CN103864611B - 一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法、组合物、组合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法、组合物、组合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法，该制备方法简单、原料易得，有利于工业化生产；本发明还公开了一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物，该组合物中的各辅料组分易得，有利于产业化；本发明还公开了一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，该制备方法要求工艺条件不高，易操作；本发明还公开了一种辛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用，该辛伐他汀羟基酸化物毒性显著降低，不需要在体内代谢即可用于治疗高血脂。

Description

一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法、组合物、组合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别是涉及一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法、组合物、组合物的制备方法及其应用。
背景技术
他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面低密度脂蛋白(LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低；他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。
辛伐他汀为目前常用的治疗高血脂药物，临床研究证明，辛伐他汀为非活性内酯结构的前药，必须在体内代谢、水解开环，形成具有活性结构的辛伐他汀羟基酸化物形式才能抑制HMG-CoA还原酶；辛伐他汀羟基酸化物的结构与普伐他汀钠极其相似，普伐他汀钠是已上市药物，具有很好的开发前景；而目前辛伐他汀羟基酸化物在辛伐他汀药物质量研究中仅作为相关物质控制，未有直接用于治疗高血脂方面的研究。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法、组合物、组合物的制备方法及其应用。
本发明提供了一种如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物
取如式A所示的化合物洛伐他汀，加入仲胺在加热条件下进行开环反应，制得如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物；
2)制备如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物
取如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物，加入正己烷和四氢呋喃，降温至-30℃以下，在氮气保护下，加入正丁基锂吡咯烷溶液和碘甲烷，在-20℃以下反应，制得如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物；
3)制备如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐
取如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物，加入氢氧化钠溶液进行水解反应，用盐酸调节PH=1.0～2.0，萃取，有机层滴加氨水进行甲基化反应，制得如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐；
4)制备如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物
取如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐，用甲苯溶解，加入盐酸进行酸化回流反应，制得如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物。
优选地，所述步骤1）中所述仲胺为二乙胺、二丙胺和二正丁胺。
优选地，所述步骤3）中为60℃～90℃条件下水解反应1h～5h。
优选地，其特征在于：所述步骤4）中回流反应20min～2h。
上述步骤1）中，使用了仲胺进行开环反应，其中，仲胺为胺的一种，也称二级胺，仲胺分子能形成氢键；常用二乙胺、二丙胺和二正丁胺，结构式分别为CH3CH2-NH-CH2CH3、CH3(CH2)2-NH-(CH2)2CH3和CH3(CH2)3-NH-(CH2)3CH3。
上述制备方法中，如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物采用如式A所示的化合物洛伐他汀为起始原料，经仲胺开环，制得的开环化合物不经保护，直接在强碱作用下进行甲基化反应，制得如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐，然后经盐酸酸化制得如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物。
上述制备方法中，如式A所示的化合物洛伐他汀，其化学名为8-(2-(4-羟基-6-氧-四氢-2H-吡喃-2-基)乙基)-7-甲基-1、2、3、7、8、8a-六氢萘-1-基-2-甲基丁酯，相应的英文表述为：8-(2-(4-hydroxy-6-oxo-tetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1、2、3、7、8、8a-hexahydronaphthalen-1-yl2-methylbutanoate；如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物，其化学名为7-(8-(2,2-二甲基丁酰基氧基)-2、6-二甲基-1、2、6、7、8、8a-六氢萘-1-基)-3,5-二羟基庚酸，相应的英文表述为7-(8-(22-dimethylbutanoyloxy)-2、6-dimethyl-1、2、6、7、8、8a-hexahydronaphthalen-1-yl)-3、5-dihydroxyheptanoicacid；这在本领域是普遍采用的，也是本领域普通技术人员完全可以掌握的。
本发明还提供了一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
优选地，所述的辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
优选地，所述的辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
优选地，所述的辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
本发明还提供了一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)称取辛伐他汀羟基酸化物、聚山梨酯80、交联羧甲基纤维素钠、甘露醇、微晶纤维素分别研磨，过筛，备用；
2)将硬脂酸镁加入到步骤1）研磨后的粉末中，混合均匀，然后过筛；
3)压片；
4）称取欧巴代薄膜包衣预混剂，包薄膜衣。
上述制备方法中，聚山梨酯80为表面活性剂，以粘合剂的形式加入；欧巴代薄膜包衣预混剂成分包括羟丙甲纤维素、聚乙二醇、二氧化钛和滑石粉组成，使用市售的商品即可，欧巴代薄膜包衣预混剂的用量是按照药剂学上的经验把握，是本领域普通技术人员可以掌握的，一般为增重2%～4%。
本发明还提供了一种辛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用。
辛伐他汀为非活性内酯结构的前药，必须在体内代谢，水解开环，形成具有活性结构的辛伐他汀羟基酸化物才能抑制HMG-CoA还原酶；而本发明提供的辛伐他汀羟基酸化物，不需要在体内代谢即可用于治疗高血脂。
本发明提供了一种辛伐他汀羟基酸化物的制备方法，其有益效果如下：
1.本发明的制备方法简单，原料易得，有利于工业化生产；
2.本发明使用试剂毒性较低，有利于环境保护；
3.本发明收率较高，达到80%以上。
本发明还提供了一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物，其有益效果如下：
1.本发明的组合物，在体内不需要事先代谢，直接用于治疗高血脂；
2.本发明中的各辅料组分价廉易得，有利于降低生产成本。
本发明还提供了一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，其有益效果如下：
1.本发明制备方法简单，易操作；
2.本发明制备方法要求工艺条件不高，容易工业化大生产。
本发明还提供了一种辛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用，其有益效果如下：
1.本发明毒性显著降低；
2.本发明的辛伐他汀羟基酸化物不需要在体内代谢即可用于治疗高血脂。
附图说明
图1辛伐他汀羟基酸化物；
图2辛伐他汀羟基酸化物的合成路线图；
图3洛伐他汀羟基酸化物配体分子结构3D图；
图4辛伐他汀羟基酸化物配体分子结构3D图；
图5普伐他汀配体分子结构3D图；
图61dqa3D图；
图7洛伐他汀羟基酸化物与1dqa对接结果；
图8辛伐他汀羟基酸化物与1dqa对接结果；
图9普伐他汀钠与1dqa对接结果；
图10洛伐他汀羟基酸化物与1dqa结合方式；
图11辛伐他汀羟基酸化物与1dqa结合方式；
图12普伐他汀钠与1dqa结合方式；
图13普伐他汀钠（50%-外包期-48hpf给药）对斑马鱼胚胎的毒性（3dpf）；
图14洛伐他汀给药（50%-外包期-48hpf给药）对斑马鱼胚胎的毒性（3dpf）；图15辛伐他汀给药（50%-外包期-48hpf给药）对斑马鱼胚胎的毒性（3dpf）；图16洛伐他汀放置0h溶液HPLC色谱图；
图17洛伐他汀放置24h溶液HPLC色谱图；
图18普伐他汀钠500ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图19普伐他汀钠500ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图20普伐他汀钠1000ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图21普伐他汀钠1000ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图22普伐他汀钠1000ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图23普伐他汀钠野生型对照（Wt）3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图24普伐他汀钠1500ug/ml2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图25普伐他汀钠Wt3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图26普伐他汀钠Wt2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图27洛伐他汀0.01ug/ml1dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图28洛伐他汀0.005ug/ml1dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图29洛伐他汀0.0005ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图30洛伐他汀0.001ug/ml2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图31洛伐他汀0.001ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图32洛伐他汀Wt2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图33洛伐他汀Wt3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图34辛伐他汀0.005ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图35辛伐他汀0.03ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图36辛伐他汀0.05ug/ml1dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图37辛伐他汀0.01ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图38辛伐他汀0.03ug/ml3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图39辛伐他汀0.01ug/ml2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；
图40辛伐他汀Wt3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形。
具体实施方式
实施例一
一种如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物
取如式A所示的化合物洛伐他汀25g，加入30ml二丙胺在65～70℃下进行开环反应6h，减压回收过量的二丙胺，制得如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物22.1g，收率88.4%（以式A所示的化合物洛伐他汀计）；
2)制备如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物
取步骤1）制得的如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物23g，加入100ml正己烷和50ml四氢呋喃，降温至-30℃，在氮气保护下，于-30℃条件下加入1.5mol/L的正丁基锂吡咯烷溶液45ml，然后于-25℃反应2.5h，加入12g碘甲烷，在-20℃条件下反应30min，搅拌下缓慢升至室温，滴加100ml水，搅拌萃取，有机层减压浓缩制得如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物24.6g，收率107.0%（以式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物计）；
3)制备如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐
取步骤2）制得的如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物25.3g，加入6.5g/50ml的氢氧化钠溶液（6.5g氢氧化钠溶解于50ml水中形成的溶液），60℃水解反应1h，降温至0℃，用浓盐酸调节PH=1.5～2.0，加入100ml乙酸乙酯萃取，有机层加入30ml甲醇稀释，搅拌下滴加氨水至PH=7.5～8.0，降温至0℃反应30min，过滤，有机层减压浓缩，制得如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐23.9g，收率94.5%（以式C所示的化合物计）；
4)制备如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物
取步骤3）制得的如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐24.8g，加入100ml甲苯进行溶解，加入3mol/L的盐酸溶液50ml，加热至回流，回流反应20min，减压浓缩蒸去甲苯，制得性状为白色固体的如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化合物18.9g，收率76.2%(以式D所示的化合物辛伐他汀铵盐计)。
实施例二
一种如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物
取如式A所示的化合物洛伐他汀25g，加入30ml二乙胺在回流条件下进行开环反应6h，减压回收过量的二乙胺，制得如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物22.6g，收率90.4%（以式A所示的化合物洛伐他汀计）；
2)制备如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物
取步骤1）制得的如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物23g，加入100ml正己烷和50ml四氢呋喃，降温至-30℃，在氮气保护下，于-30℃条件下加入1.5mol/L的正丁基锂吡咯烷溶液45ml，然后于-25℃反应2.5h，加入12g碘甲烷，在-20℃条件下反应30min，搅拌下缓慢升至室温，滴加100ml水，搅拌萃取，有机层减压浓缩制得如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物25.0g，收率108.7%（以式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物计）；
3)制备如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐
取步骤2）制得的如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物25.3g，加入6.5g/50ml的氢氧化钠溶液（6.5g氢氧化钠溶解于50ml水中形成的溶液），80℃水解反应5h，降温至0℃，用浓盐酸调节PH=1.5～2.0，加入100ml乙酸乙酯萃取，有机层加入30ml甲醇稀释，搅拌下滴加氨水至PH=7.5～8.0，降温至0℃反应30min，过滤，有机层减压浓缩，制得如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐24.2g，收率95.7%（以式C所示的化合物计）；
4)制备如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物
取步骤3）制得的如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐24.8g，加入100ml甲苯进行溶解，加入3mol/L的盐酸溶液50ml，加热至回流，回流反应2h，减压浓缩蒸去甲苯，制得性状为白色固体的如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化合物19.4g，收率78.2%(以式D所示的化合物辛伐他汀铵盐计)。
实施例三
一种如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物
取如式A所示的化合物洛伐他汀25g，加入30ml二正丁胺在65～70℃下进行开环反应6h，减压回收过量的二正丁胺，制得如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物23g，收率92%（以式A所示的化合物洛伐他汀计）；
2)制备如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物
取步骤1）制得的如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物23g，加入100ml正己烷和50ml四氢呋喃，降温至-30℃，在氮气保护下，于-30℃条件下加入1.5mol/L的正丁基锂吡咯烷溶液45ml，然后于-25℃反应2.5h，加入12g碘甲烷，在-20℃条件下反应30min，搅拌下缓慢升至室温，滴加100ml水，搅拌萃取，有机层减压浓缩制得如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物25.3g，收率110%（以式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物计）；
3)制备如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐
取步骤2）制得的如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物25.3g，加入6.5g/50ml的氢氧化钠溶液（6.5g氢氧化钠溶解于50ml水中形成的溶液），90℃水解反应2h，降温至0℃，用浓盐酸调节PH=1.5～2.0，加入100ml乙酸乙酯萃取，有机层加入30ml甲醇稀释，搅拌下滴加氨水至PH=7.5～8.0，降温至0℃反应30min，过滤，有机层减压浓缩，制得如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐24.8g，收率98%（以式C所示的化合物计）；
4)制备如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物
取步骤3）制得的如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐24.8g，加入100ml甲苯进行溶解，加入3mol/L的盐酸溶液50ml，加热至回流，回流反应30min，减压浓缩蒸去甲苯，制得性状为白色固体的如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化合物20g，收率80.6%(以式D所示的化合物辛伐他汀铵盐计)。
实施例四
一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
表1实施例四组分配比
组分 重量（份）
洛伐他汀羟基酸化物 5
聚山梨酯80 0.2
交联羧甲基纤维素钠 11
甘露醇 40
微晶纤维素 33
硬脂酸镁 0.5
欧巴代薄膜包衣预混剂 适量
一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤（各组分用量按表1所述）：
1）将各辅料和原料分别研磨，过5号筛；
2）将各辅料和原料混合均匀，再次过5号筛；
3）采用直接压片，得到辛伐他汀羟基酸化合物的组合物片剂。
实施例五
一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
表2实施例五组分配比
组分 重量（份）
洛伐他汀羟基酸化物 20
聚山梨酯80 0.2
交联羧甲基纤维素钠 11
甘露醇 40
微晶纤维素 33
硬脂酸镁 0.5
欧巴代薄膜包衣预混剂 适量
一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤（各组分用量按表2所述）：
1）将各辅料和原料分别研磨，过5号筛；
2）将各辅料和原料混合均匀，再次过5号筛；
3）采用直接压片，得到辛伐他汀羟基酸化合物的组合物片剂。
实施例六
一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：
表3实施例六组分配比
组分 重量（份）
洛伐他汀羟基酸化物 10
聚山梨酯80 0.2
交联羧甲基纤维素钠 11
甘露醇 40
微晶纤维素 33
硬脂酸镁 0.5
欧巴代薄膜包衣预混剂 适量
一种辛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤（各组分用量按表3所述）：
1）将各辅料和原料分别研磨，过5号筛；
2）将各辅料和原料混合均匀，再次过5号筛；
3）采用直接压片，得到辛伐他汀羟基酸化合物的组合物片剂。
一、在药效方面的比较
洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物分别为洛伐他汀和辛伐他汀的体内活性产物，二者均为HMG-CoA还原酶抑制剂，在体内不需要经过代谢，即可直接用于治疗高血脂，其药效比较见表4、表5。
表4洛伐他汀与洛伐他汀羟基酸化物药效比较
从表4中可以看出，与洛伐他汀相比较，洛伐他汀羟基酸化合物具有更优的生物利用度，更强的降血脂功能和更长效的治疗作用。
表5辛伐他汀与辛伐他汀羟基酸化物药效比较
从表5中可以看出，与辛伐他汀相比较，辛伐他汀羟基酸化合物具有更优的生物利用度，更强的降血脂功能和更长效的治疗作用。
二、利用对接分析评价洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物与普伐他汀钠对HMG-CoA还原酶蛋白（1dqa）的抑制作用。
1、配体选择
PUMBEDLINE查找洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物、普伐他汀钠信息见图3、图4、图5和表6。
表6配体信息
备注：①CID为化合物信息码，由PUMBEDLINE根据数据信息创建日期进行编号得到。
②XLogP3代表疏水参数计算值，用来评价药物的脂水分布系数，采用了原子加合法换算而来。
2、受体选择
由PDB蛋白库中查询的信息见表7，目前已发表有8种数据，分别对应不同类的他汀和底物结合部位，根据本次研究目的，选择1dqa作为受体，1dqa的3D图见图6。
表7PDB蛋白库查询信息表
3、对接准备
首先对1dqa的构象进行最优化处理，对1dqa施加CHARm分子场，采用MM计算优化1dqa能量；对1dqa进行加氢、去除无效构象、残基后，选择1号活性位点作为对接口袋，其半径为15.0埃；根据配体和1dqa的性质，采用DockLigands程序进行半柔性对接。
4、结果
对接结果见图7、图8和图9；配体与1dqa的结合方式见图10、图11、图12，可见洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物和普伐他汀钠与1dqa具有相似的结合方式；普伐他汀钠、洛伐他汀羟基酸化物和辛伐他汀羟基酸化物与1dqa活性位点1的结合主要依靠配体中的氢原子分别与1dqa中LYS606、HIS635、SER637氨基酸形成氢键；另普伐他汀钠和辛伐他汀羟基酸化物还可与氨基酸LYS62形成Pi-Pi共轭键；分析评价洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物以及普伐他汀钠与1dqa的匹配程度，从而进一步评价其对HMG-CoA还原酶的抑制能力，结果见表8。
表8三种化合物与1dqa的匹配程度
Index Number -PLP1 -PLP2 PMF RMSD
2 洛伐他汀羟基酸化物 105.880 109.980 161.920 1.101990
26 辛伐他汀羟基酸化物 82.330 91.070 149.000 1.092800
12 普伐他汀钠 114.250 123.460 157.340 1.148210
备注：①Index：索引。
②Number：数、名称。
③PLP:（Piecewiselinearpotential）采用分段线性势能加和计算；得分越高表示配体与受体亲和力越强。根据对接过程中氢键参加与否，可分为PLP1和PLP2两种函数，PLP1不考虑氢键对接的影响；PLP2考虑氢键对对接的影响。
④PMF:（Potentialofmeanforce），采用分子间距离的平均能的加和计算；得分越高表示配体与受体亲和力越强。
⑤RMSD：化合物的对接构象与原始晶体构象的均方根差，表征预测结果与实际值在位置和构象上差异程度，单位为埃。
在分子对接过程中，常采用打分函数用来评价对接程序（LigandFit）中，化合物与受体蛋白结合性的强弱。对于特定的蛋白质研究体系，一般往往需要多种不同的打分函数来验算对接结果；以避免单一打分函数由在其建立时选择的训练集分子的偏好性，缺乏普适性的缺点；从上述表8中可以看出，洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物和普伐他汀钠与受体蛋白1dqa的对接构象中，PLP1、PLP2与PMF的得分值均较高，且各化合物间差值较小；同时RMSD均小于2.0埃，表示LigandFit对接结果准确；上述结果表明：洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物和普伐他汀钠抑制HMG-CoA还原酶作用相似，即它们具有相似的生物活性。
三、他汀类药物毒性比较
毒理学研究中，斑马鱼常用于各种药品的急、慢性毒性试验，其胚胎透明的特点更有利于观察胚胎不同阶段的结构和形态变化；在其幼体阶段，机体的各组织***（神经***、心血管***、血液***、肌肉骨骼运动***、分泌、吸收和******等）已接近成熟和完善，开始发挥正常的生理功能，类似于成体。因此，斑马鱼胚胎阶段和幼体阶段可用于快速研究化合物的胚胎发育毒性和各组织器官的靶毒性。本研究利用斑马鱼模式动物比较研究了多种他汀类药物对胚胎发育的毒性，尤其是对肌肉组织发育的影响。
1、斑马鱼胚胎的给药方法
收集胚胎后待胚胎发育至50%-外包期的状态，挑选发育正常的胚胎按每组30分组，置于不同浓度的他汀药液中，每次试验均设野生对照组。
洛伐他汀、辛伐他汀用二甲基亚砜配制母液，使用前用人工海水稀释为所需浓度，由于母液为二甲基亚砜配置，为避免二甲基亚砜对胚胎产生影响，母液至少稀释100倍以上；测试液用人工海水稀释，在给药以后每天观察胚胎的发育状态，统计胚胎中死亡以及畸形的个数，并进行拍照。胚胎染毒后每天更换一次药液，给药处理持续至胚胎48dpf期(48hpf为从外包期到孵化48小时给药，其他以此类推)，将药液吸出，冲洗胚胎数次重新置于人工海水中使之继续发育。
2、实验结果
1)洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀钠胚胎毒性的比较
洛伐他汀和辛伐他汀为非活性内酯结构的前药，必须分别在体内代谢开环形成洛伐他汀羟基酸化物和辛伐他汀羟基酸化物才能抑制HMG-CoA还原酶；而普伐他汀钠则以羟基酸化物的形式存在；普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀作用于斑马鱼胚胎（50%-外包期-48hpf）在3dpf致畸致死范围如图13、图14、图15所示(3dpf为从外包期到孵化3天给药，其他以此类推)。
表9三种化合物对斑马鱼胚胎的影响比较
三种他汀类药物在相应浓度范围内对胚胎致畸作用呈浓度依赖性逐渐上升；从致畸致死的浓度范围来看，辛伐他汀的作用浓度稍高于洛伐他汀，而普伐他汀钠的作用浓度则远高于辛伐他汀和洛伐他汀，即普伐他汀钠的毒性远低于辛伐他汀和洛伐他汀，从而可以说明洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物的药物毒性小于非活性内酯结构的前药。
由表9、10可以看出，从三种他汀类药物早期作用于斑马鱼胚胎的致畸致死严重程度显示，洛伐他汀最严重，其次是辛伐他汀，最不严重的是普伐他汀钠，并且不同类别的他汀类药物对斑马鱼胚胎达到相同的致畸或致死效果时浓度的差异是十分明显的，例如对早期斑马鱼胚胎毒性最大的洛伐他汀的100%致死剂量与毒性最小的普伐他汀钠的100%致死剂量相差达到了十万倍，而普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀三种药物的分子量差距较小，三种他汀类药物在临床上的推荐使用剂量也相差较小，但是在作用于早期斑马鱼胚胎的毒性却差异较大。
表10.六种他汀类药物作用于斑马鱼胚胎致畸致死浓度比较
从化学结构上来比较普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀，其相对分子质量非常接近；普伐他汀钠以具有活性的羟基酸化物结构存在,但洛伐他汀和辛伐他汀是非活性内酯结构形式存在；普伐他汀钠对斑马鱼胚胎致畸致死作用远小于洛伐他汀和辛伐他汀；普伐他汀钠其血浆蛋白结合率远小于洛伐他汀和辛伐他汀，约为洛伐他汀和辛伐他汀的50%，显示其在体内主要以游离形式的药物存在，但毒性却远远小于洛伐他汀和辛伐他汀；上述结果显示开环后形成的洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物的毒性分别与洛伐他汀和辛伐他汀的非活性内酯结构相比，其毒性作用明显减轻。
2)洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物的胚胎毒性比较
洛伐他汀、辛伐他汀溶液24h后进行HPLC检测分析，从检测结果可以看出，洛伐他汀、辛伐他汀24h后均基本以洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物形式存在。
表11洛伐他汀和辛伐他汀比较结果
备注：WT为野生对照型，也就是作为对照的不添加药物的胚胎。
从表11中可以看出，当给药浓度增大到0.01ug/ml，洛伐他汀与辛伐他汀在0、24h的正常胚存活数显著下降，当浓度增大到0.1ug/ml，洛伐他汀与辛伐他汀的总存活和正常胚存活数均为0；结果表明给药浓度达0.01ug/ml以上，洛伐他汀与辛伐他汀均表现出胚胎毒性。
3)他汀类药物作用于斑马鱼胚胎的致畸性
他汀类药物对斑马鱼进行染毒后，每日观察一次，记录统计主要的畸形形态并拍照；由图18～图39的图片可以看出普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀这三种他汀类药物虽然作用于早期斑马鱼胚胎的浓度范围差异较大，但影响胚胎的早期发育的表型形态却较为相似，与洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物导致的毒性反应表型也相似，主要集中在以下几个方面：
①胚胎整体体长变短，卵黄囊延伸变短粗，尾干弯向左右体侧；高浓度组运动能力降低，用发圈触碰反应不如正常对照组敏感；
②胚胎发育过程中色素受影响，整体减弱；
③胚胎有淤血出现，出现淤血的部位主要集中在头部、躯干背部以及卵黄囊延伸末端的尾干部位；
④斑马鱼胚胎在一定浓度下都发现心包肿大现象，同时出现心脏带状畸形；
⑤处理组胚胎躯干处肌肉组织都出现异常，体节不清晰，在各组的最高浓度组体节有平行化的趋势。
3、分析结论
1)他汀类药物作用于斑马鱼胚胎致畸致死浓度范围：在斑马鱼胚胎早期发育50%-外包期-48hpf给予不同浓度浓度的六种他汀类药物进行作用，结果表明六种他汀类药物作用早期胚胎致畸致死的浓度范围差异很大，差异最大的达到上万倍；三种他汀类药物作用于斑马鱼胚胎的致畸致死严重程度依次为：洛伐他汀最严重，其次是辛伐他汀，再其次是洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀的羟基酸化物，最不严重的是普伐他汀钠。
2)毒性：洛伐他汀和辛伐他汀内酯键开环分别形成洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物，毒性至少降低了50倍；但由于降解后还产生了其他相关物质，故洛伐他汀羟基酸化物和辛伐他汀羟基酸化物的毒性比测定的更低。
3)畸形：他汀类药物的作用于早期斑马鱼胚胎虽然浓度差异很大，但引起的畸形大体上是一致的，主要有胚胎整体体长变短、卵黄囊延伸变短粗、尾干弯曲；色素减弱；头部、躯干背部以及卵黄囊延伸末端的尾干部位淤血；心包肿大现象、同时出现心脏带状畸形；胚胎躯干处肌肉组织都出现异常，在各组的最高浓度组体节有平行化的趋势。
以上结合实施方式是对本发明的详细说明，只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限定本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内，不应该被认为是新的发明创造。

Claims (1)

1.辛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物
取如式A所示的化合物洛伐他汀，加入仲胺在加热条件下进行开环反应，制得如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物；
2)制备如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物
取如式B所示的化合物洛伐他汀开环化合物，加入正己烷和四氢呋喃，降温至-30℃以下，在氮气保护下，加入正丁基锂吡咯烷溶液和碘甲烷，在-20℃以下反应，制得如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物；
3)制备如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐
取如式C所示的化合物辛伐他汀开环化合物，加入氢氧化钠溶液进行水解反应，用盐酸调节pH＝1.0～2.0，萃取，有机层滴加氨水进行甲基化反应，制得如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐；
4)制备如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物
取如式D所示的化合物辛伐他汀铵盐，用甲苯溶解，加入盐酸进行酸化回流反应，制得如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物；
5)将如式E所示的化合物辛伐他汀羟基酸化物用于制备治疗高血脂的药物。
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