CN103792358A - 黄曲霉毒素g1胶体金免疫层析检测板制备及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种可半定量测试饲料中黄曲霉毒素G1的胶体金免疫层析检测板，属于生物及食品安全领域。其特征在于：外壳内包括一条试纸条，试纸条的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测板以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线（C线）和检测线(T线)，所述检测线包被有黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白偶联物(AFG1-BSA)，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。检测板用于检测黄曲霉毒素G1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。

Description

黄曲霉毒素G1胶体金免疫层析检测板制备及检测方法

技术领域

本发明属生物及食品安全检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素G1 胶体金检测板的制备及其检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是生长在食物及饲料中的黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物。黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。其中黄曲霉毒素B1致癌性和毒性最强。黄曲霉毒素G1的毒性仅此于黄曲霉毒素B1。对人类和动物的健康有着非常严重的危害。

各国对黄曲霉毒素在食品中的残留限量均有规定。1995年，世界卫生组织制定的食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为15 μg/kg。 美国联邦政府相关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量不能超过15 μg/kg，其他动物饲料中的含量不能超过300 μg/kg。中国规定，玉米及花生仁制品（按原料折算）中黄曲霉毒含量不超过 20 μg/kg。大米、其他食用油中不得超过10 μg/kg，其他粮食、豆类、发酵食品中不得超过5 μg/kg，婴儿代乳食品中不得检出，其他食品可参照以上标准执行。

目前测定黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法。这些检测方法在不同时期发挥了很好的作用，但具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要专业人员操作等的缺点，而胶体金免疫层析法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、对实验人员和环境的污染危害小并且可同时对大量样本进行检测等优点。是一种可适用于大型养殖场、饲料厂等的快速检测产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄曲霉毒素G1半定量速测胶体金检测板的制备与使用方法，为实现饲料中黄曲霉毒素G1的快速检测开辟了广泛的应用前景。

本发明的技术方案：一种黄曲霉毒素G1半定量速测检测板的制备方法，检测板由外壳、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫四部分组成；金标垫为：用胶体金和黄曲霉毒素G1抗体结合制成金标抗体，结合过程为：将50 mL浓度为1 x 10^-4g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾，然后迅速加入l.5 mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15 min得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1：1体积比的比例逐滴加入到胶体金溶液中，边加边搅拌，反应5 min后，即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成A₅₄₀ =1.0的浓度，分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；所用检测板为：用自动划膜仪对硝酸纤维素膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被黄曲霉毒素G1抗原AFG1-B SA，浓度为0.5 mg/mL为检测线，上端横线包被羊抗鼠IgG，浓度为1 mg/mL为控制线，包被检测线和控制线后的硝酸纤维素膜自然干燥后用0.l mol/L的BSA的pH 7.4的PBS溶液浸泡30 min进行封闭处理，干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫四部分依次相互叠加粘贴于试剂板上，以一定宽度切条后即为黄曲霉毒素G1半定量速测检测板。

所制备的黄曲霉毒素G1半定量速测检测板的应用方法：

直接提取法：将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当。称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液（提取液配制：50 mL甲醇+50 mL水，加4 g氯化钠混匀即得样品提取液，可按需配置），充分搅拌混合（10 min），静置20 min后轻轻吸取上清液，按1：1比例与样本稀释液混合均匀后进行样品检测（此法可测30 μg/kg的饲料）；

烘干 / 吹干处理法：将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当。称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液（提取液配制：先用20 mL水将加4 g氯化钠溶解，再加入80 mL甲醇，即得样品提取液，可按需配置），充分搅拌混合（3 min），静置20 min，轻轻吸取上清液1 mL，放于110℃烘箱中烘干（约1 h）或50～60℃水浴氮气吹干，用0.5 mL 10% 甲醇充分溶解后即可进行样品检测（此法可测20 μg/kg的饲料）。

本发明的有益效果在于： 

（1）检测饲料中黄曲霉毒素G1。本发明提供的黄曲霉毒素G1 胶体金免疫层析检测板使用的抗体为抗黄曲霉毒素G1特异性单克隆抗体，用于特异性快速检测黄曲霉毒素G1 ； 

（2）操作简单。用该黄曲霉毒素G1胶体金免疫层析检测板进行检测时只需将样品溶液逐滴加到试纸条的样品垫上即可，为一步式操作，操作简单、方便； 

（3）检测过程不需要黄曲霉毒素G1 标准溶液作为阳性对照。本发明提供的黄曲霉毒素G1 胶体金免疫层析检测板检测样品时不需要使用黄曲霉毒素G1标准溶液作为阳性对照，而只需用空白样品作为阴性对照即可； 

（4）检测灵敏度高。本发明提供的黄曲霉毒素G1胶体金免疫层析检测板对样品中黄曲霉毒素G1的最低检测限为20 ng/mL。

附图说明

图1：黄曲霉毒素G1胶体金免疫层析检测板外观图（其中1、卡壳，2、硝酸纤维素膜，3、加样孔，4、质控线，5、检测线）。

图2：黄曲霉毒素G1检测板内试纸条，图2a为正面，2b为侧面（其中1、吸水垫，2、质控线，3、检测线，4、金标垫，5、样品垫）。

图3：黄曲霉毒素G1半定量胶体金免疫层析检测结果（其中图3a为阳性结果，图3b为阴性，图3c为无效结果）。

具体实施方式

黄曲霉毒素G1半定量胶体金快速检测板的制备如上述技术方案所述。

实施例1  直接提取法测饲料中黄曲霉毒素G1

样品前处理：

（1）将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当；

（2）称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液（提取液配制：50 mL甲醇+50 mL水，加4 g氯化钠混匀即得样品提取液，可按需配置），充分搅拌混合（10 min）；

（3）静置20 min后轻轻吸取上清液，按1：1比例与样本稀释液混合均匀后进行样品检测。

黄曲霉毒素G1半定量胶体金快速检测板的使用方法：

用一次性吸管缓慢垂直滴加2滴样本（约50 μL) 于加样孔，加样后开始计时。加样后切勿移动检测板，8-10 min判读结果。

检测结果：

阴性（－）：T 线（检测线，靠近加样孔一端）显色，表明样品中黄曲霉毒素G1浓度低于30 μg/kg 或不含黄曲霉毒素G1；阳性（＋）：T 线无显色，则表明样品中黄曲霉毒素G1浓度高于30 μg/kg；无效结果：未出现 C 线（对照线），可能是操作不当应用新的检测板重新测试。

实施例2 烘干/吹干处理法测饲料中黄曲霉毒素G1

样品前处理：

(1) 将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当；

(2) 称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液（提取液配制：先用20 mL水将加4 g氯化钠溶解，再加入80 mL甲醇，即得样品提取液，可按需配置），充分搅拌混合（3 min），静置20 min；

（3）轻轻吸取上清液1 mL，放于110℃烘箱中烘干（约1 h）或50～60℃水浴氮气吹干，用0.5 mL 10% 甲醇充分溶解后即可进行样品检测。

黄曲霉毒素G1半定量胶体金快速检测板的使用方法： 

用一次性吸管缓慢垂直滴加2滴样本（约50 μL) 于加样孔，加样后开始计时。加样后切勿移动检测板，8-10 min判读结果。

检测结果：

阴性（－）：T 线（检测线，靠近加样孔一端）显色，表明样品中黄曲霉毒素G1浓度低于20 μg/kg 或不含黄曲霉毒素G1；阳性（＋）：T 线无显色，则表明样品中黄曲霉毒素G1浓度高于20 μg/kg；无效结果：未出现 C 线（对照线），可能是操作不当应用新的检测板重新测试。

Claims (3)

1.黄曲霉毒素G1 胶体金免疫层析检测板，其特征在于：外壳内包括一条试纸条，试纸条的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接；金标垫：用胶体金和黄曲霉毒素G1抗体结合制成金标抗体；结合过程：将50 mL浓度为1 x 10^-4 g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾，然后迅速加入1.5 mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15 min得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1：1体积比的比例逐滴加入到胶体金溶液中，边加边搅拌，反应5 min后，即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成 A₅₄₀=1.0 的浓度，均匀分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；所用检测板为：用划膜仪对硝酸纤维素膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被黄曲霉毒素G1抗原AFG1-BSA，浓度为0.5 mg/mL为检测线，上端横线包被羊抗鼠IgG，浓度为1 mg/mL为控制线，包被检测线和质控线后的硝酸纤维素膜自然干燥后用 0.1 mol/L的BSA的pH 7.4的PBS溶液浸泡30 min进行封闭处理，干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫四部分依次相互叠加粘贴于试剂板上，以一定宽度切条后即为黄曲霉毒素G1半定量速测检测板。

2.根据权利要求1 所述的黄曲霉毒素G1免疫层析检测板的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 

(1) 吸水垫的制备

将吸水纸剪裁即得吸水垫；

(2) 检测垫的制备

检测线（T线）的包被： 

将黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白的偶联物配制成0.5 mg/mL的溶液A；于距离硝酸纤维素膜上沿为 10-15 mm 的位置，用自动划膜仪将溶液A 横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，检测线上所需黄曲霉毒素G1- 牛血清白蛋白的偶联物(AFG1-BSA) 的包被量为215 ng/cm，然后于37～40℃条件下干燥5～20 min；

质控线（C线）的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体配制成1 mg/mL 的溶液B；于距检测线5～10 mm的位置，用自动划膜仪将溶液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线；质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300 ng/cm，然后于37～40℃条件下干燥5～20 min；

(3) 金标垫的制备

用胶体金和黄曲霉毒素G1抗体结合制成金标抗体，结合过程为：将50 mL浓度为1 x 10^-4 g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾，然后迅速加入l.5 mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15 min得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1：1体积比的比例逐滴加入到胶体金溶液中，边加边搅拌，反应5 min后，即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成A₅₄₀ =1.0的浓度，分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；

(4) 检测板的组装

选用与上述试纸条相匹配的检测卡外壳，将试纸条置入卡壳内，样品垫正对加样孔，硝酸纤维素膜正对检测窗口。

3.如权利要求1所述方法制备的黄曲霉毒素G1半定量速测检测板的应用方法，其特征是：

直接提取法（可测30 μg/kg的饲料）

(1)将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当；

(2)称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液（提取液配制：50 mL甲醇+50 mL水，加4 g氯化钠混匀即得样品提取液，可按需配置），充分搅拌混合（10 min）；

(3)静置20 min后轻轻吸取上清液，按1：1比例与样本稀释液混合均匀后进行样品检测；

烘干/吹干处理法（可测20 μg/kg的饲料）

(1) 将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当；

 (2) 称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液（提取液配制：先用20 mL水将加4 g氯化钠溶解，再加入80 mL甲醇，即得样品提取液，可按需配置），充分搅拌混合（3 min），静置20 min；

 (3) 轻轻吸取上清液1 mL，放于110℃烘箱中烘干（约1 h）或50～60℃水浴氮气吹干，用0.5 mL 10% 甲醇充分溶解后即可进行样品检测。

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