CN204044161U - 一种快速检测粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇胶体金试剂板 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种快速检测粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇的胶体金试剂板，可用于快速检测粮油中的脱氧雪腐镰刀烯醇。本实用新型试剂板由上下两块塑料卡壳和试纸条组成，试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。塑料卡壳可固定试纸条，试纸条上的反应膜上标记有检测区和质控区，可将反应结果以肉眼可见的颜色表现出来。该试剂板操作简单快速，整个操作过程仅需十几分钟，且不需要借助其它仪器设备，适用于野外现场检测。同时，该试剂板通过调整提取液及稀释液的用量，可调整试剂板的检测限，用于不同检测要求的样品检测。

Description

一种快速检测粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇胶体金试剂板

技术领域

本实用新型属于食品安全检测领域，涉及一种胶体金检测试纸板，具体涉及一种快速检测粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇的胶体金试纸板。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇是单端孢菌素烯烃中的一种，又称呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON），由禾谷镰刀菌产生，常出现在玉米（穗腐病）、小麦和大麦（赤霉病）上。它的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与其它的霉菌毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。近年来发现DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血***造成死亡，但不同的动物对DON的敏感程度不一，猪是最敏感的动物。研究表明，DON可能对免疫***有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国GB 2761-2011“食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量”中规定玉米、小麦等谷物及其制品中DON的限量标准为1000μg/kg。

    目前，脱氧雪腐镰刀烯醇的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法以及液质联用法等。薄层色谱法灵敏度较低，操作过程中需要接触有毒有害试剂；液相色谱和液质联用法虽然灵敏度高，准确性好，但操作复杂，需要专业的操作人员，仪器价格高，不适用于户外操作和大范围现场操作；酶联免疫吸附法作为快速方法，虽然具有快速、灵敏、操作简单等特点，但是仍然需要一定的操作要求和环境，不太适用于户外和现场操作。

胶体金免疫层析法是利用抗原抗体的特异反应，以胶体金为显色媒介，将反应所需的原料大部分整合到试剂板上，在层析过程中完成检测反应，克服了酶联免疫吸附法的一些不足，具有快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。目前被广泛应用于生物技术诸多领域。

发明内容

本实用新型针对粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇含量检测展开研究，提供一种具有快速、操作简单、特异性强、灵敏度高、不需要额外设备等特点，可用于现场快速检测粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇含量的免疫胶体金快速检测试剂板。

    本试剂板由上下两块塑料卡壳和试纸条组成，试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。其中样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫在相邻的地方有2mm的重叠，以保证层析作用从样品垫到吸水垫的顺利进行，使样品溶液中的有效成分、反应膜上的检测区及质控区与胶体金结合垫上的胶体金单抗偶联物顺利发生反应。

    所述胶体金结合垫上包被有抗DON鼠单抗与胶体金的偶联物；反应膜上从样品垫至吸水垫方向依次包被有DON-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测区和质控区。

本实用新型试剂板应用竞争抑制免疫层析原理，通过检测区的抗原和金标垫上的金标抗体反应，以检测区是否显色来反应粮油中的脱氧雪腐镰刀烯醇含量是否超标。加入样本提取液后，金标抗体会随样品提取液朝吸水垫方向涌动扩散，如果样品中含有脱氧雪腐镰刀烯醇则会先和金标抗体反应，当样品中的脱氧雪腐镰刀烯醇含量超过或达到试剂板检出限，金标抗体随样品液扩散至检测区时，由于有色的金标抗体与抗原的结合位点被样品溶液中的脱氧雪腐镰刀烯醇占据，而无法与检测区上的脱氧雪腐镰刀烯醇抗原结合，无法固定在检测区上，试剂板上的检测区不显色，则判定为阳性；如果样品中脱氧雪腐镰刀烯醇含量在检测限以下或不含有，金标抗体随样品液扩散至检测区时，会固定在检测区上，试剂板上的检测区会呈现和胶体金颗粒一样的颜色，则判定为阴性。

    本实用新型试剂板的各组成成分与功能如下：

塑料卡壳：固定试纸条并标示功能区，显示加样孔、检测区、质控区。

试纸条:背衬为一面涂有不干胶的不吸水材料，常用PVC板，用于固定试纸其他组分；样品垫起吸收样品溶液，缓冲样品溶液pH值的作用，优选玻璃纤维制成；胶体金结合垫上有抗脱氧雪腐镰刀烯醇单抗与胶体金的偶联物，作用为样品液中的抗原与金标抗体反应的场所，优选聚酯膜或玻璃纤维素膜制成；反应膜用于标记检测区和质控区，将反应结果以肉眼可见的颜色表现出来，优选硝酸纤维素膜；吸水垫由吸水纸制成，用于吸收多余的溶液使其不影响最终结果。

本实用新型试剂板具有如下有益效果：

（1）特异性好。本实用新型试剂板对DON交叉反应率为100%，与其它种类真菌毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等均没有交叉反应。

（2）灵敏度高，检测限可根据需要调节。本实用新型试剂板的最低检测限为500μg/kg，满足国家标准中对食品中脱氧雪腐镰刀烯醇的限量要求。同时可以根据实际需要，调节样品前处理方法，调整提取液及稀释液的用量，调整试剂板的检测限，适用于不同检测要求的样品检测。

（3）操作简单快速。本实用新型试剂板将实验所需的大部分原料都已整合到试纸条上，不存在试剂配制、洗涤分离等操作，滴加样品提取液后3-5分钟即可肉眼读取结果。

（4）不依赖实验设备。本实用新型试剂板除样品前处理过程简单，检测结果肉眼可直接判读，不需要借助其它仪器设备，适用于野外现场检测。

（5）成本低，效益好。本实用新型试剂板生产工艺简单，成本低，且检测时，不需要单独做质控，质控和检测同时进行，降低了检测费用。

附图说明

图1为脱氧雪腐镰刀烯醇胶体金快速检测试剂板结构示意图。其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为反应膜，4为检测区，5为质控区，6为背衬，7为吸水垫。

图2为脱氧雪腐镰刀烯醇胶体金快速检测试剂板结果判定示意图。

实施方式

    本实用新型试剂板的制备包括脱氧雪腐镰刀烯醇免疫原的制备、抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体制备、胶体金溶液制备、胶体金标记抗脱氧雪腐镰刀烯醇单抗的制备，脱氧雪腐镰刀烯醇胶体金快速检测试剂板的组装。

    1、脱氧雪腐镰刀烯醇免疫原(DON-BSA)制备

1．1称取1mg DON和10mg正丁基硼酸溶于200μl无水吡啶中，混匀溶解，室温下反应24小时。

1．2加入10mg丁二酸酐，沸水浴中反应3小时。用氮气吹干，加入300μl水，再加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，氮气吹干后，溶于200μl DMF中，加入10 mg DCC和6 mg NHS，4℃下反应过夜。

1．3将上述溶液滴加入BSA溶液中，室温反应10小时。

1．4将上述反应溶液装入透析袋中，用20mM pH7.4 PBS溶液透析，4℃透析三天，期间每8小时换一次透析液。

1．5取出透析后的溶液，离心，取上清，-20℃保存。

    2、抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体制备

    2.1 小鼠免疫

    将制备好的脱氧雪腐镰刀烯醇免疫原，按体积比1:1加入佐剂混匀乳化，按蛋白浓度100 μg/只腹部皮下多点免疫BALB/c小鼠，首免免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，二免及以后以免疫元和弗氏不完全佐剂等体积混匀，首免3周后，以同样方法进行二次免疫，二免后每两2周免疫一次，三免后检测小鼠血清效价，血清效价合格后进行融合，融合前3天再追加免疫一次。

    2.2 细胞融合

    按照常规方法，准备好处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和提取免疫小鼠的脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合，然后在1分钟左右时间内（最佳时间为45秒）缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养十96孔培养板，于37℃ 5% CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天的时候进行全换液。

    2.3杂交瘤细胞的筛选

    细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。采用间接非竞争ELISA方法初选，检测细胞培养上清液，检测为阳性的孔，立即用有限稀释法进行业克隆化。

    2.4杂交瘤细胞的冻存

    将进行了2-3次亚克隆后的杂交瘤细胞扩大培养后用含25%血清、10% DMSO的基础细胞培养液冻存，浓度为10⁶-10⁷左右/ml。

    2.5单克隆抗体腹水制备

    复苏冻存的杂交瘤细胞，扩大培养。取8-10周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7-10日后腹腔注射杂交瘤细胞1-2 ×10⁶ /只，7-10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，冻存备用。

    3、胶体金溶液制备

    取100ml去离子水加入2.5ml 1%氯金酸溶液，煮沸后，迅速加入1.5ml 2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，冷却后，4℃避光保存。经测定，该胶体金颗粒直径为35nm左右。

    4、胶体金标记DON单抗的制备

移取制备的胶体金溶液100ml，用0.1M碳酸氢钠溶液调整pH值到8.0，加入1ml抗DON单抗，搅拌15分钟，缓慢加入1ml 25M的聚乙二醇20000溶液，搅拌15分钟后，10000r/min离心15分钟。弃去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶后，4℃避光保存。

5、胶体金快速检测试剂板的组装

    用点膜机把适当浓度的DON-BSA偶联物以及羊抗鼠IgG分别喷涂在反应膜上，作为检测区和质控区，37℃干燥箱内干燥5小时。将适当浓度的金标抗体喷涂在经过处理的胶体金结合垫上，37℃干燥箱内干燥5小时。在PVC背衬板上依次粘贴样品垫，胶体金结合垫，反应膜和吸水垫。组装完毕后，用切割机切割为3.5mm宽的试纸条，装入塑料模板中，制成快速检测试剂板。成品同干燥剂一起密封入铝箔袋中保存。

    6、脱氧雪腐镰刀烯醇快速检测试剂板的检测操作办法

    6.1 样品前处理

    取1g粉碎的样品置于10ml离心管中，加入5ml样品提取液，剧烈震荡3分钟，静置2分钟后，根据下表中检测区取对应量的上清液，再吸取对应量的样品稀释液稀释，混合均匀后待用

检测限（μg/kg)	上清液(ml)	样品稀释液（ml)
			500	0.1	0.1
1000	0.1	0.3
			2000	0.1	0.7

    6.2 检测步骤

    水平放置检测板，吸取混合好的待测样品液100μl滴加到加样孔中，3-5分钟内读取实验结果。

    6.3 结果判断

    在光线充足处，水平放置检测板，读取结果。

    无效：C线未显色，表示操作不当或试剂板已失效，应更换试剂板重新检测。

阴性：C线、T线均显色，表示样品中所含脱氧雪腐镰刀烯醇的量低于检测限或者不含脱氧雪腐镰刀烯醇。

阳性：C线显色，T线不显色；表示样品中所含脱氧雪腐镰刀烯醇的量等于或高于检测限。

Claims (5)

1.一种快速检测粮油中脱氧雪腐镰刀烯醇的胶体金试剂板，本试剂板由上下两块塑料卡壳和试纸条组成，试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。

2.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于试纸条背衬上黏贴的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫在相邻的地方有2mm的重叠。

3.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于试纸条上的背衬为一面涂有不干胶的不吸水材料，常用PVC板；样品垫用玻璃纤维制成；胶体金结合垫用聚酯膜或玻璃纤维素膜制成；反应膜用硝酸纤维素膜；吸水垫用吸水纸制成。

4.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于胶体金结合垫上喷有脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体和胶体金的结合物，反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有DON-BSA偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测区和质控区。

5.根据权利要求4所述的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的粒径大小约为35nm。