAGTCTAGACGCCCGAGAAACTGTCGTAG
crtC-up-F：CCGGAATTCTCATCATGAACGGACCGCC
crtC-up-R：GGGATGTCAGGAAAAGGACACGCCGTCGATATACCA
crtC-down-F：ATCGACGGCGTGTCCTTTTCCTGACATCCCGGCC
crtC-down-R：CCCCAAGCTTGCCTTCAACACGCTCTGGAC
zwf-up-F1：CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGG
zwf-up-R1：GGCCTCTCAGCGGATAACCATGGGCTCTCCCGC
zwf-down-F1：GGAGAGCCCATGGTTATCCGCTGAGAGGCCGCCG
zwf-down-R1：CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC
zwf-up-F2：CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGGC
zwf-up-R2：GTCGGTCATGGGCTCTCCCGCTGCCT
dxs-F：GAGAGCCCATGACCGACAGACCCTGCAC
dxs-R：GGCGGCCTCTTCCGATCGCCCTCCTC
zwf-down-F2：CGATCGGAAGAGGCCGCCGGGC
zwf-down-R2：CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC
crtIPaYPa-S-F：CGATCATGTGCGAGATGG
crtIPaYPa-S-R：TGTTGGTGAGCTGCATGG
实施例中各启动子序列如下：
BBa_J95025：AAATTGTTACGGAGCCCAAAAAATCCGCTTGCGCCCGGGGCCGTCTGCTCCTAGAAACCGCTTCACCGAGACGAAGACCGGCAGCGCCGGACGGAGACGAGGGAGCGGATGACAGAAACGTCGGCCGCGACAATTGAAGATGAGGCGGACGGGATCGCTGGTTGTCTG
BBa_J95027：AGCCCAAAAAATCCGCTTGCGCCCGGGGCCGTCTGCTCCTAGAAACCGCTTCATGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCACA
BBa_J95026：AGCCCAAAAAATCCGCTTGCGCCCGGGGCCGTCTGCTCCTAGAAACCGCTTCAAATTGTGAGCGGATAACAATT
tac：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG
prrnB：CAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGGCTGCGACATGAAATTGTTACGGAGCCCAAAAAATCCGC
实施例1
根据图1所示的类球红细菌中β-胡萝卜素生物合成途径，构建产β-胡萝卜素的类球红细菌工程菌株，具体构建方法如下：
1、优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子及启动子
成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa经密码子优化，获得核苷酸序列如SEQID NO:1所示的opt crtYPa基因(由南京金斯瑞生物技术有限公司合成)。将含5个不同启动子BBa_J95025、BBa_J95027、BBa_J95026、tac和prrnB的游离质粒pIND4-opt crtYPa(由南京金斯瑞生物技术有限公司合成)分别热激转化进入S17-1感受态，转化操作方法为：用移液枪取1μL质粒与S17-1感受态细胞轻轻混匀，冰浴静置30min，42℃金属浴热激90s，冰浴2min；然后在超净台中加入1mL无抗液体LB，37℃、200rpm复壮45min；取50μL复壮液均匀涂布于含50μg/mL Km抗性的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，得到5个供体菌株S17-1pIND4-opt crtYPa，以本课题组的RL1菌株(Su A,Chi S,Li Y,et al.Journal ofagricultural and food chemistry,2018)为受体菌株，进行双亲接合，得到五个不同的菌株，这五个不同的菌株分别进行发酵培养，发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L、玉米浆干粉3g/L、谷氨酸钠3g/L、NaCl 2.8g/L、(NH4)2SO4 3g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4 6.3g/L、CaCO3 2g/L、烟酸1mg/L、烟酸硫胺1mg/L、生物素15μg/L。按2％的接种量转接至50％装液量的发酵培养基中，34℃ 150rpm黑暗培养4d。HPLC定量分析β-胡萝卜素的含量，当opt crtYPa基因的启动子为prrnB时，β-胡萝卜素的含量最高。
2、以含启动子prrnB的opt crtYPa基因和crtIPa基因无痕替换类球红细菌自身的crtI3基因
以合成的含启动子prrnB的opt crtYPa基因(由南京金斯瑞生物技术有限公司合成)为模板，设计引物opt-crtYPa-F和opt-crtYPa-R，利用保真酶Pfu PCR扩增含启动子prrnB的opt crtYPa基因，PCR扩增体系为：2×Pfu PCR mix 10μL、opt-crtYPa-F(10μM)1μL、opt-crtYPa-R(10μM)1μL、合成基因(20μg/μL)1μL、ddH2O 7μL，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸3min共35个循环后，72℃延伸10min。用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增的含启动子prrnB的opt crtYPa基因片段(1259bp)；以成团泛菌CGMCC 1.2244的基因为模板，设计引物opt-crtIPa-F和opt-crtIPa-R，利用保真酶PfuPCR扩增opt crtIPa基因，PCR扩增体系为：2×Pfu PCR mix 10μL、opt-crtIPa-F(10μM)1μL、opt-crtIPa-R(10μM)1μL、合成基因(20μg/μL)1μL、ddH2O 7μL，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸2min共35个循环后，72℃延伸10min。回收扩增的opt crtIPa基因片段(1480bp)；设计引物opt-crtIPaYPa-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的opt crtYPa基因与crtIPa基因，重叠延伸PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer for KOD-Plus 5μL、dNTPs(2mM)5μL、MgSO4(25mM)2μL、opt-crtIPaYPa-F(10μM)1.5μL、opt-crtIPaYPa-R(10μM)1.5μL、opt crtYPa基因片段(20μg/μL)2μL、opt crtIPa基因片段(20μg/μL)2μL、KOD-Plus(1U/μL)1μL、ddH2O 30μL，反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、65℃退火30s、68℃延伸3min共35个循环后，68℃延伸10min。回收opt crtIPaYPa基因片段(2746 bp)。
以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，设计引物opt-crtIPaYPa-up-F和opt-crtIPaYPa-up-R，利用保真酶Pfu PCR扩增crtI3基因的上游同源臂，PCR扩增体系为：2×PfuPCR mix 10μL、opt-crtIPaYPa-up-F(10μM)1μL、opt-crtIPaYPa-up-R(10μM)1μL、类球红细菌基因(20μg/μL)1μL、ddH2O 7μL，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。回收crtI3的上游同源臂基因片段(453bp)。
以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，设计引物opt-crtIPaYPa-down-F和opt-crtIPaYPa-down-R，利用保真酶Pfu PCR扩增crtI3的下游同源臂，PCR扩增体系为：2×PfuPCR mix 10μL、opt-crtIPaYPa-down-F(10μM)1μL、opt-crtIPaYPa-down-R(10μM)1μL、类球红细菌基因(20μg/μL)1μL、ddH2O 7μL，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收crtI3的下游同源臂基因片段(411bp)。
利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的上游同源臂与opt crtIPaYPa基因，重叠延伸PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer for KOD-Plus 5μL、dNTPs(2mM)5μL、MgSO4(25mM)2μL、opt-crtIPaYPa-up-F(10μM)1.5μL、opt-crtIPaYPa-R(10μM)1.5μL、opt crtIPaYPa基因片段(20μg/μL)2μL、crtI3的上游同源臂基因片段(20μg/μL)2μL、KOD-Plus(1U/μL)1μL、ddH2O 30μL，反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、64℃退火30s、68℃延伸2min共35个循环后，68℃延伸10min。回收crtI3基因的上游同源臂-optcrtIPaYPa基因连接片段。再利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与crtIPaYPa-down-R，用高保真酶KOD-Plus连接扩增crtI3基因的下游同源臂，重叠延伸PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer for KOD-Plus 5μL、dNTPs(2mM)5μL、MgSO4(25mM)2μL、opt-crtIPaYPa-up-F(10μM)1.5μL、crtIPaYPa-down-R(10μM)1.5μL、crtI3基因的上游同源臂-optcrtIPaYPa基因连接片段(20μg/μL)2μL、crtI3的下游同源臂基因片段(20μg/μL)2μL、KOD-Plus(1U/μL)1μL、ddH2O 30μL，反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、64℃退火30s、68℃延伸150s共30个循环后，68℃延伸10min。重叠延伸PCR结束后，加10μL Taq Mix酶，混匀后继续72℃PCR延伸30min，回收crtI3基因的上游同源臂-optcrtIPaYPa基因-crtI3基因的下游同源臂三个基因的连接片段，得到△crtI3::opt crtIPaYPa片段。
将△crtI3::opt crtIPaYPa片段用EcoRⅠ和XbaI双酶切后经T4连接酶连接到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和XbaI双酶切位点，双酶切反应体系为：10×M buffer 5μL、EcoRⅠ2.5μL、XbaI 2.5μL、△crtI3::crtIPaYPa/pK18mobsacB 40μL，反应条件为：37℃酶切2h，获得质粒pK18-△crtI3::opt crtIPaYPa，将该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△crtI3::opt crtIPaYPa，以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合，得到菌株RC1，保存菌种。
3、敲除crtC基因阻断β-胡萝卜素代谢消耗途径
按照步骤1中构建菌株RC的方法，以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物crtC-up-F和crtC-up-R，用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtC的上游同源臂(427bp)，利用引物crtC-down-F和crtC-down-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtC基因的下游同源臂(428bp)，PCR扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。利用引物crtC-up-F与crtC-down-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtC基因的上游同源臂与下游同源臂，重叠延伸PCR扩增反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、68℃延伸60s共35个循环后，68℃延伸10min，得到△crtC片段；将△crtC片段***到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△crtC，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△crtC，以RC1为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株RC2。
4、敲除中心代谢途径关键基因zwf阻断磷酸戊糖途径对碳源的竞争
按照步骤1中构建菌株RC的方法，以类球红细菌ATH2.4.1的基因为模板，利用引物zwf-up-F1和zwf-up-R1，用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂(582bp)，利用引物zwf-down-F1和zwf-down-R1，用保真酶Pfu PCR扩增zwf基因的下游同源臂(639bp)，PCR扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。利用引物zwf-up-F1与zwf-down-R1，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂，重叠延伸PCR扩增反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、67℃退火30s、68℃延伸40s共35个循环后，68℃延伸10min，得到△zwf片段；将△zwf片段***到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△zwf，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△zwf，以RC2为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株RC3。
5、整合表达MEP途径限速基因dxs提高β-胡萝卜素直接前体物质的供应
按照步骤1中构建菌株RC的方法，以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物dxs-F和dxs-R，用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(1953 bp)，PCR扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸4min共30个循环后，72℃延伸10min。利用引物zwf-up-F2和zwf-up-R2，用保真酶PfuPCR扩增zwf基因的上游同源臂(560bp)，利用引物zwf-down-F2和zwf-down-R2，用保真酶PfuPCR扩增zwf基因的下游同源臂(614bp)，PCR扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。利用引物zwf-up-F2与dxs-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因，再利用引物zwf-up-F2与zwf-down-R2，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的下游同源臂，实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，重叠延伸PCR扩增反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、68℃退火30s、68℃延伸100s共35个循环后，68℃延伸10min，得到△zwf::dxs片段；将△zwf::dxs片段***到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△zwf::dxs，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1 Com△zwf::dxs，以RC3为受体菌株进行双亲接合，得到β-胡萝卜素类球红细菌工程菌。
发明人采用实施例1得到的类球红细菌工程菌进行发酵培养，发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L、玉米浆干粉3g/L、谷氨酸钠3g/L、NaCl 2.8g/L、(NH4)2SO4 3g/L、KH2PO43g/L、MgSO4 6.3g/L、CaCO3 2g/L、烟酸1mg/L、烟酸硫胺1mg/L、生物素15μg/L。按6％的接种量转接至60％装液量的发酵培养基中，34℃150rpm黑暗培养。在β-胡萝卜素类球红细菌工程菌早期发酵阶段(0-48h)，发酵液为浅黄色，然后慢慢地变为黄色(48-96h)直至橘黄色(96-168h)。类球红细菌工程菌发酵168h时，生物量达到6.5g/L，经HPLC定量分析，β-胡萝卜素含量为30mg/gDCW。
序列表
<110> 西安海斯夫生物科技有限公司
<120> 一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法
<141> 2018-07-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> Erwinia herbicola
<400> 1
atgccccgct atgacctcat cctggtgggc gcgggcctcg ccaacggcct gatcgccctc 60
cgcctgcgcc agcagcgccc ctcgctgcgc atcctgctga tcgacgccga gcgcgagccc 120
ggcgccaacc acacctggtc gttccatgcg gaggacctca cggagaccca gcaccgctgg 180
atcgccccgc tcgtggtgca ccattggccg ggctatgagg tgcgcttccc ccagcgctcg 240
cgctcgctca actcgggcta tttctgcgtg acctcggagc gcttcgtgca ggtgatccgc 300
gaccgcttcg cccccgacct gctcctgaac acccgcgtgg ccggcatcgc ctcgcgcacg 360
gtgaccctgg acgacggccg cgtgctggag tcggacgcgg tgatcgacgg ccgcggctac 420
cagccggacg ccgcgctgtg catgggcttc cagtcgttcg tgggccagga gtggcagctg 480
tcggagcccc atggcctgac ggcccccatc atcatggacg ccaccgtgga ccagcaggcc 540
ggctaccgct tcgtgtattc gctcccgttc tcggccgaca ccctcctgat cgaggacacg 600
cattacatcg acaacgccac cctggagggc gaccgcgccc gccagaacat ccgcgcctat 660
gcggcccagc agggctggcg cctcgaccgc ctcctgcgcg aggagcaggg cgccctcccc 720
atcacgctca ccggcgacgt ggcggccttc tggcagaagc atgacctgcc ctgctcgggc 780
ctccgcgccg gcctgttcca tccgacgacc ggctattcgc tgcccctggc ggtggccctg 840
gcggaccgcc tggcccagat gcagaccttc acgtcggaga ccctgcacgc gacgatccag 900
cagttcgcct cgcaggcctg gcagcagcag cgcttcttcc gcatgctcaa ccgcatgctc 960
ttcctggccg gcccggcgga ccagcgctgg caggtgatgc agcgcttcta tggcctcccc 1020
gagggcctga tcgcccgctt ctatgcgggc aagctgaccc tgccggaccg cctccgcatc 1080
ctgtcgggca agccgcccgt gccggtgctg gcggccctgc aggccatcat gacgccgcat 1140
cgccagcagg cgatgcagtg a 1161

Claims (7)

1.一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于：首先优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子，获得opt crtYPa基因，然后用含启动子prrnB的opt crtYPa基因和成团泛菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa基因无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3，再敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，最后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，得到产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌。
2.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于：所述opt crtYPa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于用含启动子prrnB的opt crtYPa基因和crtIPa基因无痕替换crtI3基因的方法为：利用引物opt-crtYPa-F和opt-crtYPa-R，用保真酶Pfu PCR扩增含启动子prrnB的opt crtYPa基因；以成团泛菌CGMCC 1.2244的基因为模板，利用引物opt-crtIPa-F和opt-crtIPa-R，用保真酶PfuPCR扩增成团泛菌CGMCC 1.2244的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa；利用引物opt-crtIPaYPa-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的含启动子prrnB的opt crtYPa基因与crtIPa基因，得到opt crtIPaYPa基因；以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物opt-crtIPaYPa-up-F和opt-crtIPaYPa-up-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtI3基因的上游同源臂，利用引物opt-crtIPaYPa-down-F和opt-crtIPaYPa-down-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtI3基因的下游同源臂；利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的上游同源臂与opt crtIPaYPa基因，再利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-down-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的下游同源臂，实现crtI3基因的上游同源臂-optcrtIPaYPa基因-crtI3基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△crtI3::opt crtIPaYPa片段；将△crtI3::opt crtIPaYPa片段***到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和XbaI双酶切位点，获得质粒pK18-△crtI3::opt crtIPaYPa，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1Com△crtI3::opt crtIPaYPa，以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合，得到菌株RC1；
上述各引物序列如下：
opt-crtYPa-F：CAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGGC
opt-crtYPa-R：TGTAGTTCTATTCATTCACTGCATCGCCTGCTG
opt-crtIPa-F：AGGCGATGCAGTGAATGAATAGAACT
opt-crtIPa-R：TCAAGCCAGATCCTCCAGCA
opt-crtIPaYPa-F：AGTTCGCGCCCAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGG
opt-crtIPaYPa-R：CAGAGGCAATCATTCAAGCCAGATCCTCCAGCAT
opt-crtIPaYPa-up-F：CCGGAATTCCTCTCGTCGGCCATCTTG
opt-crtIPaYPa-up-R：GTTTTTCGTTGGGCGCGAACTCCTGCA
opt-crtIPaYPa-down-F：GGATCTGGCTTGAATGATTGCCTCTGCCGATCT
opt-crtIPaYPa-down-R：CTAGTCTAGACGCCCGAGAAACTGTCGTAG。
4.根据权利要求3所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC的方法为：以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物crtC-up-F和crtC-up-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtC基因的上游同源臂，利用引物crtC-down-F和crtC-down-R，用保真酶Pfu PCR扩增crtC基因的下游同源臂；利用引物crtC-up-F与crtC-down-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtC基因的上游同源臂与下游同源臂，得到△crtC片段；将△crtC片段***到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△crtC，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1Com△crtC，以RC1为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株RC2；
上述各引物序列如下：
crtC-up-F：CCGGAATTCTCATCATGAACGGACCGCC
crtC-up-R：GGGATGTCAGGAAAAGGACACGCCGTCGATATACCA
crtC-down-F：ATCGACGGCGTGTCCTTTTCCTGACATCCCGGCC
crtC-down-R：CCCCAAGCTTGCCTTCAACACGCTCTGGAC。
5.根据权利要求4所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于敲除类球红细菌内源的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的方法为：以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物zwf-up-F1和zwf-up-R1，用保真酶Pfu PCR扩增zwf基因的上游同源臂，利用引物zwf-down-F1和zwf-down-R1，用保真酶Pfu PCR扩增zwf基因的下游同源臂；利用引物zwf-up-F1与zwf-down-R1，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂，得到△zwf片段；将△zwf片段***到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△zwf，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1Com△zwf，以RC2为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株RC3；
上述各引物序列如下：
zwf-up-F1：CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGG
zwf-up-R1：GGCCTCTCAGCGGATAACCATGGGCTCTCCCGC
zwf-down-F1：GGAGAGCCCATGGTTATCCGCTGAGAGGCCGCCG
zwf-down-R1：CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC。
6.根据权利要求5所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的方法为：以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板，利用引物dxs-F和dxs-R，用保真酶Pfu PCR扩增dxs基因，利用引物zwf-up-F2和zwf-up-R2，用保真酶Pfu PCR扩增zwf基因的上游同源臂，利用引物zwf-down-F2和zwf-down-R2，用保真酶Pfu PCR扩增类zwf基因的下游同源臂；利用引物zwf-up-F2与dxs-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因，再利用引物zwf-up-F2与zwf-down-R2，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的下游同源臂，实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△zwf::dxs片段；将△zwf::dxs片段***到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点，获得质粒pK18-△zwf::dxs，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1Com△zwf::dxs，以RC3为受体菌株进行双亲接合，得到产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌；
上述各引物序列如下：
zwf-up-F2：CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGGC
zwf-up-R2：GTCGGTCATGGGCTCTCCCGCTGCCT
dxs-F：GAGAGCCCATGACCGACAGACCCTGCAC
dxs-R：GGCGGCCTCTTCCGATCGCCCTCCTC
zwf-down-F2：CGATCGGAAGAGGCCGCCGGGC
zwf-down-R2：CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC。
7.权利要求1的构建方法得到的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609519A (zh) * 2018-10-31 2019-04-12 昆明理工大学 一种基因RKcrtYB及其应用
CN111304138A (zh) * 2020-02-03 2020-06-19 天津大学 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用
CN114686385A (zh) * 2022-04-11 2022-07-01 陕西海斯夫生物工程有限公司 高产β-胡萝卜素的重组解脂亚罗酵母、其构建法与应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509729A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 一种生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN103740744A (zh) * 2014-01-17 2014-04-23 河北大学 一种玉米黄质合成基因重组质粒及其制备方法和用途
CN104962488A (zh) * 2015-07-22 2015-10-07 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN105087406A (zh) * 2015-07-22 2015-11-25 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN105420134A (zh) * 2015-12-25 2016-03-23 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN105779319A (zh) * 2016-03-23 2016-07-20 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN106801028A (zh) * 2017-01-17 2017-06-06 中山大学 产高含量玉米黄素或虾青素工程菌及其应用
CN106987550A (zh) * 2017-05-18 2017-07-28 陕西师范大学 一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509729A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 一种生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN103740744A (zh) * 2014-01-17 2014-04-23 河北大学 一种玉米黄质合成基因重组质粒及其制备方法和用途
CN104962488A (zh) * 2015-07-22 2015-10-07 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN105087406A (zh) * 2015-07-22 2015-11-25 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN105420134A (zh) * 2015-12-25 2016-03-23 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN105779319A (zh) * 2016-03-23 2016-07-20 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
CN106801028A (zh) * 2017-01-17 2017-06-06 中山大学 产高含量玉米黄素或虾青素工程菌及其应用
CN106987550A (zh) * 2017-05-18 2017-07-28 陕西师范大学 一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANPING SU等: "Metabolic Redesign of Rhodobacter sphaeroides for Lycopene Production", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
JING ZHAO等: "Engineeringcentralmetabolicmodulesof Escherichiacoli for improving b-carotene production", 《METABOLICENGINEERING》 *
SHUANG C.CHI等: "Assembly of functional photosystem complexes in Rhodobacter sphaeroides incorporating carotenoids from the spirilloxanthin pathway", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
SONG X等: "1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), a crucial enzyme for isoprenoids biosynthesis", 《SPRINGER: NEW YORK》 *
YAN ZHOU等: "Lycopene production in recombinant strains of Escherichia coli is improved by knockout of the central carbon metabolism gene coding for glucose-6-phosphate dehydrogenase", 《BIOTECHNOL LETT》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609519A (zh) * 2018-10-31 2019-04-12 昆明理工大学 一种基因RKcrtYB及其应用
CN111304138A (zh) * 2020-02-03 2020-06-19 天津大学 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用
CN111304138B (zh) * 2020-02-03 2021-12-24 天津大学 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用
CN114686385A (zh) * 2022-04-11 2022-07-01 陕西海斯夫生物工程有限公司 高产β-胡萝卜素的重组解脂亚罗酵母、其构建法与应用
CN114686385B (zh) * 2022-04-11 2022-10-11 陕西海斯夫生物工程有限公司 高产β-胡萝卜素的重组解脂亚罗酵母、其构建法与应用

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