CN103834053A - 一种可注射的交联透明质酸凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可注射的交联透明质酸凝胶及其制备方法,由透明质酸凝胶颗粒与磷酸氯化钠生理缓冲溶液配制而成;透明质酸凝胶颗粒系以透明质酸干粉为原料，通过交联处理、乳化交联制粒、纯化干燥溶胀，灌装灭菌之工艺制备而成。本发明提供的交联透明质酸凝胶粒,粒径均一，交联剂残留小于0.2ppm，注射推挤力适中，体内降解时间达8～12个月以上。该植入剂具有极好的美容修复效果，适用于注射至皮下真皮层深层至皮下浅层，修复中度至重度皱纹或褶皱，可满足皮肤衰老造成的皱纹或褶皱的修复需求。
Description
技术领域
本发明属于医学美容整形技术，具体涉及一种可注射交联透明质酸凝胶及其制备方法。
背景技术
软组织充填剂已被广泛应用于美容外科手术以改善面部轮廓、修正皱纹、填平凹陷瘢痕和填充体积（如唇部）等。目前国内外常用的可注射软组织充填材料主要为透明质酸类产品，该类产品作为美容注射植入剂，具有明显的优点，如注射后皱纹修复效果稳定持久，无需过量注射，若不慎注射过量也可立即采用透明质酸酶处理；透明质酸生物相容性好，术后不良反应发生率很低，交联工艺得当的透明质酸可在体内维持较长时间作用效果，一般均能达到6～12个月左右。
随着技术的发展以及越来越多的求美者认可并使用注射用交联透明质酸凝胶，国家对该类产品的要求也越来越严格，对注射用交联透明质酸凝胶产品品质的评价指标为降解时间、粒径分布范围、溶胀率、注射推挤力和交联剂的残留量等。例如，降解时间是由产品交联度直接决定的产品有效性持续时间；粒径分布范围决定了透明质酸凝胶有效性及推挤力的稳定性；溶胀率影响产品的亲水性能，决定产品注射至体内的溶胀体积大小，从而影响医师对于注射量大小的判断；而推挤力可表征产品分散的均匀程度及临床使用的适手性；交联剂的残留量则直接影响了产品最终的安全性。
目前透明质酸凝胶的生产技术难点是：如何保证合适的交联度，使产品具有长期的抗降解能力及合适的溶胀率；如何控制粒径分布范围；如何彻底去除交联剂残留。这三个方面是直接影响注射用交联透明质酸凝胶产品有效性、安全性的最主要的控制指标。因此，目前的交联透明质酸制备技术尚有改进空间。
国内外已上市并具有超过千万例求美者使用历史的瑞蓝2（Restylane）产品，其产品说明书中指出该产品仅有80%的粒径分布在80～1000μm的范围内，平均粒径为400μm，可见粒径分布范围仍较为宽泛，可能造成不同产品的降解速率有一定差异，从而造成产品使用效果的差异，所以在控制粒径均一方面仍有优化空间；另外瑞蓝2（Restylane）产品的透明质酸浓度为20mg/ml±3mg/ml，即产品浓度误差范围在15%，这也会在一定程度上对产品使用效果的稳定性造成影响。下面简略介绍目前制备技术及其相应缺陷。
在透明质酸凝胶粒径控制技术上，如中国专利200810009194.6、201110004283.3、200610024700.X、200810097847.0、201010117490.5等，采用电动搅拌机、旋转搅拌或过筛粉碎透明质酸凝胶，从而制备得到凝胶颗粒，凝胶颗粒的粒径大小不够均匀，且平均粒径批次间差异较大，从而严重影响产品性能如注射时推挤力、注射后的安全性和有效性等的稳定。另外中国专利200880005058.8及200880127125.3采用透明质酸及交联剂的水相与有机相进行混合得到油包水型乳化液，使透明质酸与交联剂形成纳米级颗粒并同时完成交联反应。这些专利制备得到的交联透明质酸凝胶颗粒粒径均未超过1微米，在体内降解速率过快（1～3个月），应用于注射美容无法达到长期修复效果。
制备交联透明质酸凝胶最常使用的交联剂有二乙烯基砜、碳二亚胺、缩水甘油醚、醛类、聚乙二醇等，其中采用二乙烯基砜的如中国专利201110154939.X、200580047101.3等。201110154939.X将交联剂二乙烯基砜和聚乙二醇混合反应得到聚醚乙烯基砜及部分未反应的二乙烯基砜，再将透明质酸原料加入其中进行反应，制备得到聚乙二醇与透明质酸通过二乙烯基砜交联的聚合物。该方法制备得到的聚醚乙烯基砜分子链较长，分子空间位阻较大，将其作为交联剂再与透明质酸分子反应效果不佳，产品有效性无法满足要求；专利200580047101.3通过缓冲液冲洗凝胶以去除交联剂残留，再添加防腐剂，该方法无法有效清除凝胶内部的交联剂，且添加了防腐剂，不利于产品的生物相容性。中国专利200610152600.5，200810009194.6，200810097847.0等采用缩水甘油醚作为透明质酸的交联剂，其中200610152600.5将透明质酸溶于氢氧化钠溶液，加入缩水甘油醚交联剂交联，采用NaCl溶液浸泡去除交联剂，但经本发明人验证，用这种方法去除缩水甘油醚残留的效果不佳，无法保证良好的产品生物相容性；采用醛类交联透明质酸的,如中国专利200610078103.5，该专利使用的醛类化合物如戊二醛等毒性较大，制备得到的透明质酸的生物相容性不高，容易出现植入物钙化等不良反应。另外也有专利采用多次交联技术制备交联透明质酸凝胶，如中国专利200610152600.5、00804642.5等，其中200610152600.5公开了一种二次交联制备透明质酸的方法：先采用缩水甘油醚类交联剂处理透明质酸，再将其用碱溶液溶解后再次采用缩水甘油醚类交联剂交联，该方法第二次交联时由于多加了一倍的溶剂，导致空间结构拉大，所以第二次交联剂的用量提高至第一次交联的2.5～6倍，交联剂消耗及残留较多，不利于产品成本及生物相容性。
中国专利200380111009.X采用碳二亚胺作为透明质酸的交联剂，碳二亚胺类交联剂在水溶液中不稳定，且经本发明人验证，该方法在透明质酸原料加入碳二亚胺交联剂后，短时间内即形成固态凝胶，交联剂难以有效混合均匀，交联效果不均一，会对产品降解时间的稳定性产生影响。200810097847.0采用透明质酸与缩水甘油醚在15～35℃下反应24小时得到交联透明质酸凝胶，其交联温度较低，交联效果不佳，无法保证产品长期有效性。
CN00804642.5采用多种交联剂对透明质酸进行同时或顺序交联，使透明质酸分子中的多种基团发生交联反应。该方法的缺点是，绝大部分交联剂的最佳反应所需化学环境不同，很难采用同一种缓冲液环境进行多种交联剂的同时交联反应；其次，多种交联剂顺序交联，可能由于某种交联反应发生后，透明质酸构象及空间分布即发生变化，因此对其他交联反应产生阻碍或干扰；另外，采用多种交联剂，可能导致去除多种交联剂的残留的成本增高，产品安全性风险增高。
由上可见，目前公开的各种交联透明质酸专利技术及制备方法均存在一定缺点，在明确控制交联程度、粒径分布范围、降解周期、交联剂残留的方面，尚有优化空间。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种可注射的交联透明质酸凝胶及其制备方法，该凝胶粒径均一，交联剂残留小于0.2ppm，生物相容性良好；该制备方法能够有效控制透明质酸凝胶颗粒的均一性，注射推挤力适中，体内降解时间达8～12个月以上，可满足临床用于修复皮肤衰老造成的皱纹或褶皱修复的需求。
本发明制备的可注射交联透明质酸凝胶，由透明质酸凝胶颗粒与磷酸氯化钠生理缓冲溶液配制而成。透明质酸凝胶颗粒系以透明质酸干粉为原料，通过交联处理、乳化交联制粒、纯化之工艺制成。
所述透明质酸凝胶颗粒(由透明质酸溶胀后形成的凝胶再粉碎制成)，其粒径平均大小及粒径分布范围为250μm±150μm、500μm±150μm、700μm±150μm或850μm±150μm，透明质酸浓度(即透明质酸含量)为15～25mg/mL，推挤力<15N（30G针头），储存模量为100～600Pa，交联剂残留小于0.2ppm。
所述磷酸氯化钠生理缓冲液是下述三种盐的混合溶液，即，以注射用水为溶剂，含有终浓度为6～12g/L的氯化钠溶液，0.01～0.1g/L磷酸二氢钾溶液和0.1～0.3g/L的磷酸氢二钠溶液；也可以是以注射用水为溶剂，含有终浓度为6～12g/L的氯化钠溶液，0.01～0.1g/L磷酸氢二钠溶液和0.1～0.3g/L的磷酸二氢钾溶液。
本发明制备的可注射交联透明质酸凝胶，还可以含有单种或多种药物或生物活性成分，如0.1%～0.3%的利多卡因，1%～10%的胶原蛋白，0.1%～0.5%的Vc或Ve。
本发明之可注射交联透明质酸凝胶的制备方法，是以医用级透明质酸为原料，经过交联处理，乳化交联制粒，纯化，干燥溶胀，灌装灭菌制备而成，具体步骤如下：
步骤一、交联处理：将透明质酸干粉（分子量30万～300万Da）溶解于碱性溶液A，形成浓度为20～200g/L的透明质酸溶液，pH为9～13，再添加1～10%的透明质酸质量的缩水甘油醚类交联剂，在40～60℃进行交联处理2～10小时，制备得到透明质酸凝胶。
所述的碱性溶液A为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水之其中一种。
所述的缩水甘油醚类交联剂，为1,4-丁二醇二缩水甘油醚，甘油三环氧丙醚，间苯二酚二缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚，乙二醇二缩水甘油醚，1,6-己二醇二缩水甘油醚或新戊二醇二缩水甘油醚的任意一种。
此步骤对透明质酸凝胶进行初步交联处理，可提高透明质酸凝胶的抗降解能力，使交联后的透明质酸体内降解周期相比天然透明质酸大大延长，从而具有应用于注射美容领域的潜质。
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶进行真空加热干燥，再加入碱性溶液A重新溶解，然后加入与步骤一中相同的缩水甘油醚类交联剂，搅拌均匀形成混合溶液，再将混合溶液与有机相按照1:5～1:10的体积比混匀，在40℃～60℃下持续搅拌反应2～4小时，搅拌速率为10～100rpm，使透明质酸凝胶在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒，并均匀分布于有机相中。
所述透明质酸凝胶颗粒(由透明质酸溶胀后形成的凝胶再粉碎制成)，其粒径平均大小及粒径分布范围为250μm±150μm、500μm±150μm、700μm±150μm或850μm±150μm，透明质酸浓度(即透明质酸含量)为15～25mg/mL，推挤力<15N（30G针头），储存模量为100～600Pa，交联剂残留小于0.2ppm。
所述的真空加热干燥，其真空度为-0.08～0.1MPa，温度为40～60℃。
所述的有机相，为常温下稳定、液态的医用白油、硅油或食用植物油的任意一种；在有机相中，可以添加0.1～0.5g/L十六烷基三甲基铵硝酸盐、0.2～2g/L聚乙二醇的一种或两种组合，或者是添加0.1～0.5g/L的烷基硫酸盐、0.2～2g/L的聚甘油酯的一种或两种组合，进一步加强乳化作用。
本步骤通过控制水相有机相比例，表面活性剂种类、浓度以及搅拌速率，可有效控制乳化液的乳化程度，即可有效控制形成的油包水乳状液中水相液滴大小及均匀程度，从而有效控制透明质酸凝胶的平均粒径及粒径分布范围。相比物理粉碎及乳化制备纳米颗粒的技术，本发明制备的透明质酸凝胶能有效控制粒径在微米级别，并且粒径分布范围较窄，保证产品有效性的稳定及注射时推挤力的稳定，使医师更容易判断注射用量及方便注射操作。
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的溶液B混合，剧烈震荡5～10分钟，再加入与混合液体积比例1～4倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析12～48小时，得到透明质酸颗粒。
所述溶液B是指异丙醇溶液、氯仿之任一种或两者1:1的混合液。
此步骤通过有机试剂及纯化水相分离处理，可将乳化液中透明质酸颗粒与有机相分离，得到粒径均匀的透明质酸颗粒，也可同时将部分交联剂有效去除，大大降低产品中的交联剂残留，保证产品具有良好的安全性。
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理缓冲溶液进行溶胀处理，重复2～5次；在最后一次真空加热干燥后，透明质酸颗粒需采用加压方法进行充分溶胀。
所用的磷酸氯化钠生理溶液中可添加单种药物或生物活性成分或多种药物或生物活性成分，如0.1%～0.3%的利多卡因，1%～10%的胶原蛋白，0.1%～0.5%的Vc或Ve等，这些成分直接溶于磷酸氯化钠生理缓冲溶液,在透明质酸吸水溶胀时即完成添加。
溶胀处理的加压方式，可采用活塞式容器压缩气体从而使透明质酸颗粒与溶液处于2～5个大气压下进行溶胀，温度保持在常温条件，溶胀时间为2～24小时，最终之透明质酸颗粒凝胶，其浓度为15～25mg/mL。
此步骤通过加压溶胀，使透明质酸颗粒吸收水分的同时能够互相掺入，从而达到颗粒均匀分布，溶胀后凝胶均匀的目的，最终保证交联透明质酸凝胶在注射时保持稳定的推挤力及合适的弹性模量，避免注射体内后发生扩散、移位现象，能够起到良好的塑形修复作用。另外通过多次干燥溶胀处理，可进一步去除透明质酸凝胶中的交联剂残留，使本发明制备得到的透明质酸凝胶中的交联剂残留达到低于0.2ppm的水平。
步骤五、灌装：
将步骤四制备得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在95～110kPa及115～125℃条件下，高压蒸汽灭菌10～30分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
此步骤通过终端灭菌，可确保制备得到的可注射交联透明质酸凝胶达到无菌水平，有效保证终产品使用的安全性。
本发明制备的可注射交联透明质酸凝胶，具有凝胶形貌均一，无大小不均颗粒形态的特点，粒径平均大小及粒径分布范围为250μm±150μm、500μm±150μm、700μm±150μm或850μm±150μm，透明质酸浓度为15～25mg/mL，推挤力<15N（30G针头），储存模量为100～600Pa，交联剂残留小于0.2ppm。该植入剂适用于注射至皮下真皮层深层至皮下浅层，以修复中度至重度皱纹或褶皱，具有极好的美容修复效果。本发明通过大鼠皮下植入实验，证实可在大鼠皮下至少维持52周的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）采用本发明之制备技术，可通过乳化交联制粒步骤中各工艺参数的选择,有效控制乳化程度，从而有效控制透明质酸凝胶中透明质酸颗粒的粒径大小及分布范围（图1），并通过干燥溶胀步骤中的加压溶胀可进一步使透明质酸凝胶颗粒均匀分布，凝胶形态完整均一，维持稳定的注射推挤力及修复塑形效果。
（2）采用本发明制备技术，可通过纯化步骤中的离心分离及干燥溶胀步骤中的真空干燥溶胀处理，去除绝大部分有机试剂残留及缩水甘油醚类交联剂残留，保证产品具有良好的生物安全性（图2）及组织相容性（图3）。大鼠皮内植入实验结果表明，植入部位未出现任何红肿，溃烂，血肿，组织学染色切片结果表明：4、12、24、36周的组织炎症反应均较轻，植入材料周围及内部浸润的炎症细胞数量均较少，未出现任何因交联剂残留引起的致癌反应，证实了本发明制备的透明质酸凝胶颗粒具有良好的体内生物相容性。
（3）本发明制备的透明质酸凝胶，通过乳化交联制粒步骤可有效控制粒径分布于微米级别，不同于纳米级凝胶颗粒植入体内后会被巨噬细胞等迅速吞噬代谢，本发明制备的微米级别透明质酸凝胶颗粒，可在体内有效保持并能够促进成纤维细胞合成胶原，从而达到更好的皮肤皱纹及褶皱的修复效果。通过在体外模拟体内环境进行与人成纤维细胞共培养，对成纤维细胞合成胶原的能力进行验证，结果表明可有效刺激人成纤维细胞提高胶原合成的能力。（图4）
（4）本发明制备方法具有较高的质量可控性，整体工艺稳定可靠，透明质酸凝胶各项理化参数稳定，可通过控制产品制备过程中产品交联程度、平均粒径及粒径分布范围等参数从而控制产品的降解速率、动力粘度等参数，实现产品质量的稳定。另外，按照本发明制备得到的多批透明质酸凝胶浓度也较为稳定，并可将90%以上透明质酸凝胶粒径控制在平均粒径±150μm之间，避免出现批次内或批次间质量不稳定的问题，保证了本发明技术制备得到透明质酸凝胶使用效果的稳定。（图1、图5）
（5）采用本发明交联处理及乳化交联制粒等透明质酸制备关键技术，可有效提高透明质酸凝胶的抗降解能力，具有长期良好的填充效果，试验证明：其持久性至少在12个月以上，效果优于同类产品的6～12个月作用时间，未出现移位、扩散等并发症，从而在需要重复注射的时间间隔方面，也明显长于同类产品，可以降低求美者的消费支出，满足广泛的社会需求。（图6）
下面结合实施例和试验的图片对本发明做进一步说明。
附图说明
图1，是实施例制备的透明质酸凝胶粒径分布的检测曲线。
图2，是实施例制备的透明质酸凝胶体外细胞毒性检测结果之图片。
图3，是实施例制备的透明质酸凝胶进行大鼠皮内植入后组织学检测的结果之图片。
图4，是实施例制备的透明质酸凝胶采用RT-PCR方法检测I型胶原mRNA表达量的检测对比图。
图5，是实施例制备的连续三批透明质酸凝胶的透明质酸浓度、平均粒径、粒径分布范围、动力粘度以及体外降解时间的检测结果。
图6，是实施例制备的透明质酸凝胶进行大鼠皮内植入后外观观察结果之图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明
以下各实施例之可注射的交联透明质酸凝胶,均由透明质酸凝胶颗粒与磷酸氯化钠生理缓冲溶液组成;透明质酸凝胶颗粒以透明质酸干粉为原料,通过交联处理、乳化交联制粒、纯化之工艺制成。
实施例1
步骤一、交联处理：将透明质酸干粉（分子量30万Da）溶解于氢氧化钠水溶液，形成浓度为20g/L的透明质酸溶液，pH为9，再添加1%的透明质酸质量的1,6-己二醇二缩水甘油醚，在40℃进行交联处理2小时，制备得到透明质酸凝胶。
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶在-0.08MPa，40℃条件下进行真空加热干燥，再加入氢氧化钠水溶液重新溶解，然后加入与步骤一中相同的1,6-己二醇二缩水甘油醚拌均匀形成混合溶液，再将混合溶液与医用级白油按1：5配比，医用级白油中添加了0.1g/L十六烷基三甲基铵硝酸盐和0.2g/L聚乙二醇，在40℃下持续搅拌反应2小时，搅拌速率为10rpm，使透明质酸溶液在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒并均匀分布于有机相中。
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的异丙醇溶液混合，剧烈震荡5分钟，再加入与混合液体积比例1倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析12小时，得到透明质酸颗粒。
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理盐水溶胀处理，重复2次；在最后一次真空加热干燥后，采用加压方法，在常温5个大气压下对透明质酸颗粒进行充分溶胀，所用的磷酸氯化钠生理溶液中添加0.1%的利多卡因及0.1%的Vc，溶胀时间为2小时，最终透明质酸颗粒浓度为15mg/mL。
步骤五、灌装：将步骤四制备得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在95kPa及115℃条件下，高压蒸汽灭菌10分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
本实施例制备得到的透明质酸凝胶，具有良好的细胞相容性，体外细胞毒性检测结果如图2所示，结果显示本实施例制备的透明质酸凝胶中完全不含有机试剂残留，细胞毒性极小，可安全应用于面部皱纹填充、鼻梁增高、下巴轮廓修饰等医疗美容领域。
实施例2
步骤一、交联处理：将透明质酸干粉（分子量300万Da）溶解于氢氧化钾水溶液，形成浓度为200g/L的透明质酸溶液，pH为13，再添加10%的透明质酸质量的间苯二酚二缩水甘油醚，在60℃进行交联处理10小时，制备得到透明质酸凝胶。
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶在0.1MPa，60℃条件下进行真空加热干燥，再加入氢氧化钾水溶液重新溶解，然后加入与步骤一中相同的间苯二酚二缩水甘油醚搅拌均匀形成混合溶液;再将混合溶液与医用级二甲基硅油按1：10配比,医用级二甲基硅油中添加了0.5g/L烷基硫酸盐及2g/L聚甘油酯，在60℃下持续搅拌反应4小时，搅拌速率为100rpm，使透明质酸溶液在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒并均匀分布于有机相中。
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的氯仿混合，剧烈震荡10分钟，再加入与混合液体积比例4倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析48小时，得到透明质酸颗粒。
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理盐水溶胀处理，重复5次；在最后一次真空加热干燥后，采用加压方法，在常温5个大气压下对透明质酸颗粒进行充分溶胀，所用的磷酸氯化钠生理溶液中含有0.3%的利多卡因，1%的胶原蛋白，0.5%的Ve，溶胀时间为24小时，最终透明质酸颗粒浓度为25mg/mL。
步骤五、灌装：将步骤四制备得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在110kPa及125℃条件下，高压蒸汽灭菌30分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
本实施例制备得到的透明质酸凝胶，具有良好的组织相容性。经大鼠皮内植入检测，检测结果如图3所示，各时间点透明质酸植入部位炎症反应均较小，无急性及慢性不良反应出现，具有极高的体内安全性，可应用于面部皱纹填充、鼻梁增高、下巴轮廓修饰等医疗美容领域。
实施例3
步骤一、交联处理：将透明质酸干粉（分子量100万Da）溶解于氨水溶液，形成浓度为100g/L的透明质酸溶液，pH为11，再添加5%的透明质酸质量的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在50℃进行交联处理6小时，制备得到透明质酸凝胶。
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶在0.01MPa，50℃条件下进行真空加热干燥，再加入氨水溶液重新溶解，然后加入与步骤一中相同的1,4-丁二醇二缩水甘油醚搅拌均匀形成混合溶液，再将混合溶液与橄榄油按1：8配比混匀，橄榄油中添加了1g/L聚乙二醇，在50℃下持续搅拌反应3小时，搅拌速率为55rpm，使透明质酸溶液在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒并均匀分布于有机相中。
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的异丙醇/氯仿1:1的混合液混合，剧烈震荡7.5分钟，再加入与混合液体积比例2.5倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析30小时，得到透明质酸颗粒。
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理盐水溶胀处理，重复3次；在最后一次真空加热干燥后，采用加压方法，在常温3.5个大气压下进行充分溶胀，所用的磷酸氯化钠生理溶液中含有0.3%的利多卡因，0.2%的Vc，溶胀时间为12小时，最终透明质酸颗粒浓度为20mg/mL。
步骤五、灌装：将步骤四制备得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在101kPa及120℃条件下，高压蒸汽灭菌20分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
本实施例制备得到的透明质酸凝胶，粒径均一，凝胶形貌均匀，平均粒径及粒径分布检测结果如图1所示，平均粒径为250μm，可应用于面部眼角、嘴角、额头等部位的细纹填充修复，另外90%以上粒径分布于150～400μm范围内，避免出现粒径不均一而造成注射时推挤力不稳定的问题，并确保推挤力小于15N（30G针头），注射时操作方便，易于控制注射层次及透明质酸注射量。
实施例4
步骤一、交联处理：将透明质酸干粉（分子量150万Da）溶解于氢氧化钠水溶液，形成浓度为80g/L的透明质酸溶液，pH为12，再添加6%的透明质酸质量的甘油三环氧丙醚，在45℃进行交联处理8小时，制备得到透明质酸凝胶。
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶在-0.01MPa，45℃条件下进行真空加热干燥，再加入氢氧化钠水溶液重新溶解，然后加入与步骤一中相同的甘油三环氧丙醚搅拌均匀形成混合溶液，再将混合溶液与大豆油按1：5配比，大豆油中添加0.3g/L烷基硫酸盐，在45℃下持续搅拌反应2.5小时，搅拌速率为30rpm，使透明质酸溶液在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒并均匀分布于有机相中。
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的异丙醇混合，剧烈震荡6分钟，再加入与混合液体积比例2倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析24小时，得到透明质酸颗粒。
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理盐水溶胀处理，重复4次；在最后一次真空加热干燥后，采用加压方法，常温4个大气压下对透明质酸颗粒进行充分溶胀，溶胀时间为18小时，最终透明质酸颗粒浓度为22mg/mL。
得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在102.5kPa及121℃条件下，高压蒸汽灭菌18分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
本实施例制备的连续三批透明质酸凝胶，其透明质酸浓度、平均粒径、粒径分布范围、动力粘度以及体外降解时间的各项检测结果如图5所示，结果表明各批次间检测结果无明显差异，表明本发明方法可以有效保证及控制透明质酸凝胶质量的稳定性。采用本实施例制备的透明质酸凝胶，应用于大鼠皮内植入实验，可有效维持12个月以上的填充效果，如图6所示，4周、16周、32周及52周各时间点对注射部位或注射材料进行外观观察，结果显示透明质酸凝胶具有良好的填充塑形作用，注射后形成的皮肤***在12个月后仍能从外观明显看到。
实施例5
步骤一、交联处理：将透明质酸干粉（分子量50万Da）溶解于氢氧化钠水溶液，形成浓度为150g/L的透明质酸溶液，pH为10，再添加7%的透明质酸质量的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在55℃进行交联处理7小时，制备得到透明质酸凝胶。
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶在0.05MPa，55℃条件下进行真空加热干燥，再加入氢氧化钠水溶液重新溶解，然后加入与步骤一中相同的1,4-丁二醇二缩水甘油醚搅拌均匀形成混合溶液，再将混合溶液与葡萄籽油按照1:8的体积比混匀，在55℃下持续搅拌反应4小时，搅拌速率为50rpm，使透明质酸溶液在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒并均匀分布于有机相中。
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的氯仿混合，剧烈震荡8分钟，再加入与混合液体积比例3倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析36小时，得到透明质酸颗粒。
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理盐水溶胀处理，重复4次；在最后一次真空加热干燥后，采用加压方法，常温下2个大气压对透明质酸颗粒进行充分溶胀，溶胀时间为20小时，最终透明质酸颗粒浓度为18mg/mL。
步骤五、灌装：将步骤四制备得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在105kPa及121℃条件下，高压蒸汽灭菌12分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
本实施例制备得到的透明质酸凝胶，具有较好的促进成纤维细胞合成胶原的能力，将其与人成纤维细胞共培养后检测后者合成胶原水平变化，检测结果如图5所示，表明本实施例制备得到的透明质酸凝胶可有效促进成纤维细胞的增殖及胶原合成能力。将本实施例制备得到的透明质酸凝胶进行透明质酸酶体外降解，降解时间约120小时，注射至大鼠皮内可维持14个月从外观可观察到的填充效果。
实施例6
本实施例与实施例4基本相同，不同之处仅在于：步骤二所述的混合溶液与葡萄籽油按1：6配比，葡萄籽油中添加了1.5g/L的聚甘油酯，进一步加强乳化作用。
实施例7
本实施例与实施例4基本相同，不同之处仅在于：步骤二所述的混合溶液与大豆油按1：8配比，并在该大豆油中添加0.1g/L的烷基硫酸盐，进一步加强乳化作用.。
实施例8
本实施例与实施例7基本相同，不同之处仅在于：步骤二所述大豆油中添加0.4g/L的十六烷基三甲基铵硝酸盐，进一步加强乳化作用。
以下针对上述实施例，结合实验数据、图片资料等进行分析：
图1，是实施例制备的透明质酸凝胶粒径分布之检测曲线
说明：本发明制备的透明质酸凝胶可有效控制产品粒径分布范围（平均粒径为250μm，90%以上粒径分布于150～400μm范围内）
图2，是实施例制备的透明质酸凝胶体外细胞毒性检测结果之图片
该图包含的四个图分别是图2-A、图2-B、图2-C、图2-D，图2-A为平均粒径为250μm的透明质酸凝胶的体外细胞增殖结果图片，图2-B为平均粒径为800μm的透明质酸凝胶的体外细胞增殖结果图片，图2-C为阳性对照体外细胞增殖结果图片，图2-D为阴性对照体外细胞增殖结果图片。
结果显示：阳性对照组细胞出现凋亡形态，悬浮死细胞数量较多；阴性对照组细胞增殖良好，细胞形态正常；本发明制备的平均粒径为250μm及800μm的透明质酸凝胶组细胞增殖及细胞形态均与阴性对照组无显著性差异，且细胞形态较优于阴性对照组。说明本发明制备的透明质酸凝胶具有极好的细胞相容性，无任何可能导致细胞毒性的有机试剂或其他有害成分残留。
图3，是实施例制备的透明质酸凝胶进行大鼠皮内植入后组织学检测的结果之图片
该图包含的四个图分别是图3-A、图3-B、图3-C、图3-D，图3-A为植入后4周注射部位组织学切片结果，图3-B为植入后12周注射部位组织学切片结果，图3-C为植入后24周注射部位组织学切片结果，图3-D为植入后36周注射部位组织学切片结果，空心箭头所指示区域即为透明质酸材料。
结果显示：本发明制备的透明质酸凝胶在不同的植入期内，材料引起的组织炎症反应极轻，材料周围及内部浸润的炎症细胞数量很少，无异物排异反应，无肉芽肿等长期慢性不良反应，具有极高的组织相容性。
图4，是实施例制备的透明质酸凝胶在体外与人成纤维细胞共培养3、5、7天后，取共培养体系中的所有人成纤维细胞，提取其中的mRNA后采用RT-PCR方法检测I型胶原mRNA表达量的检测对比图
结果显示：7天后，共培养条件下的人成纤维细胞的I型胶原mRNA表达量比单独培养人成纤维细胞的表达量要多出30%左右，说明本发明制备的透明质酸凝胶，可起到促进成纤维细胞生长增殖的作用。
图表5是实施例制备的连续三批透明质酸凝胶的透明质酸浓度、平均粒径、粒径分布范围、动力粘度以及体外降解时间的检测结果
结果显示：本发明所述工艺参数及方法可有效控制产品之上述质量参数的稳定性。
图6，是实施例制备的透明质酸凝胶进行大鼠皮内植入后外观观察的结果之图片
该图包含的四个图分别是图6-A、图6-B、图6-C、图6-D，图6-A为植入后4周注射部位外观观察结果，图6-B为植入后16周注射部位材料形态观察结果图6-C为植入后32周注射部位外观观察结果，图6-D为植入后52周注射部位外观观察结果，空心箭头所指示区域即为透明质酸材料所在。
结果显示：本发明制备的透明质酸凝胶在不同的植入期内，能够保证制备的植入剂植入体内后可快速成型，具有长期良好的填充效果，其持久性至少在12个月以上，虽在逐步降解，但未发生移位、扩散等现象。另外在12个月观察期内，注射部位皮肤未出现红肿，溃烂，感染，皮肤坏死等并发症，透明质酸凝胶的生物相容性良好。
Claims (6)
1.一种可注射的交联透明质酸凝胶,其特征在于：由透明质酸凝胶颗粒与磷酸氯化钠生理缓冲溶液配制而成;透明质酸凝胶颗粒以透明质酸干粉为原料制成;
所述透明质酸凝胶颗粒，其粒径平均大小及粒径分布范围为250μm±150μm、500μm±150μm、700μm±150μm或850μm±150μm，透明质酸浓度为15～25mg/mL，推挤力<15N（30G针头），储存模量为100～600Pa，交联剂残留小于0.2ppm;
所述磷酸氯化钠生理缓冲液是下述三种盐的混合溶液：以注射用水为溶剂，含有终浓度为6～12g/L的氯化钠溶液，0.01g/L～0.1g/L磷酸二氢钾溶液和0.1～0.3g/L的磷酸氢二钠溶液,或是,以注射用水为溶剂，含有终浓度为6～12g/L的氯化钠溶液，0.01g/L～0.1g/L磷酸氢二钠溶液和0.1～0.3g/L的磷酸二钾氢溶液。
2.根据权利要求1所述交联透明质酸凝胶,其特征在于,含有下述单种或多种药物或生物活性成分：0.1%～0.3%的利多卡因，1%～10%的胶原蛋白，0.1%～0.5%的Vc或Ve。
3.根据权利要求1所述交联透明质酸凝胶,其特征在于,磷酸氯化钠生理溶液中,添加有单种药物或生物活性成分或多种药物或生物活性成分，如0.1%～0.3%的利多卡因，1%～10%的胶原蛋白，0.1%～0.5%的Vc或Ve。
4.一种可注射交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：以医用级透明质酸为原料，经过交联处理，乳化交联制粒，纯化，干燥溶胀，灌装灭菌制备而成，具体步骤如下：
步骤一、交联处理：将分子量为30万～300万Da的透明质酸干粉溶解于碱性溶液A，形成浓度为20～200g/L的透明质酸溶液，pH为9～13;再添加1～10%的透明质酸质量的缩水甘油醚类交联剂，在40℃－60℃进行交联处理2-10小时，制备得到透明质酸凝胶；
所述的碱性溶液A为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水之其中一种；
所述的缩水甘油醚类交联剂，为1,4-丁二醇二缩水甘油醚，甘油三环氧丙醚，间苯二酚二缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚，乙二醇二缩水甘油醚，1,6-己二醇二缩水甘油醚或新戊二醇二缩水甘油醚的任意一种;
步骤二、乳化交联制粒：将步骤一得到的透明质酸凝胶,进行真空加热干燥，再加入碱性溶液A重新溶解，然后加入与步骤一中相同的缩水甘油醚类交联剂,搅拌均匀形成混合溶液;再将混合溶液与有机相按照1:5～1:10的体积比混匀，在40℃～60℃下持续搅拌反应2～4小时，搅拌速率为10～100rpm，使透明质酸凝胶在有机相中形成乳化液，形成透明质酸颗粒，并均匀分布于有机相中;
所述真空加热干燥，其真空度为-0.08～0.1MPa，温度为40～60℃;
所述的有机相，为常温下稳定、液态的医用白油、硅油或食用植物油的任意一种；
步骤三、纯化：将步骤二得到的乳化液与等体积的溶液B混合，剧烈震荡5～10分钟，再加入与混合液体积比例1～4倍的纯化水，最后离心，取透明质酸相，再置于注射用水透析12～48小时，得到透明质酸颗粒;
所述溶液B是指异丙醇溶液、氯仿之任一种或两者1:1的混合液;
步骤四、干燥溶胀：将步骤三得到的透明质酸颗粒,调节pH至中性；通过步骤二中相同条件的真空加热干燥，再添加磷酸氯化钠生理缓冲溶液进行溶胀处理，重复2～5次；在最后一次真空加热干燥后，透明质酸颗粒需采用加压方法进行充分溶胀;
步骤五、灌装：
将步骤四制备得到的透明质酸颗粒凝胶进行预灌封注射器灌装，在95～110kPa及115～125℃条件下，高压蒸汽灭菌10～30分钟，制备得到可注射交联透明质酸凝胶。
5.根据权利要求4所述交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的有机相中,可以添加0.1～0.5g/L的十六烷基三甲基铵硝酸盐和0.2～2g/L的聚乙二醇的一种或两种组合；或者是添加0.1～0.5g/L的烷基硫酸盐和0.2～2g/L的聚甘油酯的一种或两种组合，进一步加强乳化作用。
6.根据权利要求4所述交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤四之溶胀处理的加压方式，系采用活塞式容器压缩气体，使透明质酸颗粒与溶液处于2～5个大气压下进行溶胀，温度保持在常温条件，溶胀时间为2～24小时。
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