CN109609557B - 一种基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆稳定、高效制气方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆稳定、高效制气方法，属于农业生产技术领域。解决了小麦秸秆发酵制气量随时间波动、总体发酵效率低的问题。从菌落平衡入手，通过人为干预产甲烷菌和不产甲烷菌的活性，将产甲烷菌控制并维持在产气效率较高但又不会影响菌种失衡的规模，从而将制气效率维持在波动较小区间，进而提高总体发酵制气效率。本发明的特点是产气稳定、发酵周期短、成本低。
Description
技术领域
本发明属于农业生产技术领域的方法，特别涉及一种小麦秸秆稳定、高效制气方法。
背景技术
化石能源(煤、石油等)的供需矛盾以及其非清洁燃用产生的环境污染是目前最为棘手的世界性问题，生产并利用可再生能源如生物质能是解决能源短缺及环境问题的极佳选择。利用生物原料如小麦秸秆制取沼气可以充分利用废弃的秸秆资源，同时可避免小麦秸秆直接燃烧引起的生态环境破坏及大量温室气体排放问题。小麦秸秆制取沼气方法关系秸秆原料利用率和制气效率，而目前的制气方法大多关注秸秆预处理及工艺控制，较少对制气过程进行干预和管理；小麦秸秆制气方法有待进一步精进。
小麦秸秆制气效率主要依赖于秸秆产甲烷菌厌氧发酵效率，其影响因素包括温度、pH值、预处理、接种量、进料浓度、微量元素等，单独或几个因素相互耦合一起影响发酵过程。其中，对小麦秸秆进行适当的预处理以提高制气效率是目前的主流研究内容。申请号为CN201610853878.9CN201210054373.8CN201610854245.X的中国专利公开了分别对秸秆进行酸预处理、氨预处理以及碱预处理，以提高制气效率的方法，行之有效。尽管秸秆预处理可通过改变秸秆结构、调整发酵池pH值、溶出还原糖含量等提升发酵效率；但整个发酵过程中微生物种群的动态变化仍不可控，产甲烷菌群落规模存随时间波动明显，导致制气效率随时间起伏，影响制气效率。
实际上，小麦秸秆发酵制气过程中，其发酵池内同时包含产甲烷菌群落和不产甲烷菌群落，两者之间是即竞争又依赖的关系：不产甲烷菌中能将复杂的有机物分解为有机酸或者醇类、酯、碳水化合物、氢气和二氧化碳，不仅满足自身的生长繁殖，还为产甲烷菌群提供大量的营养物质和能量；产甲烷菌利用不产甲烷菌群产生的代谢产物而生长繁殖，并生成CH4和CO2等。在不干预情况下，产甲烷菌落和不产甲烷菌落动态波动，小麦秸秆制气效率受产甲烷菌大幅波动特性影响而难以持续高效制气。
值得注意的是，产甲烷菌规模并非越大越好，其规模过大虽能室制气效率短时间内最高，但会导致不产甲烷菌代谢产物消耗过快，引起菌落失衡，不产甲烷菌规模的减少不利于复杂有机物的分解，从而减少产气。因此，存在较佳的产甲烷菌和不产甲烷菌的菌落平衡状态，此时产气效率较高且能持续。
综上，本发明提出了小麦秸秆高效制气方法的全新思路：人为干预发酵过程菌落状态，促使菌落平衡在产甲烷菌菌落规模较大状态，从而使产甲烷菌持续、高效产气。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：小麦秸秆制气过程中，产甲烷菌落和不产甲烷菌落规模动态波动，影响制气稳定性和高效性。
提出一种基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆稳定、高效制气方法：通过人为干预发酵(调节氯化铵浓度)过程菌落平衡状态，促使产甲烷菌菌落规模维持在较大状态，从而提高小麦秸秆制气的稳定性和高效性。
本发明的技术方案：
一种基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆稳定、高效制气方法，该方法包括如下步骤：(1)小麦秸秆预处理；(2)发酵试验及产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌识别；(3)氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响分析；(4)产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制。
所述的小麦秸秆是指：剪切成1-2cm小段并自然晾晒的小麦秸秆。
所述步骤(1)小麦秸秆预处理是指：物理处理，将所述的小麦秸秆用粉碎机粉碎成粉状；化学处理，小麦秸秆浸泡在有机溶剂正己烷(1：6)中，密封后在常温(30℃)下进行溶解反应3h，取出小麦秸秆粉放到通风橱内，等待有机溶剂完全挥发，烘干至恒重。
所述步骤(2)中发酵试验及产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌识别具体步骤为：(1)首先将预处理后的小麦秸秆置于发酵罐中，加入1/3-1/2小麦秸秆质量的活性污泥，加入适量体积(100g小麦秸秆/2.5L水)清水，调节初始pH值为6.9-7.2，置于恒温水浴锅(温度35℃)中，发酵20天；(2)每12小时测定一次产气量，每12小时采样发酵罐中污泥；(3)分析产气速率随时间变化曲线，记录最大产气速率对应时段T*；(4)采用聚合酶链式反应—变性梯度电泳PCR-DGGE基因指纹图谱技术分析T*时段污泥样本中的菌落类型进行识别，并将指纹图谱条带中亮度最大的产甲烷菌和不产甲烷菌作为产甲烷特征菌X和不产甲烷特征菌Y。
所述调节pH值为6.9～7.2是指：用2mol/L的HCL和2mol/L的NaOH调节pH值至6.9～7.2。
所述聚合酶链式反应—变性梯度电泳PCR-DGGE基因指纹图谱技术，其详细操作过程请参考文献：高平平，赵立平.可用于微生物群落分子生态学研究的活性污泥总DNA提取方法研究[J].生态学报.2002(11):2015-2019.
所述步骤(3)氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响分析，具体为：通过在厌氧条件下在培养皿中分别研究氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响，确定出可提升产甲烷特征菌活性的氯化铵浓度范围(m1～m2)以及可提升不产甲烷特征菌活性增强的氯化铵浓度范围(n1～n2)。
所述在厌氧条件下在培养皿中分别研究氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响，具体：取与步骤(2)所述相同的活性污泥，等质量分成若干份，并采用平板菌落计数法进行菌落CFU计数，分别获得产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌菌落数y1和y2。在不同氯化铵浓度下，在温度为35℃、pH值为6.9～7.2、湿度为45-60﹪、培养基为等质量分割的活性污泥的细菌孵育箱中，分别培养产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌24小时。取出，再次采用平板菌落计数法进行菌落CFU计数，分别获得产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌菌落数z1和z2，并与y1和y2作对比，若y1<z1，则认为该氯化铵浓度可提升产甲烷特征菌活性，反之为抑制；若y2<z2，则认为该氯化铵浓度可提升不产甲烷特征菌活性，反之为抑制。
所述产甲烷特征菌活性的氯化铵浓度范围(m1～m2)和不产甲烷特征菌活性增强的氯化铵浓度范围(n1～n2)：其两者之间必定存在范围(o1～o2)，该范围只增大产甲烷特征菌活性，抑制或不影响不产甲烷特征菌活性；以及范围(p1～p2)，该范围只增大不产甲烷特征菌活性，抑制或不影响产甲烷特征菌活性。
所述步骤(4)产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制是指：在小麦秸秆发酵制气开始时加入适量氯化铵(50g/L)进行发酵，并每隔6个小时监测产气量和发酵罐中氯化铵浓度。当产气速率达到高位后开始下降，并当其产气速率低于高位时产气速率的80％时，对比发酵罐中氯化铵浓度q与范围(m1～m2)和范围(n1～n2)，判断发酵罐内产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌中的弱势菌群，通过加入氯化铵固体或清水的方法，调节发酵罐内氯化铵浓度处于提高弱势菌群活性的浓度范围(o1～o2)或(p1～p2)。从而实现产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制。
本发明的有益效果：本发明的基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆制气方法，从菌落平衡入手，通过将产甲烷菌控制并维持在产气效率较高但又不会影响菌种失衡的规模，进而提高发酵制气效率。解决了小麦秸秆发酵制气量随时间波动、总体发酵效率低的问题；本发明对发酵过程菌落平衡干预所用到的原料(氯化铵)，成本低廉；具有产气稳定、发酵周期短、易实现的优点。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，以下的实施例便于更好理解本发明，但并不限定本发明。
一种基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆稳定、高效制气方法，该方法包括如下步骤：
(1)小麦秸秆预处理；
(2)发酵试验及产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌识别；
(3)氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响分析；
(4)产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制。
实施例具体操作步骤如下：
(1)取嘉兴地区小麦秸秆，并将其剪切成1.5cm左右小段并自然晾晒。、
(2)取步骤(1)中小麦秸秆40g，用粉碎机粉碎成粉状；然后将小麦秸秆粉浸泡在有机溶剂正己烷(1：6)中，密封后在常温(30℃)下进行溶解反应3h，取出小麦秸秆粉放到通风橱内，等待有机溶剂完全挥发，烘干至恒重。
(3)将步骤(2)中的小麦秸秆粉20g置于发酵罐中，加入8g小麦秸秆质量的活性污泥，加入0.5L清水，用2mol/L的HCL和2mol/L的NaOH调节初始pH值为7.0，置于发酵罐中发酵20天。
(4)在步骤(3)过程中，每12小时测定一次产气量，每12小时采样发酵罐中污泥；分析产气速率随时间变化曲线，记录最大产气速率对应时段36h～48h。
(5)采用聚合酶链式反应—变性梯度电泳PCR-DGGE基因指纹图谱技术分析36h～48h时段污泥样本中的菌落类型进行识别，并将指纹图谱条带中亮度最大的产甲烷菌-甲烷巴叠球菌和不产甲烷菌-Alistipes onderdonki菌作为产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌。
(6)通过在厌氧条件下在培养皿中分别研究氯化铵浓度对甲烷巴叠球菌和Alistipes onderdonki菌活性的影响：取与步骤(3)所述相同的活性污泥210g，等质量分成11份，并采用平板菌落计数法对其中1份活性污泥进行菌落CFU计数，分别获得甲烷巴叠球菌和Alistipes onderdonki菌菌落数550CFU/ml和370CFU/ml。在10种不同氯化铵浓度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75g/L)下，在温度为35℃、pH值为7.0、湿度为50﹪、培养基为等质量分割的活性污泥的细菌孵育箱中，分别培养产甲烷巴叠球菌和培养不产甲烷特征菌24小时。取出，再次采用平板菌落计数法进行菌落CFU计数，分别获得产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌菌落数z1和z2，并与550CFU/ml和370CFU/ml作对比，若z1>550CFU/ml，则认为该氯化铵浓度可提升产甲烷巴叠球菌活性，反之为抑制；若y2<z2，则认为该氯化铵浓度可提升Alistipes onderdonki菌活性，反之为抑制。
(7)根据步骤(6)确定出可提升甲烷巴叠球菌活性的氯化铵浓度范围(30～60g/L)以及可提升Alistipes onderdonki菌活性增强的氯化铵浓度范围(50～70g/)。
(8)根据步骤(7)进一步确定氯化铵浓度范围为(30～50g/L)时，只有甲烷巴叠球菌活性得到增强，Alistipes onderdonki菌活性则受到抑制或不受影响。氯化铵浓度范围为(60～70g/L)时，只有Alistipes onderdonki菌活性得到增强甲烷巴叠球菌活性则受到抑制或不受影响。
(9)再取步骤(2)中剩余的小麦秸秆粉20g，重复步骤(3)，并时加入适量氯化铵(50g/L)进行发酵，并每隔6个小时监测产气量和发酵罐中氯化铵浓度。在时段36h～42h产气速率达到高位(约30ml/h)后开始下降，并当其产气速率低于高位时产气速率的24ml/h时，对比发酵罐中氯化铵浓度为48g/L，判断Alistipes onderdonki菌为弱势菌群，通过加入氯化铵，调节发酵罐内氯化铵浓度至68g/L，提高弱势菌Alistipes onderdonki菌活性。上述实施例的效果为：在总产气20天内，采用本发明方法后的制气速率在发酵开始的3～8天内持续稳定在最高制气速率的75％以上；相比原来18天累积制气量达到总制气量的90％，采用本发明方法后9天累积制气量就已经达到总制气量的90％。具有制气效率高、制气稳定的效果。
Claims (1)
1.一种基于发酵过程菌落平衡的小麦秸秆稳定、高效制气方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)小麦秸秆预处理；(2)发酵试验及产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌识别；(3)氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响分析；(4)产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制；
所述步骤(1)小麦秸秆预处理是指：将所述的小麦秸秆用粉碎机粉碎成粉状；将小麦秸秆浸泡在有机溶剂正己烷中，其中小麦秸秆与有机溶剂正己烷的质量比为1：6，密封后在常温30℃下进行溶解反应3h，取出小麦秸秆粉放到通风橱内，等待有机溶剂完全挥发，烘干至恒重；
所述步骤(2)中发酵试验及产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌识别具体子步骤为：1)首先将预处理后的小麦秸秆置于发酵罐中，加入1/3-1/2小麦秸秆质量的活性污泥，每100g小麦秸秆加入2.5L清水，调节初始pH值为6.9-7.2，置于恒温水浴锅温度35℃中，发酵20天；2)每12小时测定一次产气量，每12小时采样发酵罐中污泥；3)分析产气速率随时间变化曲线，记录最大产气速率对应时段T*；4)采用聚合酶链式反应—变性梯度电泳PCR-DGGE基因指纹图谱技术分析T*时段污泥样本中的菌落类型进行识别，并将指纹图谱条带中亮度最大的产甲烷菌和不产甲烷菌作为产甲烷特征菌X和不产甲烷特征菌Y；
所述步骤(3)氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响分析，具体为：通过在厌氧条件下在培养皿中分别研究氯化铵浓度对产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌活性的影响，确定出可提升产甲烷特征菌活性的氯化铵浓度范围(m1～m2)以及可提升不产甲烷特征菌活性的氯化铵浓度范围(n1～n2)；
取步骤(2)中所述的活性污泥，等质量分成若干份，并采用平板菌落计数法进行菌落CFU计数，分别获得产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌菌落数y1和y2；在不同氯化铵浓度下，在温度为35℃、pH值为6.9～7.2、湿度为45-60﹪、培养基为等质量分割的活性污泥的细菌孵育箱中，分别培养产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌24小时，取出，再次采用平板菌落计数法进行菌落CFU计数，分别获得产甲烷特征菌和培养不产甲烷特征菌菌落数z1和z2，并与y1和y2作对比，若y1<z1，则认为该氯化铵浓度可提升产甲烷特征菌活性，反之为抑制；若y2<z2，则认为该氯化铵浓度可提升不产甲烷特征菌活性，反之为抑制；
所述可提升产甲烷特征菌活性的氯化铵浓度范围(m1～m2)和可提升不产甲烷特征菌活性的氯化铵浓度范围(n1～n2)，其两者之间必定存在范围(o1～o2)，该范围只增大产甲烷特征菌活性，抑制或不影响不产甲烷特征菌活性；以及范围(p1～p2)，该范围只增大不产甲烷特征菌活性，抑制或不影响产甲烷特征菌活性；
所述步骤(4)产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制是指：在小麦秸秆发酵制气开始时加入适量浓度为50g/L的氯化铵进行发酵，并每隔6个小时监测产气量和发酵罐中氯化铵浓度；当产气速率达到高位后开始下降，并当其产气速率低于高位时产气速率的80％时，对比发酵罐中氯化铵浓度q与范围(m1～m2)和范围(n1～n2)，判断发酵罐内产甲烷特征菌和不产甲烷特征菌中的弱势菌群，通过加入氯化铵固体或清水的方法，调节发酵罐内氯化铵浓度处于提高弱势菌群活性的浓度范围(o1～o2)或(p1～p2)；从而实现产甲烷特征菌-不产甲烷特征菌群落平衡控制。
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