CN103842378B

CN103842378B - 蛋白质性蛋白酶抑制剂以及含有其的蛋白质溶液和洗涤剂组合物

Info

Publication number: CN103842378B
Application number: CN201280048546.3A
Authority: CN
Inventors: 草野美纪; 柳原芳充
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2011-10-12
Filing date: 2012-10-05
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2032-10-05
Also published as: EP2767547A4; CN103842378A; US20140357543A1; JPWO2013054774A1; EP2767547A1; JP5953312B2; EP2767547B1; US9403897B2; WO2013054774A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种具有适度的抑制活性的蛋白质性蛋白酶抑制剂，本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂具有氨基酸序列(Y)或与所述氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y')，所述氨基酸序列(Y)是将序列号1的蛋白质性蛋白酶抑制剂(BC)的氨基酸序列(A)的1～8个氨基酸置换成与变更前的氨基酸不同的氨基酸而得到的。

Description

蛋白质性蛋白酶抑制剂以及含有其的蛋白质溶液和洗涤剂组合物

技术领域

本发明涉及一种蛋白质性蛋白酶抑制剂以及含有其的蛋白质溶液和洗涤剂组合物。

背景技术

蛋白酶是催化肽键的水解的酶群的统称，已知其在微生物、动物和植物中广泛存在。作为其应用领域，有衣物用清洗剂、自动餐具清洗机用清洗剂、隐形眼镜用清洗剂、沐浴剂、去角质用化妆品、食品的改性剂(面包制作、肉的软化和水产加工等)、啤酒的澄清剂、皮革鞣剂、摄影胶片的明胶去除剂、消化助剂和消炎剂等，在许多领域中被积极地使用。

但是，蛋白酶存在如下问题：蛋白酶自身或其它蛋白质发生水解，导致蛋白酶自身或其它蛋白质的活性经时地显著降低。

因而，为了抑制蛋白酶自身或其它蛋白质的水解，正在进行抑制蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂的研究。作为蛋白酶抑制剂，例如，已知来自链霉菌属的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)(非专利文献1)、来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂2(非专利文献2)等。

但是，这些已知的天然存在的蛋白酶抑制剂存在如下问题：大多抑制活性过强，即便在使用时稀释蛋白酶溶液也无法恢复活性。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Agricultural and Biological Chemistry,1972,36,p160-163

非专利文献2：Journal of Molecular Biology,1983,168,p445-447

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种具有适度的抑制活性的蛋白质性蛋白酶抑制剂。具体地说，目的在于提供一种能够抑制蛋白酶活性、进而还能够恢复蛋白酶活性的蛋白质性蛋白酶抑制剂。另外，本发明的目的在于提供一种蛋白质水溶液，其为包含该蛋白质性蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，其在长期保存后也保持了蛋白酶活性。另外，本发明的目的在于提供一种洗涤剂组合物，其为包含该蛋白质性蛋白酶抑制剂的洗涤剂组合物，其在长期保存后也保持了清洗性。

用于解决问题的方案

为了达到上述目的，本发明人进行了研究，结果完成了本发明。

即，本发明涉及一种蛋白质性蛋白酶抑制剂，所述蛋白质性蛋白酶抑制剂具有氨基酸序列(Y)或与所述氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)，所述氨基酸序列(Y)是将序列号1的蛋白质性蛋白酶抑制剂(BC)的氨基酸序列(A)的1～8个氨基酸置换成与变更前的氨基酸不同的氨基酸而得到的，所述蛋白质性蛋白酶抑制剂满足下述(1)～(8)中至少1个条件；一种蛋白质溶液，其包含该蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶(D)和溶剂(E)；一种洗涤剂组合物，其包含该蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶(D)、溶剂(E)和表面活性剂(F)。

(1)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的12位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X1)；

(2)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的38位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X2)；

(3)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的48位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X3)；

(4)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的50位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X4)；

(5)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的51位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X5)；

(6)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的52位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X6)；

(7)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的53位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X7)；

(8)所述氨基酸序列(Y)或(Y’)中，与所述氨基酸序列(A)的70位相当的位置的氨基酸是下述氨基酸(X8)；

(X1)：氨基酸(X0)中Glu以外的氨基酸；

(X2)：氨基酸(X0)中Val和Ile以外的氨基酸；

(X3)：氨基酸(X0)中Met以外的氨基酸；

(X4)：氨基酸(X0)中Tyr以外的氨基酸；

(X5)：氨基酸(X0)中Arg以外的氨基酸；

(X6)：氨基酸(X0)中Ile以外的氨基酸；

(X7)：氨基酸(X0)中Asp以外的氨基酸；

(X8)：氨基酸(X0)中Arg以外的氨基酸；

(X0)：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gly、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。

发明的效果

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂能够抑制蛋白酶的活性，在用水等稀释时能够恢复蛋白酶的活性。

另外，本发明的蛋白质溶液在长期保存后也能够保持蛋白酶的活性。

另外，本发明的洗涤剂组合物在长期保存后也能够保持良好的清洗性。

具体实施方式

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂具有氨基酸序列(Y)或与所述氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)，所述氨基酸序列(Y)是将序列号1的蛋白质性蛋白酶抑制剂(BC)的氨基酸序列(A)的1～8个氨基酸置换成与变更前的氨基酸不同的氨基酸而得到的，所述蛋白质性蛋白酶抑制剂满足下述(1)～(8)中至少1个条件。

(X1)：氨基酸(X0)中Glu以外的氨基酸；

(X2)：氨基酸(X0)中Val和Ile以外的氨基酸；

(X3)：氨基酸(X0)中Met以外的氨基酸；

(X4)：氨基酸(X0)中Tyr以外的氨基酸；

(X5)：氨基酸(X0)中Arg以外的氨基酸；

(X6)：氨基酸(X0)中Ile以外的氨基酸；

(X7)：氨基酸(X0)中Asp以外的氨基酸；

(X8)：氨基酸(X0)中Arg以外的氨基酸；

本发明中，蛋白质性蛋白酶抑制剂(BC)以序列号1的氨基酸序列(A)表示，是具有抑制蛋白酶活性的能力的蛋白质。蛋白质性蛋白酶抑制剂(BC)是来自小麦的枯草杆菌蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂具有氨基酸序列(Y)或与所述氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)，所述氨基酸序列(Y)是将序列号1的蛋白质性蛋白酶抑制剂(BC)的氨基酸序列(A)的1～8个氨基酸置换成与变更前的氨基酸不同的氨基酸而得到的，所述蛋白质性蛋白酶抑制剂满足上述(1)～(8)中至少1个条件。

上述(1)的条件中，与氨基酸序列(A)的12位相当的位置包括氨基酸序列(A)的12位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的12位相当的位置。另外，(X1)为氨基酸(X0)中Glu以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Asp、Ala、Asn、Gln、Leu、Lys、Ser、Thr或Val，进一步优选为Asp、Ala、Asn、Gln或Lys，特别优选为Ala、Asp或Lys。

上述(2)的条件中，与氨基酸序列(A)的38位相当的位置包括氨基酸序列(A)的38位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的38位相当的位置。另外，(X2)为氨基酸(X0)中Val和Ile以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Ala、Gly、Leu、Phe、Ser、Thr或Trp，进一步优选为Ala或Leu，特别优选为Ala。

上述(3)的条件中，与氨基酸序列(A)的48位相当的位置包括氨基酸序列(A)的48位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的48位相当的位置。另外，(X3)为氨基酸(X0)中Met以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Ala、Ile、Leu、Ser、Thr、Gly或Val，进一步优选为Ala、Leu、Ser、Gly或Val，特别优选为Ala或Gly。

上述(4)的条件中，与氨基酸序列(A)的50位相当的位置包括氨基酸序列(A)的50位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的50位相当的位置。另外，(X4)为氨基酸(X0)中Tyr以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Ser、Thr或Val，进一步优选为Ala、Phe或Leu。

上述(5)的条件中，与氨基酸序列(A)的51位相当的位置包括氨基酸序列(A)的51位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的51位相当的位置。另外，(X5)为氨基酸(X0)中Arg以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Ala、Lys、His、Ile、Leu、Ser、Thr或Val，进一步优选为Ala、Lys或His。

上述(6)的条件中，与氨基酸序列(A)的52位相当的位置包括氨基酸序列(A)的52位自身或利用同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的52位相当的位置。另外，(X6)为氨基酸(X0)中Ile以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Glu、Ala、Asn、Gln、Leu、Ser、Thr或Val，进一步优选为Ala、Val或Gln，特别优选为Ala或Val。

上述(7)的条件中，与氨基酸序列(A)的53位相当的位置包括氨基酸序列(A)的53位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的53位相当的位置。另外，(X7)为氨基酸(X0)中Asp以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Glu、Ala、Asn、Gln、Ile、Leu、Ser、Thr或Val，进一步优选为Glu、Ala、Asn或Gln，特别优选为Glu或Ala。

上述(8)的条件中，与氨基酸序列(A)的70位相当的位置包括氨基酸序列(A)的70位自身或利用后述同源性分析程序判断与氨基酸序列(A)的70位相当的位置。另外，(X8)为氨基酸(X0)中Arg以外的氨基酸，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为Ala、Asn、Lys、His、Ile、Leu、Ser、Gly、Thr或Val，进一步优选为Ala、Asn、Gly、Lys、Ile或Leu，特别优选为Ala、Asn、Gly或Lys。

如上所述，本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂通过将序列号1的氨基酸序列的1～8个氨基酸置换成与变更前的氨基酸不同的氨基酸，从而可以形成能够适度地抑制蛋白酶活性、并且在稀释时能够恢复蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂。

另外，本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂由于能够适度地抑制蛋白酶活性，因此能够抑制蛋白酶的水解，蛋白酶活性的持续性高。

需要说明的是，本发明中，“蛋白酶活性的持续性”是指，针对稀释时的蛋白酶活性，保存一定时间后测定的蛋白酶活性与即将保存前测定的蛋白酶活性的差较小，蛋白酶活性之比(%){(保存一定时间后的蛋白酶活性)/(即将保存前测定的蛋白酶活性)×100}接近100%，显示出恒定的蛋白酶活性。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂具有氨基酸序列(Y)或与所述氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)，所述氨基酸序列(Y)是将氨基酸序列(A)的1～8个氨基酸置换成与变更前的氨基酸不同的氨基酸而得到的，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，氨基酸序列(Y)和(Y’)中的氨基酸的置换数优选为1～5个，进一步优选为1～3个。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂具有至少1个氨基酸序列(Y)或(Y’)即可，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选1～4个。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂是具有氨基酸序列(Y)或(Y’)的蛋白质性蛋白酶抑制剂，可以仅由氨基酸序列(Y)或(Y’)构成，也可以在氨基酸序列(Y)和(Y’)的C末端和/或N末端具有1个或两个以上氨基酸序列(Z)，它们可以是重复的序列。

氨基酸序列(Z)为1个氨基酸或2个以上氨基酸结合而成的肽序列。

从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，构成氨基酸序列(Z)的氨基酸的个数优选为1～100个，进一步优选为1～50个。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂具有氨基酸序列(Z)的情况下，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，氨基酸序列(Z)的个数优选为1～100个。

另外，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，构成本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列中的氨基酸序列(Y)和(Y’)以外的氨基酸的个数优选为1～100个，进一步优选为1～50个。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂包括具有氨基酸序列(Y)的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B)和具有氨基酸序列(Y’)的蛋白质性蛋白酶抑制剂(C)。

蛋白质性蛋白酶抑制剂(B)为具有氨基酸序列(Y)的蛋白质性蛋白酶抑制剂，具体地说，可以举出序列号2～29和37～39的蛋白质性蛋白酶抑制剂等。

作为(B)，从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，优选为序列号2～29和37～39的蛋白质性蛋白酶抑制剂，进一步优选为序列号2～11和14～29的蛋白质性蛋白酶抑制剂，特别优选为序列号3、4、10、11、14～19、22、23和25的蛋白质性蛋白酶抑制剂。另外，从蛋白酶的持续性的观点出发，优选为序列号2～4、10～23和25的蛋白质性蛋白酶抑制剂，进一步优选为序列号4、12、14、15、18、19、22、23和25的蛋白质性蛋白酶抑制剂。

(B)包括由天然物提取的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B-1)和利用基因重组技术生产的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B-2)。

由天然物提取的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B-1)是具有上述氨基酸序列(Y)的蛋白质性蛋白酶抑制剂，包含由天然物(例如，植物或动物的细胞、细胞外组织、种子、微生物的菌体内和菌体外分泌物等)提取的蛋白质性蛋白酶抑制剂。

作为提取方法，包括细胞壁或细胞膜的破碎、离心分离、硫酸铵分级、色谱法和透析等由天然物分离出一般的蛋白质的工序。

(B-1)的氨基酸序列可以通过肽图法等一般的方法来确定。

另外，关于由天然物提取的蛋白质是否符合(B-1)，可以通过肽图法等一般的方法来确定提取蛋白质的氨基酸序列，使用美国国家生物技术信息中心提供的同源性分析程序“BLAST”的blastp算法(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)检索同源部分，由此来确定。

作为宿主生产的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B-2)，包括如下获得的物质：使用通过日本专利第3338441号公报中记载的基因重组法所重组的基因，在适当的宿主中转化，培养该重组宿主，从培养物采集而得到该物质。具体地说，对包含编码氨基酸序列为序列号1的蛋白质的基因序列的基因序列进行克隆，将所克隆的基因序列的一部分置换成编码满足上述(1)～(8)中至少1个条件的氨基酸序列的基因(下文中，也称为“突变”)，使用如此得到的突变基因在适当的宿主中转化，培养该重组宿主，由培养物采集而得到该物质。

基因的克隆只要使用一般的基因重组技术即可，可以举出例如cDNA文库法和使用人工合成基因的方法等。作为基因突变手段，可以是通常进行的定点突变的方法，具体地说，可以举出使用Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(安捷伦科技社)等的方法。

使用上述突变基因生产(B-2)的方法为：对于适合于在目标宿主内表达基因的任意载体，使用引入了上述突变基因的重组载体对宿主进行转化，得到包含重组载体的转化体。培养所得到的转化体，由该培养液采集(B-2)即可。

本发明中，重组载体可以通过在适当的载体中***上述突变基因而得到。

关于载体，公知各种各样的载体，也存在许多市售品。本领域技术人员可以根据宿主的种类而容易地选择适当的载体。作为载体的具体例，可以举出pET系列和pUC系列等。

重组载体的制备方法自身是众所周知的常规方法。作为在适当的载体中***突变基因而对宿主进行转化的具体方法，可以举出电穿孔法和钙法等。

本发明中，作为宿主，可以举出动物细胞、微生物和植物细胞等。

作为动物细胞没有特别限定，可以举出昆虫细胞、猴细胞COS-7、Vero、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞和CHO细胞等。

作为昆虫细胞没有特别限定，可以举出Sf9细胞和Sf21细胞等。

作为微生物没有特别限定，可以举出细菌和酵母等。

作为细菌，包含真细菌和古细菌。

真细菌包含革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。作为革兰氏阴性细菌，可以举出埃希氏菌属菌(Escherichia)、栖热菌属菌(Thermus)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、希瓦氏菌属菌(Shewanella)、弧菌属菌(Vibrio)、沙门氏菌属菌(Salmonella)、醋酸杆菌属(Acetobacter属)、集胞藻属(Synechocystis属)等。作为革兰氏阳性菌，可以举出芽孢杆菌属(Bacillus属)、链霉菌属(Streptmyces属)、棒状杆菌属(Corynebacterium属)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus属)、双歧杆菌属(Bifidobacterium属)、乳球菌属(Lactococcus属)、肠球菌属(Enterococcus属)、片球菌属(Pediococcus属)、明串珠菌属(Leuconostoc属)和链霉菌属(Streptomyces属)等。

作为植物细胞没有特别限定，可以举出BY-2细胞等。

本发明中，作为宿主，从克隆的容易性的观点出发，优选为微生物，进一步优选为埃希氏菌属菌(Escherichia)、栖热菌属菌(Thermus)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、希瓦氏菌属菌(Shewanella)、弧菌属菌(Vibrio)、沙门氏菌属菌(Salmonella)、醋酸杆菌属(Acetobacter属)、集胞藻属(Synechocystis属)、芽孢杆菌属(Bacillus属)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus属)，特别优选为埃希氏菌属菌(Escherichia)、希瓦氏菌属菌(Shewanella)、芽孢杆菌属(Bacillus属)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus属)。

培养根据常规方法进行即可，即接种于含有微生物能够同化的碳源、氮源及其它必须营养素的培养基中。

本发明中，作为由培养液采集和纯化(B-2)的方法，可以根据常规方法进行。例如，可以通过离心分离或过滤从培养物除去菌体，利用常规方法手段由所得到的培养上清液浓缩出目标酶。如此得到的酶液或干燥粉末既可以直接使用，也可以进而利用公知的方法进行结晶化或造粒化。

本发明中，(C)具有与氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)。从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，氨基酸序列(Y)与氨基酸序列(Y’)的同源性优选为具有90%以上的同源性，进一步优选具有95%以上的同源性，最优选具有97%以上的同源性。

氨基酸序列的同源性使用美国国家生物技术信息中心提供的同源性分析程序“BLAST”的blastp算法来解析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

作为具有与氨基酸序列(Y)具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)的蛋白质性蛋白酶抑制剂(C)，具体地说，可以举出序列号30～36的蛋白质性蛋白酶抑制剂。

从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，作为(C)，优选序列号30～32和34～36的蛋白质性蛋白酶抑制剂。另外，作为(C)，从蛋白酶活性的持续性的观点出发，优选序列号31和33～36的蛋白质性蛋白酶抑制剂。

(C)包括由天然物提取的蛋白质性蛋白酶抑制剂(C-1)和宿主生产的蛋白质性蛋白酶抑制剂(C-2)。

由天然物提取的蛋白质性蛋白酶抑制剂(C-1)是具有与(B)的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列(Y’)的蛋白质性蛋白酶抑制剂，其满足上述(1)～(8)中至少1个条件，并包括由天然物(例如，植物或动物的细胞、细胞外组织、种子、微生物的菌体内和菌体外分泌物等)提取的蛋白质性蛋白酶抑制剂。

(C-1)的氨基酸序列可以利用肽图法等一般的方法来确定。

另外，关于由天然物提取的蛋白质是否符合(C-1)，可以利用肽图法等一般的方法确定提取蛋白质的氨基酸序列，使用日本DNA数据银行(DNAデータバンクジャパン)提供的序列比较程序“ClustalW”(http：//clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)对与(B)相当的序列部分进行检索，进而使用美国国家生物技术信息中心提供的同源性分析程序“BLAST”的blastp算法对与(B)相当的序列部分和(B)的同源性进行解析，由此能够确认同源性是否为80%以上(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

作为宿主生产的蛋白质性蛋白酶抑制剂(C-2)，包括如下获得的物质：使用通过日本专利第3338441号公报中记载的基因重组法所重组的基因，在适当的宿主中转化，培养该重组宿主，从培养物采集而得到该物质。

具体地说，对编码与(B)的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列、或上述(1)～(8)的条件中指定的部位以外的氨基酸序列与(B)具有80%以上的同源性的氨基酸序列的基因序列进行克隆，将所克隆的基因序列的一部分置换成编码满足上述(1)～(8)中至少1个条件的氨基酸序列的基因，使用如此得到的突变基因在适当的宿主中转化，培养该重组宿主，由培养物采集而得到该物质。

使用上述突变基因生产(C-2)的方法为：对于适合于在目标宿主内表达基因的任意载体，使用引入了上述突变基因的重组载体对宿主进行转化，得到包含重组载体的转化体。培养所得到的转化体，由该培养液采集(C-2)即可。

本发明中，重组载体可以通过在适当的载体中***上述突变基因而得到。作为载体的具体例，与上述(B-2)相同。

另外，作为宿主，优选与上述(B-2)同样的宿主。

本发明中，作为由培养液采集和纯化(C-2)的方法，可以根据常规方法进行。例如，可以通过离心分离或过滤从培养物除去菌体，利用常规方法手段由所得到的培养上清液浓缩出目标酶。如此得到的酶液或干燥粉末既可以直接使用，也可以进而利用公知的方法进行结晶化或造粒化。

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B)和(C)能够与公知的蛋白酶抑制剂同样地使用。

另外，本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂(B)和(C)能够抑制蛋白酶的活性，在稀释时能够高效地恢复蛋白酶的活性，因此以蛋白酶保存用添加剂和衣物用清洗剂用添加剂为代表，作为餐具用洗涤剂、纤维处理剂和食品加工剂的添加剂是有用的。

本发明的蛋白质溶液是包含上述蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶(D)和溶剂(E)的溶液。

本发明的蛋白质溶液中，蛋白质性蛋白酶抑制剂为上述(B)和/或(C)。

从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，蛋白质溶液中的蛋白质性蛋白酶抑制剂的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0.000001～50重量%，进一步优选为0.00005～30重量%，特别优选为0.0001～20重量%。

作为蛋白酶(D)，可以使用一般作为蛋白酶已知的蛋白酶，包括在低温(0～50℃)具有蛋白酶活性的最佳温度的低温最佳蛋白酶和在高温(超过50℃)具有最佳温度的高温最佳蛋白酶。作为(D)，从活性的有效性的观点出发，优选为丝氨酸蛋白酶，进一步优选为枯草杆菌蛋白酶。作为市售的蛋白酶，可以举出例如诺维信社制造的碱性蛋白酶、赛威蛋白酶(Savinase)、艾威蛋白酶(Everlase)、PTN和杰能科社的PURAFECT、PURAFECT OXP等。

从蛋白质的分解性的观点出发，蛋白质溶液中的蛋白酶(D)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0.001～10重量%，进一步优选为0.005～5重量%，特别优选为0.01～2重量%。

从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，蛋白质溶液中的蛋白质性蛋白酶抑制剂与蛋白酶(D)的摩尔比(蛋白质性蛋白酶抑制剂/(D))优选为1～1000，进一步优选为1～100。

作为溶剂(E)，可以举出水和亲水性溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、二乙二醇和丙二醇等)以及它们的混合物等。另外，作为水没有特别限定，可以举出自来水、离子交换水、蒸馏水和反渗透水等。另外，可以举出在水中含有pH调节剂的缓冲水溶液等。

作为pH调节剂，可以使用现有的pH调节剂，可以举出硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、硫酸、盐酸、柠檬酸、乳酸、丙酮酸、甲酸、氯化钠、氯化钾、单乙醇胺和二乙醇胺等。

从蛋白酶和蛋白质性蛋白酶抑制剂的稳定性的观点出发，蛋白质溶液中的溶剂(E)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为40～99.9989999重量%，进一步优选为65～99.99495重量%，特别优选为78～99.9899重量%。

除了蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶(D)和溶剂(E)以外，本发明的蛋白质溶液还可以含有表面活性剂(F)、盐(G)、糖(H)、氨基酸(I)、脂肪酸(Q)、油脂(N)、其它低分子有机化合物(J)和蛋白酶以外的蛋白质(M)。

作为表面活性剂(F)，可以举出与作为后述洗涤剂组合物的必须成分的表面活性剂(F)同样的物质，优选的物质也相同。

作为盐(G)，可以举出无机盐(氯化钠、硼酸钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸铵等)和有机盐(甲酸钠等)。

作为糖(H)，可以举出海藻糖、蔗糖、糊精、环糊精、麦芽糖、果糖、透明质酸和硫酸软骨素等。

作为氨基酸(I)，可以举出甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和它们的盐等。

作为脂肪酸(Q)，可以举出油酸、亚油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等。

作为油脂(N)，可以举出上述脂肪酸(Q)的单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯。

作为其它低分子有机化合物(J)，可以举出乙酸苄酯、水杨酸甲酯、水杨酸苄酯、羟基苯甲酸、肉桂酸、咖啡酸、儿茶素类、抗坏血酸和类胡萝卜素等。

作为蛋白酶以外的蛋白质(M)没有特别限定，可以举出蛋白酶以外的酶、重组蛋白、抗体和肽等，具体地说，可以举出纤维素酶、血清白蛋白、胶原蛋白、酪蛋白、明胶和丝肽等。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的表面活性剂(F)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～90重量%，进一步优选为0～85重量%，特别优选为0～80重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的盐(G)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～10重量%，进一步优选为0～5重量%，特别优选为0～3重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的糖(H)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的氨基酸(I)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的其它低分子有机化合物(J)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的脂肪酸(Q)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的油脂(N)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从蛋白质的稳定性的观点出发，本发明的蛋白质溶液中所含有的蛋白酶以外的蛋白质(M)的含量相对于蛋白质溶液的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从蛋白酶活性的适度的抑制的观点出发，表示本发明的蛋白质溶液的蛋白酶活性为何种程度的残存活性优选为10%以下。

残存活性通过下述方法求出。

<残存活性的测定方法>

将含有一定量的蛋白酶(D)、一定量的蛋白质性蛋白酶抑制剂和一定量的溶剂(E)的上述蛋白质溶液与底物溶液(含有例如酪蛋白、偶氮酪蛋白或苯甲酰精氨酸乙酯等的水溶液)混合，制作溶液(i)。

关于溶液(i)的温度，在20～70℃的范围内、在蛋白酶(D)的活性不失活而具有活性、能够进行吸光度的测定的温度条件下，在测定的期间能够恒定地保持温度即可。

关于溶液(i)中的底物的摩尔浓度，为米氏常数K_m的3分之1倍～2倍、且为溶液(i)中的蛋白酶(D)的摩尔浓度的5～100,000倍的浓度即可。米氏常数是底物与蛋白酶的反应中的米氏常数，通过利用Agarwal等报道的方法(Methods of enzymology,1978,Vol.51,P483-491中记载的方法)求出酶反应初速度的底物浓度依赖性而求出。

关于溶液(i)，使用分光光度计，在波长为300～450nm的范围内，经时地测定底物被蛋白酶分解所生成的生成物具有最大吸收的波长下的吸光度A_λ。测定时的温度是与制作溶液(i)时的温度相同的温度。测定刚制作出溶液(i)不久后的吸光度A_λ0和自制作出溶液(i)起h小时后的吸光度A_λh，求出吸光度的变化ΔA_λ(ΔA_λ=A_λh-A_λ0)。测定时间因酶的活性而异，在吸光度不超过0.8的范围内观察到变化0.1以上即可。以吸光度的变化ΔA_λ为纵轴、以时间h为横轴作图，求出直线的斜率(系数v₁)。

另外，使用在上述蛋白质溶液中将蛋白质性蛋白酶抑制剂用相同重量的溶剂(E)置换所制作的蛋白质溶液，与底物溶液混合，在与上述溶液(i)同样的条件下制作溶液(ii)。

对于溶液(ii)，也同样地以吸光度的变化ΔA_λ为纵轴、以时间h为横轴作图，求出直线的斜率(系数v₀)，代入下述数式(1)，计算出残存活性。

残存活性(%)=v₁/v₀×100(1)

本发明的洗涤剂组合物是含有蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶(D)、溶剂(E)和表面活性剂(F)的洗涤剂组合物。通过含有上述蛋白质性蛋白酶抑制剂，即使在长期保存后也能够保持良好的清洗性。

本发明的洗涤剂组合物中，蛋白质性蛋白酶抑制剂为上述(B)和(C)。另外，在洗涤剂组合物中包含时优选的蛋白质性蛋白酶抑制剂是与作为上述(B)和(C)优选的物质相同的物质。

从蛋白酶活性的适度的抑制和稀释时的蛋白酶活性的恢复容易性的观点出发，洗涤剂组合物中的蛋白质性蛋白酶抑制剂的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0.000001～50重量%，进一步优选为0.00005～20重量%，特别优选为0.0001～10重量%。通过以该范围含有，在保存时能够高效地抑制蛋白酶的活性，另外，在清洗时能够高效地提高清洗性。

作为蛋白酶(D)，与上述蛋白质溶液中使用的蛋白酶同样地，可以使用通常作为蛋白酶已知的蛋白酶，优选为丝氨酸蛋白酶，进一步优选为枯草杆菌蛋白酶。作为市售的蛋白酶，可以举出例如诺维信社制的碱性蛋白酶、赛威蛋白酶、艾威蛋白酶、PTN、和杰能科社的PURAFECT、PURAFECT OXP等。

从清洗性的观点出发，洗涤剂组合物中的蛋白酶(D)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0.001～10重量%，进一步优选为0.005～3重量%，特别优选为0.01～1重量%。

从清洗性的观点出发，洗涤剂组合物中的蛋白质性蛋白酶抑制剂与蛋白酶(D)的摩尔比(蛋白质性蛋白酶抑制剂/蛋白酶(D))优选为1～1000，进一步优选为1～100。

作为溶剂(E)，与上述蛋白质溶液中使用的溶剂(E)同样地，可以举出水和亲水性溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、二乙二醇和丙二醇等)以及它们的混合物等。另外，作为水没有特别限定，可以举出自来水、离子交换水、蒸馏水和反渗透水等。另外，可以举出在水中含有pH调节剂的缓冲水溶液等。

从蛋白酶和蛋白质性蛋白酶抑制剂的稳定性的观点出发，洗涤剂组合物中的溶剂(E)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为1～95重量%，进一步优选为17～90重量%，特别优选为29～80重量%。

表面活性剂(F)可以举出非离子型表面活性剂(F-1)、阴离子型表面活性剂(F-2)、阳离子型表面活性剂(F-3)和两性表面活性剂(F-4)。

作为非离子型表面活性剂(F-1)，可以举出环氧烷加成型非离子型表面活性剂(F-1-1)和多元醇型非离子表面活性剂(F-1-2)等。

作为(F-1-1)，可以举出脂肪族醇(碳原子数为8～24)亚烷基(碳原子数为2～4、优选为2)氧化物加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)、烷基(碳原子数为1～18)苯酚环氧乙烷(下文中简记为EO)加成物(加成摩尔数为1～100)、高级胺(碳原子数为8～24)亚烷基(碳原子数为2～4、优选为2)氧化物加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)、脂肪酸(碳原子数为8～24)EO加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)、聚丙二醇(分子量200～4000)EO加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)、聚氧乙烯(聚合度=3～30)烷基(碳原子数为6～20)烯丙基醚以及山梨糖醇酐单月桂酸酯EO加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)和山梨糖醇酐单油酸酯EO加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)等多元(2～8元或其以上)醇(碳原子数为2～30)的脂肪酸(碳原子数为8～24)酯EO加成物(每个活性氢的加成摩尔数为1～100)等。

作为(F-1-2)，可以举出甘油单硬脂酸酯、甘油单油酸酯、山梨糖醇酐单月桂酸酯和山梨糖醇酐单油酸酯等多元(2～8元或其以上)醇(碳原子数为2～30)的脂肪酸(碳原子数为8～24)酯以及月桂酸单乙醇酰胺和月桂酸二乙醇酰胺等脂肪酸烷醇酰胺等。

作为阴离子型表面活性剂(F-2)，可以举出碳原子数为8～24的烷基醚羧酸或其盐和碳原子数为8～24的烷基(聚)氧乙烯醚羧酸或其盐[(聚)氧乙烯(聚合度=1～100)月桂基醚乙酸钠和(聚)氧乙烯(聚合度=1～100)月桂基磺基琥珀酸2钠等]、碳原子数为8～24的烷基硫酸酯盐和碳原子数为8～24的烷基(聚)氧乙烯硫酸酯盐[月桂基硫酸钠、月桂基(聚)氧乙烯(聚合度=1～100)硫酸钠和月桂基(聚)氧乙烯(聚合度=1～100)硫酸-三乙醇胺盐等]、椰子油脂肪酸单乙醇酰胺硫酸磺酸钠、碳原子数为8～24的烷基苯基磺酸盐[十二烷基苯磺酸钠等]、碳原子数为8～24的烷基磷酸酯盐和碳原子数为8～24的烷基(聚)氧乙烯磷酸酯盐[月桂基磷酸钠和(聚)氧乙烯(聚合度=1～100)月桂基醚磷酸钠等]、脂肪酸盐[月桂酸钠和月桂酸三乙醇胺等]、酰基化氨基酸盐[椰子油脂肪酸甲基牛磺酸钠、椰子油脂肪酸肌氨酸钠、椰子油脂肪酸肌氨酸三乙醇胺、N-椰子油脂肪酸酰基-L-谷氨酸三乙醇胺、N-椰子油脂肪酸酰基-L-谷氨酸钠和月桂酰甲基-β-丙氨酸钠等]等。

作为阳离子型表面活性剂(F-3)，可以举出季铵盐型[硬脂基三甲基氯化铵、山嵛基三甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵和乙基硫酸羊毛脂脂肪酸氨基丙基乙基二甲基铵等]和胺盐型[硬脂酸二乙基氨基乙基酰胺乳酸盐、二月桂基胺盐酸盐和油胺乳酸盐等]等。

作为两性表面活性剂(F-4)，可以举出甜菜碱型两性表面活性剂[椰子油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜碱、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱、2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱、月桂基羟基磺基甜菜碱和月桂酰胺乙基羟乙基羧甲基甜菜碱羟丙基磷酸钠等]以及氨基酸型两性表面活性剂[β-月桂基氨基丙酸钠等]等。

作为(F)，可以使用1种或2种以上。在使用2种以上的情况下，作为其组合，可以举出例如非离子型表面活性剂与阴离子型表面活性剂的组合、非离子型表面活性剂与阳离子型表面活性剂的组合以及非离子型表面活性剂与两性表面活性剂的组合等。

从清洗性的观点出发，作为(F)优选单独使用非离子型表面活性剂，以及组合使用非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂。

从清洗性的观点出发，作为非离子型表面活性剂(F-1)，优选为脂肪族醇(碳原子数为8～24)EO加成物(加成摩尔数为1～100)，进一步优选为脂肪族醇(碳原子数为12～18)EO加成物(加成摩尔数为4～20)，更进一步优选为脂肪族醇(碳原子数为12～15)EO加成物(加成摩尔数8～12)，特别优选为油醇EO11摩尔加成物。

从清洗性的观点出发，作为阴离子型表面活性剂(F-2)，优选为碳原子数为8～24的烷基苯基磺酸盐、脂肪酸盐、碳原子数为8～24的烷基硫酸酯盐和碳原子数为8～24的烷基(聚)氧乙烯硫酸酯盐，进一步优选为碳原子数为12～16的烷基苯基磺酸盐和碳原子数为8～16的脂肪酸盐，更进一步优选为十二烷基苯磺酸单乙醇胺盐和月桂酸钠。

从清洗性的观点出发，洗涤剂组合物中所含有的表面活性剂(F)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为1～70重量%，进一步优选为5～60重量%，特别优选为10～60重量%。

根据需要，还可以在洗涤剂组合物中含有公知的其它成分、例如日本特开2004-27181号公报中记载的助洗剂、螯合剂、消泡剂、荧光增白剂、漂白剂、柔软剂、除菌剂、香料和着色剂等。

作为助洗剂，可以举出聚羧酸盐(丙烯酸盐均聚物和马来酸盐均聚物等)、多元羧酸盐(柠檬酸和苹果酸等)、和碱性助洗剂(苛性钠、纯碱、氨、三乙醇胺、三聚磷酸钠和硅酸钠等)等。作为螯合剂，可以举出EDTA和NTA等。作为消泡剂，可以举出硅酮系消泡剂、聚氧化烯系消泡剂和矿物油系消泡剂等。

在其它成分中，助洗剂和螯合剂的含量基于洗涤剂组合物、助洗剂和螯合剂的总重量优选为10重量%以下，进一步优选为5重量%以下。

基于洗涤剂组合物、荧光增白剂、漂白剂、柔软剂、除菌剂、香料、着色剂和消泡剂的总重量，荧光增白剂、漂白剂、柔软剂、除菌剂、香料、着色剂和消泡剂的含量优选为5重量%以下，进一步优选为2重量%以下。

在洗涤剂组合物中，除了上述物质以外，还可以根据需要含有盐(G)、糖(H)、氨基酸(I)、脂肪酸(Q)、油脂(N)、其它低分子有机化合物(J)和蛋白酶以外的蛋白质(M)。

作为盐(G)、糖(H)、氨基酸(I)、其它低分子有机化合物(J)、脂肪酸(Q)、油脂(N)和蛋白酶以外的蛋白质(M)，可以举出与作为蛋白质溶液中能够含有的物质所举出的物质相同的物质。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的盐(G)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～10重量%，进一步优选为0～5重量%，特别优选为0～3重量%。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的糖(H)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的氨基酸(I)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的其它低分子有机化合物(J)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的脂肪酸(Q)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的油脂(N)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

从清洗性的观点出发，本发明的洗涤剂组合物中所含有的蛋白酶以外的蛋白质(M)的含量相对于洗涤剂组合物的重量优选为0～50重量%，进一步优选为0～30重量%，特别优选为0～20重量%。

本发明的洗涤剂组合物通过混合各成分而获得，对制造方法没有特别限定。下面示出一例。

(1)在具备搅拌机和加热冷却装置的混合槽中，对投入顺序没有特别限制地投入表面活性剂(F)和溶剂(E)以及其它成分，在20～50℃搅拌至均匀。

(2)添加蛋白质性蛋白酶抑制剂，在20～50℃搅拌30分钟～2小时。

(3)加入蛋白酶(D)，进而在20～50℃搅拌至均匀。

上述洗涤剂组合物能够用于衣物用清洗剂、自动餐具清洗机用清洗剂和隐形眼镜用清洗剂等。

洗涤剂组合物的使用方法可以与现有的洗涤剂组合物的使用方法相同，没有特别限定。下面示出作为衣物用清洗剂的使用方法的一例。

(1)在装有洗涤物的洗衣机中放满自来水，于25℃添加洗涤剂组合物，轻轻地搅拌而使其溶解。

(2)用洗衣机清洗洗涤物。

(3)从洗衣机除去液体，用自来水漂洗1～2次。

(4)适宜进行脱水。

实施例

利用以下的实施例、比较例来更详细地说明本发明，但是本发明不限定于此。

<制造例1>

用限制酶NcoI、BamHI处理对序列号1的氨基酸序列进行编码的基因(序列号106)(在5‘末端侧附加了限制酶NcoI识别序列、在3’末端侧附加了限制酶BamHI识别序列、委托Hokkaido System Science社人工合成的基因)，与pET-22b质粒(Novagen社制造)的NcoI限制酶位点和BamHI限制酶位点结合，制作表达序列号1的蛋白质的质粒(P1)。使用该质粒和用于将12位的谷氨酸置换成天冬氨酸的突变导入用引物(序列号42、43)，按照以下条件对质粒(P1)进行突变导入。即，将质粒(P1)0.5μL(10ng)、10μM的突变导入用引物各0.75μL(7.5pg)、10倍浓度的PCR用缓冲液2.5μL(宝生物社制造)、2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液2μL(宝生物社制造)、DNA聚合酶ExTaq0.25μL(宝生物社制造)和去离子水17μL混合后，用TaKaRa Thermal Cycler Dice(宝生物社制造)进行PCR。关于反应条件，在94℃进行2分钟的热变性后，以98℃10秒、50℃10秒、68℃6.5分钟进行30循环。用QIAquick GelExtruction Kit(Qiagen社制造)对所得到的PCR产物进行纯化后(50μL)，加入6μL的10倍浓度的DpnI用缓冲液和3μL的限制酶DpnI(宝生物社制造)，在37℃用1小时分解模板。将所得到的限制酶处理PCR产物5μL供于对大肠杆菌DH5α的转化。即，将限制酶处理PCR产物5μL添加到100μL的E.Coli DH5α感受态细胞(TOYOBO社制造)中，在冰上保存30分钟后，在42℃加热90秒。此处添加SOC培养基(TOYOBO社制造)900μL，在37℃静置培养1小时。将培养液中的100μL涂布于LB/氨苄青霉素培养皿，在37℃培养一晩。将所出现的菌落用LB培养基1mL培养12小时后，供于Quantumprep MiniprepKit(Bio-Rad社制造)，对表达序列号2的蛋白质的质粒(P2)(100μL)进行了纯化。对于所得到的质粒，委托DNA序列分析服务(Macrogen Japan社)进行分析，确认导入了突变。

<制造例2>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号44、45)，利用同样的方法将序列号1的12位的谷氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号3的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P3)。

<制造例3>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号46、47)，利用同样的方法将序列号1的38位的缬氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号4的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P4)。

<制造例4>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号48、49)，利用同样的方法将序列号1的38位的缬氨酸置换成亮氨酸，得到表达序列号5的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P5)。

<制造例5>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号50、51)，利用同样的方法将序列号1的38位的缬氨酸置换成异亮氨酸，得到表达序列号6的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P6)。

<制造例6>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号52、53)，利用同样的方法将序列号1的48位的蛋氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号7的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P7)。

<制造例7>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号54、55)，利用同样的方法将序列号1的48位的蛋氨酸置换成甘氨酸，得到表达序列号8的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P8)。

<制造例8>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号56、57)，利用同样的方法将序列号1的50位的酪氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号9的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P9)。

<制造例9>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号58、59)，利用同样的方法将序列号1的50位的酪氨酸置换成亮氨酸，得到表达序列号10的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P10)。

<制造例10>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号60、61)，利用同样的方法将序列号1的50位的酪氨酸置换成苯丙氨酸，得到表达序列号11的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P11)。

<制造例11>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号62、63)，利用同样的方法将序列号1的51位的精氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号12的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P12)。

<制造例12>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号64、65)，利用同样的方法将序列号1的51位的精氨酸置换成赖氨酸，得到表达序列号13的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P13)。

<制造例13>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号66、67)，利用同样的方法将序列号1的51位的精氨酸置换成组氨酸，得到表达序列号14的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P14)。

<制造例14>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号68、69)，利用同样的方法将序列号1的52位的异亮氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号15的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P15)。

<制造例15>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号70、71)，利用同样的方法将序列号1的52位的异亮氨酸置换成缬氨酸，得到表达序列号16的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P16)。

<制造例16>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号72、73)，利用同样的方法将序列号1的53位的天冬氨酸置换成谷氨酸，得到表达序列号17的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P17)。

<制造例17>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号74、75)，利用同样的方法将序列号1的53位的天冬氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号18的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P18)。

<制造例18>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号76、77)，利用同样的方法将序列号1的70位的精氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号19的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P19)。

<制造例19>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号78、79)，利用同样的方法将序列号1的70位的精氨酸置换成甘氨酸，得到表达序列号20的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P20)。

<制造例20>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号80、81)，利用同样的方法将序列号1的70位的精氨酸置换成赖氨酸，得到表达序列号21的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P21)。

<制造例21>

使用制造例3中得到的质粒(P4)(将38位的缬氨酸置换成丙氨酸)和用于将51位的精氨酸和52位的异亮氨酸分别置换成丙氨酸的突变导入用引物(序列号82、83)，按照以下的条件对质粒(P4)进行突变导入。即，将质粒(P4)0.5μL(10ng)、10μM的突变导入用引物各0.75μL(7.5pg)、10倍浓度的PCR用缓冲液2.5μL(宝生物社制造)、2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液2μL(宝生物社制造)、DNA聚合酶ExTaq0.25μL(宝生物社制造)和去离子水17μL混合后，用TaKaRa Thermal Cycler Dice(宝生物社制造)进行PCR。关于反应条件，在94℃进行2分钟的热变性后，以98℃10秒、50℃10秒、68℃6.5分钟进行30循环。用QIAquick GelExtruction Kit(Qiagen社制造)对所得到的PCR产物进行纯化后(50μL)，加入6μL的10倍浓度的DpnI用缓冲液和3μL的限制酶DpnI(宝生物社制造)，在37℃用1小时分解模板。

将所得到的限制酶处理PCR产物5μL供于对大肠杆菌DH5α的转化。即，将限制酶处理PCR产物5μL添加到100μL的E.Coli DH5α感受态细胞(TOYOBO社制造)中，在冰上保存30分钟后，在42℃加热90秒。此处添加SOC培养基(TOYOBO社制造)900μL，在37℃静置培养1小时。将培养液中的100μL涂布于LB/氨苄青霉素培养皿，在37℃培养一晩。将所出现的菌落用LB培养基1mL培养12小时后，供于Quantumprep Miniprep Kit(Bio-Rad社制造)，对表达序列号22的蛋白质的质粒(P22)(100μL)进行纯化。对于所得到的质粒，委托DNA序列分析服务(Macrogen Japan社)进行分析，确认导入了突变。

<制造例22>

制造例21中，将突变导入用引物(序列号82、83)替代为突变导入用引物(序列号84、85)，利用同样的方法将序列号1的38位的缬氨酸、52位的异亮氨酸和53位的天冬氨酸均置换成丙氨酸，得到表达序列号23的蛋白质的质粒(P23)。

<制造例23>

制造例21中，代替“制造例3中得到的质粒(P4)”而使用“制造例7中得到的质粒(P8)”，代替“突变导入用引物(序列号82、83)”而使用“突变导入用引物(序列号76、77)”，利用同样的方法将序列号1的48位的蛋氨酸置换成甘氨酸，将70位的精氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号24的蛋白质的质粒(P24)。

<制造例24>

制造例23中，代替“质粒(P8)”而使用“质粒(P4)”，利用同样的方法将序列号1的38位的缬氨酸和70位的精氨酸置换成丙氨酸，得到表达序列号25的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P25)。

<制造例25>

用限制酶NcoI、BamHI处理对序列号26的氨基酸序列进行编码的基因(序列号107)(在5‘末端侧附加了限制酶NcoI识别序列、在3’末端侧附加了限制酶BamHI识别序列、委托Hokkaido System Science社人工合成的基因)，与pET-22b质粒(Novagen社制造)的NcoI限制酶位点和BamHI限制酶位点结合，制作表达将序列号1的12位的谷氨酸置换成天冬氨酸；将38位的缬氨酸、48位的蛋氨酸、50位的酪氨酸、51位的精氨酸、52位的异亮氨酸、53位的天冬氨酸和70位的精氨酸置换成丙氨酸的序列号26的蛋白质的质粒(P26)。

<制造例26>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号86、87)，利用同样的方法将序列号1的12位的谷氨酸置换成赖氨酸，得到表达序列号27的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P27)。

<制造例27>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号88、89)，利用同样的方法将序列号1的50位的酪氨酸置换成甘氨酸，得到表达序列号28的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P28)。

<制造例28>

代替制造例1的突变导入用引物(序列号42、43)而使用突变导入用引物(序列号90、91)，利用同样的方法将序列号1的70位的精氨酸置换成天冬酰胺，得到表达序列号29的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P29)。

<制造例29>

用限制酶NcoI、BamHI处理对序列号41的氨基酸序列进行编码的基因(序列号108)(在5‘末端侧附加了限制酶NcoI识别序列、在3’末端侧附加了限制酶BamHI识别序列、委托Hokkaido System Science社人工合成的基因)，与pET-22b质粒(Novagen社)的NcoI限制酶位点和BamHI限制酶位点结合，制作表达序列号41的蛋白质的质粒(P41)。使用该质粒和用于将24位的谷氨酸置换成丙氨酸的突变导入用引物(序列号92、93)，按照以下的条件对质粒(P41)进行突变导入。即，将质粒(P41)0.5μL(10ng)、10μM的突变导入用引物各0.75μL(7.5pg)、10倍浓度的PCR用缓冲液2.5μL(宝生物制造)、2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液2μL(宝生物制造)、DNA聚合酶ExTaq0.25μL(宝生物制造)和去离子水17μL混合后，用TaKaRaThermal Cycler Dice(宝生物制造)进行PCR。关于反应条件，在94℃进行2分钟的热变性后，以98℃10秒、50℃10秒、68℃6.5分钟进行30循环。用QIAquick Gel Extruction Kit(Qiagen社制造)对所得到的PCR产物进行纯化后(50μL)，加入6μL的10倍浓度的DpnI用缓冲液和3μL的限制酶DpnI(宝生物社制造)，在37℃用1小时分解模板。将所得到的限制酶处理PCR产物5μL供于对大肠杆菌DH5α的转化。即，将限制酶处理PCR产物5μL添加到100μL的E.Coli DH5α感受态细胞(TOYOBO社制造)中，在冰上保存30分钟后，在42℃加热90秒。此处添加SOC培养基(TOYOBO社制造)900μL，在37℃静置培养1小时。将培养液中的100μL涂布于LB/氨苄青霉素培养皿，在37℃培养一晩。将所出现的菌落用LB培养基1mL培养12小时后，供于Quantumprep Miniprep Kit(Bio-Rad社制造)，对表达序列号30的蛋白质的质粒(P30)(100μL)进行纯化，所述序列号30的蛋白质中与氨基酸序列(A)的12位相当的24位的位置的氨基酸是丙氨酸，所述序列号30的蛋白质与作为(B)的序列号3具有90%的同源性。对于所得到的质粒，委托DNA序列分析服务(Macrogen Japan社)进行分析，确认导入了突变。

<制造例30>

代替制造例29的突变导入用引物(序列号92、93)而使用突变导入用引物(序列号94、95)，利用同样的方法将序列号41的50位(与序列号1的38位相当)的异亮氨酸置换成丙氨酸，得到表达与作为(B)的序列号4具有90%的同源性的序列号31的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P31)。

<制造例31>

代替制造例29的突变导入用引物(序列号92、93)而使用突变导入用引物(序列号96、97)，利用同样的方法将序列号41的62位(与序列号1的50位相当)的酪氨酸置换成丙氨酸，得到表达与作为(B)的序列号9具有90%的同源性的序列号32的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P32)。

<制造例32>

代替制造例29的突变导入用引物(序列号92、93)而使用突变导入用引物(序列号98、99)，利用同样的方法将序列号41的63位(与序列号1的51位相当)的精氨酸置换成丙氨酸，得到表达与作为(B)的序列号12具有90%的同源性的序列号33的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P33)。

<制造例33>

代替制造例29的突变导入用引物(序列号92、93)而使用突变导入用引物(序列号100、101)，利用同样的方法将序列号41的64位(与序列号1的52位相当)的异亮氨酸置换成丙氨酸，得到表达与作为(B)的序列号15具有90%的同源性的序列号34的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P34)。

<制造例34>

代替制造例29的突变导入用引物(序列号92、93)而使用突变导入用引物(序列号102、103)，利用同样的方法将序列号41的65位(与序列号1的53位相当)的天冬氨酸置换成丙氨酸，得到表达与作为(B)的序列号18具有90%的同源性的序列号35的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P35)。

<制造例35>

代替制造例29的突变导入用引物(序列号92、93)而使用突变导入用引物(序列号104、105)，利用同样的方法将序列号41的82位(与序列号1的70位相当)的精氨酸置换成丙氨酸，得到表达与作为(B)的序列号19具有90%的同源性的序列号36的氨基酸序列的蛋白质的质粒(P36)。

[表1]

需要说明的是，将序列号2～28中序列号1的氨基酸序列中的被置换的氨基酸的位置、或序列号29～36中与序列号41的氨基酸序列中的被置换的氨基酸的位置相当的在序列号1的氨基酸序列中的位置、和置换后的氨基酸的种类示于表1。

<制造例36>

用限制酶NcoI、BamHI处理对序列号40的氨基酸序列进行编码的基因(序列号109)(在5‘末端侧附加了限制酶NcoI识别序列、在3’末端侧附加了限制酶BamHI识别序列、委托Hokkaido System Science社人工合成的基因)，与pET-22b质粒(Novagen社制造)的NcoI限制酶位点和BamHI限制酶位点结合，制作表达序列号40的蛋白质的质粒(P40)。

<制造例37>

用限制酶NcoI、BamHI处理对序列号1的氨基酸序列进行编码的基因(5’末端侧附加了限制酶NcoI识别序列、在3’端侧附加了限制酶BamHI识别序列、委托HokkaidoSystemScience社人工合成的基因)，与pET-22b质粒(Novagen社制造)的NcoI限制酶位点和BamHI限制酶位点结合，制作表达序列号1的蛋白质的质粒(P1)。

<制造例38>

用限制酶NcoI、BamHI处理对序列号41的氨基酸序列进行编码的基因(序列号108)(在5‘末端侧附加了限制酶NcoI识别序列、在3’末端侧附加了限制酶BamHI识别序列、委托Hokkaido System Science社人工合成的基因)，与pET-22b质粒(Novagen社)的NcoI限制酶位点和BamHI限制酶位点结合，制作表达与序列号1的同源性为97%的序列号41的蛋白质的质粒(P41)。需要说明的是，在序列号41的氨基酸序列中，关于与序列号1的12位、38位、48位、50位、51位、52位、53位和70位相当的部位，分别是：24位(与序列号1的12位相当)为谷氨酸，50位(与序列号1的38位相当)为异亮氨酸，60位(与序列号1的48位相当)为蛋氨酸，62位(与序列号1的50位相当)为酪氨酸，63位(与序列号1的51位相当)为精氨酸，64位(与序列号1的52位相当)为异亮氨酸，65位(与序列号1的53位相当)为天冬氨酸，82位(与序列号1的70位相当)为精氨酸。

<实施例1～34>

利用同样的方法，将制造例1～4和6～35中得到的蛋白质性蛋白酶抑制剂表达质粒(P2)～(P5)和(P7)～(P36)分别转化到大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)。将所得到的蛋白质性蛋白酶抑制剂表达株接种到LB培养液(含有氨苄青霉素100mg/L)1mL中，在30℃进行12小时培养，经整夜制作培养液，将0.5ml接种到LB培养液(含有氨苄青霉素100mg/L)5ml中，在30℃进行3小时振荡培养，制作7种前培养液。将7种前培养液分别接种到50mL的培养液{50mL水中的各成分的含量为：酵母提取物(日本制药社制造)1.2g、蛋白胨(日本制药社制造)0.6g、磷酸氢二钾0.47g、磷酸二氢钾0.11g、硫酸铵0.35g、磷酸氢二钠十二水合物0.66g、柠檬酸钠二水合物0.02g、甘油0.2g、乳清蛋白水解物1.5g、消泡剂(信越有机硅社制造、“KM-70”)0.3g、1mM硫酸镁、微量金属溶液(氯化钙18.9μg、氯化铁(III)500μg、硫酸锌七水合物9.0μg、硫酸铜5.1μg、氯化锰4水合物6.7μg、氯化钴4.9μg、乙二胺四乙酸四钠200μg)、100mg/L氨苄青霉素}中，使用微生物培养装置(ABLE社制造、制品名“BioJr.8”)，以维持pH6.8、30℃的状态进行培养。培养开始后加入0.15mL的1M IPTG溶液。培养开始14小时后，开始滴加甘油/蛋白质溶液(50%甘油、50g/L乳清蛋白水解物、33g/L消泡剂(信越有机硅社制造、“KM-70”)、100mg/L氨苄青霉素)。培养开始后，在第48小时回收培养液(K-1)～(K-34)。

用His-tag纯化用载体(GE Healthcare社制造Ni Sepharose6Fast Flow)分离所得到的培养液(K-1)～(K-34)，得到蛋白质性蛋白酶抑制剂溶液(L-1)～(L-34)。通过SDS-PAGE测定(L-1)～(L-34)中的蛋白质性蛋白酶抑制剂的量，结果全部为1g/L。

<比较例1～4>

实施例1中，代替“质粒(P2)”而分别使用“质粒(P1)、(P40)、(P41)和(P6)”，除此以外同样地得到蛋白质性蛋白酶抑制剂溶液(L’-1)～(L’-4)。通过SDS-PAGE测定(L’-1)～(L’-4)中的蛋白质性蛋白酶抑制剂的量，结果全部为1g/L。

对于使用质粒(P40)和质粒(P41)得到的蛋白质性蛋白酶抑制剂，使用同源性分析程序“BLAST”的blastp算法计算了同源性，结果与作为蛋白质性蛋白酶抑制剂(B)的序列号25的同源性分别为65%、89%。

<实施例35～68>

将实施例1～34中得到的蛋白质性蛋白酶抑制剂溶液(L-1)～(L-34)350μL和0.01重量%碱性蛋白酶溶液(产品名称“Alcalase2.5L”、用0.1M Tris/HCl和1mM CaCl₂的缓冲液(pH8、25℃)稀释、诺维信社制造)350μL混合，制作蛋白质溶液(S-1)～(S-34)，并在40℃静置20分钟。

<比较例5～8>

将比较例1～4中得到的蛋白质性蛋白酶抑制剂溶液(L’-1)～(L’-4)350μL和0.01重量%碱性蛋白酶溶液(产品名称“Alcalase2.5L”、用0.1M Tris/HCl和1mM CaCl₂的缓冲液(pH8、25℃)稀释、诺维信社制造)350μL混合，制作蛋白质溶液(S’-1)～(S’-4)，并在40℃静置20分钟。

[表2]

<使用实施例35～68和比较例5～8中得到的蛋白质溶液制作的蛋白质溶液的刚制作后的蛋白酶的残存活性的测定>

·蛋白质溶液(S)的活性的测定

对于实施例35～68和比较例5～8中得到的蛋白质溶液，在各自为700μL的刚制作后的蛋白质溶液(S-1)～(S-34)、(S’-1)和(S’-4)中，分别添加50mg/mL的偶氮酪蛋白(用0.1M Tris/HCl和1mM CaCl₂的缓冲液(pH8、25℃)溶解、Nacalai Tesque社制造)70μL，制作溶液(i)，开始酶反应。在刚制作溶液(i)后和每3分钟1次共3次从反应溶液中取出150μL，与15%三氯乙酸溶液200μL混合。以15,000×g的条件离心5分钟，在上清中加入0.1M NaOH400μL，使用分光光度计测定405nm的吸光度。将刚制作溶液(i)后的吸光度设为A_λ0，将自制作溶液(i)起h小时后的吸光度设为A_λh，以吸光度的变化ΔA_λ(ΔA_λ=A_λh-A_λ0)为纵轴、以时间h为横轴作图，求出直线的斜率(系数v₁)。

·空白的蛋白质溶液的活性的测定

接着，制作不含蛋白质性蛋白酶抑制剂的溶液，与上述同样地测定吸光度，求出直线的斜率(系数v₁)。

在0.01重量%碱性蛋白酶溶液(产品名称“Alcalase2.5L”、用0.1M Tris/HCl和1mMCaCl₂的缓冲液(pH8、25℃)稀释、诺维信社制造)350μL中混合缓冲液{0.1M Tris/HCl和1mM CaCl₂的缓冲液(pH8、25℃)}350μL，制作蛋白质溶液(T-1)，在40℃静置20分钟。

在上述“蛋白质溶液(S)的活性的测定”中，代替“蛋白质溶液(S-1)”而使用“蛋白质溶液(T-1)”，除此以外同样地制作溶液(ii)，测定吸光度，以吸光度的变化ΔA_λ(ΔA_λ=A_λh-A_λ0)为纵轴、以时间h为横轴作图，求出直线的斜率(系数v₀)。

由下述数学式(1)求出蛋白质溶液(S-1)～(S-34)和(S’-1)～(S’-4)的蛋白酶的残存活性，将结果示于表2。

残存活性(%)=v₁/v₀×100(1)

<刚制作后的稀释时的蛋白酶的活性测定>

对于实施例35～68和比较例5～8中得到的蛋白质溶液，将刚制作后的蛋白质溶液(S-1)～(S-34)和(S’-1)～(S’-4)分别用10μL、9990μL的缓冲液{0.1M Tris/HCl和1mMCaCl₂的缓冲液(pH8、25℃)}稀释，制成蛋白质稀释溶液(U-1)～(U-34)和(U’-1)～(U’-4)。

在上述“蛋白质溶液(S)的活性的测定”中，代替“蛋白质溶液(S-1)～(S-34)和(S’-1)～(S’-4)”而使用“蛋白质稀释溶液(U-1)～(U-34)和(U’-1)～(U’-4)”，代替“每3分钟1次共3次”而为“每30分钟1次共3次”，除此以外同样地求出刚制作后进行稀释时的蛋白酶活性。将结果示于表2。

<在25℃保存3个月后的蛋白酶的残存活性的测定>

将实施例35～68和比较例5～8中得到的蛋白质溶液(S-1)～(S-34)和(S’-1)～(S’-4)在25℃保存3个月。

在上述“刚制作后的蛋白酶的残存活性的测定”中，代替“刚制作后的蛋白质溶液”而为“在25℃保存3个月的蛋白质溶液”，除此以外同样地测定在25℃保存3个月后的蛋白酶的残存活性。将结果示于表2。

<在25℃保存3个月后的稀释时的蛋白酶的活性测定>

在上述“刚制作后的稀释时的蛋白酶的活性测定”中，代替“刚制作后的蛋白质溶液”而使用“在25℃保存3个月的蛋白质溶液”，除此以外同样地求出将实施例35～68和比较例5～8中得到的蛋白质溶液(S-1)～(S-34)和(S’-1)～(S’-4)在25℃保存3个月后的稀释时的蛋白酶的活性。将结果示于表2。

<蛋白酶活性的持续性>

将蛋白质溶液刚制作后的蛋白酶活性与在25℃保存3个月后的蛋白酶活性之比作为蛋白酶活性的持续性，利用下式算出。

蛋白酶活性的持续性(%)=(在25℃保存3个月后的蛋白酶活性)/(刚制作后的蛋白酶活性)×100

由表2的评价结果可知：含有序列号1或6的蛋白质性蛋白酶抑制剂的比较例5和8的蛋白质溶液虽然刚制作后的残存活性为0%，但是稀释时的蛋白酶活性低至10%，虽然能够抑制蛋白酶活性，但是无法使其恢复。另外，含有与氨基酸序列(A)的同源性为97%、且不满足本发明的条件(1)～(8)的序列号41的蛋白质性蛋白酶抑制剂的比较例7的蛋白质溶液在稀释时的蛋白酶活性也低至8%，可知无法恢复蛋白酶活性。

另外，可知含有与本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂的同源性为65%的蛋白质性蛋白酶抑制剂的比较例6的蛋白质溶液的蛋白酶活性的持续性低至2%，保存3个月后蛋白酶活性降低。

另一方面，可知与含有与本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂的同源性为65%的序列号40的蛋白质性蛋白酶抑制剂的比较例6的蛋白质溶液相比，含有本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂的实施例35～68的蛋白质溶液的残存活性低，通过添加相同浓度，能够高效地抑制蛋白酶活性。另外，可知在刚制作后的实施例35～68的蛋白质溶液中，稀释时的蛋白酶活性为18%以上，因而通过稀释，能够高效地恢复被抑制的蛋白酶活性。

此外，含有本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂的实施例35～68的蛋白质溶液在25℃保存3个月后的蛋白酶活性高达5%以上，蛋白酶活性的持续性也为6～98%，可知保存3个月后也维持了蛋白酶活性。

<实施例69～102>

以表3～表5中记载的比例，于25℃混配蛋白质性蛋白酶抑制剂溶液(L-1)～(L-34)、蛋白酶(D)、表面活性剂(F)、蛋白酶以外的蛋白质(M)、螯合剂和溶剂(E)，得到实施例69～102的洗涤剂组合物。

<比较例9～12>

以表5中记载的比例，于25℃混配蛋白质性蛋白酶抑制剂溶液(L’-1)～(L’-4)、蛋白酶(D)、表面活性剂(F)、蛋白酶以外的蛋白质(M)、螯合剂和溶剂(E)，得到比较例9～12的洗涤剂组合物。

[表3]

[表4]

[表5]

需要说明的是，在表3～表5中，以重量份示出各成分的比例。另外，表3～表5中的蛋白酶(D)使用下述物质。

碱性蛋白酶水溶液(通过SDS-PAGE推测碱性蛋白酶含量为0.1g/mL)：诺维信社制造、商品名“Alcalase2.5L”

另外，表3～5中的蛋白酶以外的蛋白质(M)使用下述物质。

纤维素酶水溶液(通过SDS-PAGE推测纤维素酶含量为0.01g/mL)：诺维信社制造、商品名“Endolase”

使用实施例69～102和比较例9～12中制作的洗涤剂组合物，进行下述的清洗性试验。

<清洗性试验>

<刚混配后的清洗去除率>

对于实施例69～102和比较例9～12中得到的洗涤剂组合物，在制作洗涤剂组合物后立即将洗涤剂组合物0.8g溶解于水999.2g中，得到溶液。向该溶液中投入5片湿式人工污染布(4cm×4cm)，使用Tergot-O-Meter(大荣化学社制造)在以下条件下清洗和漂洗后，取出布，使用齿轮烘箱(TABAI社制造、GPS-222)在70℃干燥60分钟，得到试验布。接着，使用多光源分光测色计(Suga Test Instruments社制造)，对于每一片试验布在表里各两处共四处(5片试验布共20处)测定该试验布的540nm的反射率，求出其平均值，利用下式计算出清洗去除率(%)。将结果记载于表3～表5中。

(清洗条件)

时间：10分钟、温度：25℃、转速：120rpm

(漂洗条件)

时间：1分钟、温度：25℃、转速：120rpm

(清洗去除率)

清洗去除率(%)={(R_W-R_S)/(R_I-R_S)}×100

需要说明的是，R_I表示洁净布的反射率，R_W表示清洗布的反射率，R_S表示污染布的反射率。

另外，所使用的湿式人工污染布是具有表6的污垢组成的财团法人洗涤科学协会制造的湿式人工污染布(540nm的反射率为40±5%)。

[表6]

<在25℃保存3个月后的清洗去除率>

对于实施例69～102和比较例9～12中得到的洗涤剂组合物，在上述<刚混配后的清洗去除率>中，代替刚制作后的洗涤剂组合物而使用在洗涤剂组合物的制作后在25℃保存3个月后的洗涤剂组合物，除此以外同样地进行清洗性试验，计算出清洗去除率。将结果记载于表3～表5中。

<清洗性的持续性>

将刚混配后的清洗去除率与在25℃保存3个月后的清洗去除率之比作为清洗性的持续性，通过下式算出。

清洗性的持续性(%)=(在25℃保存3个月后的清洗去除率)/(刚混配后的清洗去除率)×100

由表3～表5的评价结果可知，本发明的洗涤剂组合物的清洗性的持续性高，能够长期保持清洗性。

工业实用性

本发明的蛋白质性蛋白酶抑制剂能够高效、长期地抑制蛋白酶的活性，因此在药品、食品、洗涤剂和生物化学的领域中能够有效地使用。另外，本发明的蛋白质溶液由于充分地抑制了蛋白酶活性，因此能够长时间使蛋白酶活性持续，在药品、食品、洗涤剂和生物化学的领域中能够有效地使用。例如，能够用于蛋白质药品液体制剂、酶液体制剂、工业用酶水溶液、液体洗涤剂、饮料、诊断药用的测定试剂、蛋白质的标准溶液等。本发明的洗涤剂组合物由于充分抑制了蛋白酶活性，因此能够长时间使清洗性持续，能够作为衣物用清洗剂、自动餐具清洗机用清洗剂和隐形眼镜用清洗剂使用，特别是能够用于衣物用液体洗涤剂。

Claims

1.一种蛋白质性蛋白酶抑制剂，其仅由序列号2的氨基酸序列、序列号3的氨基酸序列、在序列号2的氨基酸序列的末端带有His-tag的氨基酸序列或者在序列号3的氨基酸序列的末端带有His-tag的氨基酸序列构成。

2.一种蛋白质溶液，其包含权利要求1所述的蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶和溶剂。

3.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1所述的蛋白质性蛋白酶抑制剂、蛋白酶、溶剂和表面活性剂。