CN101109735A - 稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱—荧光光度的测定方法 - Google Patents

Abstract

稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱—荧光光度的测定方法，它依次包括提取、净化、测定和计算步骤，其特征在于：提取步骤中取10.0g样品，加入2.0－2.5g氯化钠及60－80％甲醇－水溶液50.0mL，超声10－20min提取；净化步骤中清洗亲和柱时，先用吐温－20/PBS溶液淋洗亲和柱，后用甲醇∶水＝2∶8的溶液淋洗亲和柱，最后用水清洗亲和柱。它具有回收率更接近真实值，精密度更高，减少试剂的使用量，降低检测成本，减少对环境的污染，计算方便等优点。

Description

稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱-荧光光度的测定方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域。

背景技术

测定谷物中黄曲霉毒素的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法。这些方法或多或少都具有如下不足之处：

(1)在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物，对操作人员安全造成危害。

(2)操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。

(3)仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。

(4)灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。

目前，国内外普遍采用的“黄曲霉毒素免疫亲合柱——荧光光度计法”是以单克隆免疫亲合柱为分离手段，用荧光计作为检测工具的快速分析方法。它克服了TLC(薄层色谱法)和HPLC(高效液相色谱法)法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、异味的有机溶剂，危害操作人员人身安全和污染环境的缺点。黄曲霉毒素免疫亲合柱荧光光度计法比传统的HPLC法更加安全、可靠、灵敏度和准确度高。它采用单克隆抗体免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素或其它真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高。

国家标准GB/T 18979-2003(食品中的黄曲霉毒素的测定——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法)，此方法适用于玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米、大米、植物油脂、酱油、食醋等食品中的黄曲霉毒素的测定；GB/T 18980-2003(牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M₁的测定——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法)主要适用范围牛奶、奶粉中黄曲霉毒素M₁含量的测定。

免疫亲和柱-荧光光度法的检测黄曲霉毒素的原理

经过甲醇-水提取，提取液经过过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质的抗体上。用清水将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。甲醇洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素的总量。

国标GB/T18979-2003中黄曲霉毒素的检测方法中2.4.1中大米、玉米、小麦、花生的黄曲霉毒素检测方法如下：

1试剂和溶液

1.1水：本方法提到的水均指重蒸水

1.2甲醇：色谱纯

1.3甲醇-水(7+3)：取70mL甲醇加水30mL

1.4氯化钠(Nacl)：分析纯

1.5 PBS缓冲溶液：8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，

用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节PH值至7.0，最后用纯水稀释到1000mL。

1.6吐温-20/PBS溶液(0.1％)：取1mL吐温-20，加入PBS溶液稀释至1000mL。

1.7溴溶液储备液溶液(0.01％)：称取适量溴，溶于水，配成0.01％的储备液，4℃避光保存。

1.8溴溶液工作液(0.002％)：取10mL0.01％的储备液加入40ml水混匀。于棕色瓶中保存备用。需每次使用前配制。

1.9硫酸溶液(0.05mol/L)：取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量的水中，冷却后定容到1000mL.1.10荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于20μg/L黄曲霉毒素标准溶液。

2仪器和设备

2.1荧光光度计

2.2高速均质器：18,000r/min～22,000r/min

2.3黄曲霉毒素免疫亲和柱

2.4玻璃纤维过滤纸：直径11cm，孔径1.5μm

2.5玻璃注射器：10mL，20 mL。

2.6玻璃试管：直径12mm，知75mm，无荧光性。

2.7空气压力泵。

3分析步骤

3.1提取

准确称取经过磨细的(小于2mm)的25.0g于250mL具塞三角瓶中，加入5.0g氯化钠及准确125.0mL(V₁)甲醇-水(7+3)，以均质器高速搅拌2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL(V₂)滤液并30.0mL(V₃)稀释。用玻璃纤维滤纸l～2过滤次，至滤液澄清，备用。

3.2净化

将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL(V₄)样品提取液注入玻璃注射器下，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL(V)色谱级甲醇溶液洗脱，流速为1mL/min～2 mL/min，收入全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

3.3测定

3.3.1荧光光度计校准

在激光波光360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mon/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值0.0μg/L；以荧光光度计校准计调节荧光光度计的计数值为20.0μg/L。

3.3.2样液测定

取上述净化后的甲醇洗脱液1.0mL，0.002％溴溶液，静置lmin，按3.30.条件进行操作，于荧光光度计中读取中的黄曲霉毒素(B₁+B₂+G₁+G₂)r的浓度c(μg/L)。

3.3.3空白试验

用水代替试样，按3.3.1～3.3.2做空白试验。

3.3.4结果计算

检测结果按公式(1)计算：

$X=\frac{(C1-C2)\·V}{W}---\left(1\right)$

$W=\frac{m}{V1}\×\frac{V2}{V2+V3}\×V_4$

式中：X——试样中黄曲霉毒素(B₁、B₂、G₁或G₂)含量，μg/kg；

C1——试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，μg/L；

C2——空白试验黄曲霉B1、B2、G1或G2的含量，μg/L；

V——最终甲醇洗脱液体积，mL；

W——最终净化洗脱液所含的试样质量，g；

m——试样称取量，g；

V1——样品提取液体积，mL；

V2——稀释用样品滤液体积，mL；

V3——稀释液体积，mL；

V4——通过亲和柱的样品提取液体积，mL。

计算结果需扣除空白值。

发明内容

本发明的目的是提供一种改进的稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱-荧光光度的测定方法，它具有回收率更接近真实值，精密度更高，减少试剂的使用量，降低检测成本，减少对环境的污染，计算方便等优点。

本发明的技术方案是：稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱-荧光光度的测定方法，它依次包括提取、净化、测定和计算步骤，经过甲醇-水提取，提取液经过过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱，层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在亲和柱层析介质的抗体上，清洗亲和柱，后以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，用甲醇洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素的总量；

其特征在于：

提取步骤中取10.0g样品，加入2.0-2.5g氯化钠及60-80％甲醇-水溶液50.0mL，超声10-20min提取；

净化步骤中清洗亲和柱时，先用吐温-20/PBS溶液淋洗亲和柱，后用甲醇∶水＝2∶8的溶液淋洗亲和柱，最后用水清洗亲和柱。

如上所述的稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱-荧光光度的测定方法，其特征在于：提取步骤中，样品滤液与稀释它的水体积比例为1∶3。

本发明的稻谷中黄曲霉毒素的检测方法与国标相比主要有以下不同点：

1.试样和试剂用量

国标GB/T 18979-2003中，样品25.0g，甲醇(7+3)水溶液125.0mL；与本发明方法则是取样品10.0g，甲醇-水溶液50.0mL。主要是为了减少试剂的使用量，降低检测成本，减少对环境的污染。

2.提取方法

国标GB/T 18979-2003中，是用高速搅拌器提取；本发明的检测方法中是用超声提取。这主要是由于试剂减少，用超声提取更为方便。

3.样品稀释比例

国标GB/T 18979-2003中，取15.0mL滤液加入30.0mL水稀释；本发明方法是用10.0mL滤液加入30.0mL水稀释。这样可以使回收率高，且计算方便。

3.净化过程

国标GB/T 18979-2003用10.0mL水清洗柱子2次；而本发明的检测方法则是：用先用吐温-20/PBS溶液淋洗柱，再用甲醇(2+8)溶液清洗柱子，最后用水清洗柱子。这主要助于有效除去柱上的杂质，减少杂质对检测结果的干扰，平行样品的检测重现性更好。

本发明的方法与国标GB/T 18979-2003方法相比较，回收率更接近真实值，精密度更高，减少了试剂的使用量，降低检测成本，减少对环境的污染，计算方便等优点。

具体的实施方式

本发明的具体实施例如下。本发明经过试验与研究，对此现有技术的方法进行了改进与优化，改进后的稻谷中黄曲霉毒素的检测方法按下列步骤进行：

1试剂和溶液

1.1水：本发明实施例的方法提到的水均指重蒸水

1.2甲醇：色谱纯

1.3 60-80％甲醇-水溶液：取60mL甲醇加水40mL，依此累推，配制70％或的甲醇溶液.

1.4甲醇-水(2+8)：取20mL甲醇加水80mL

1.5氯化钠(Nacl)：分析纯

1.6 PBS缓冲溶液：8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节PH值至7.0，最后用纯水稀释到1000mL。

1.7吐温-20/PBS溶液(0.1％)：取1mL吐温-20，加入PBS溶液稀释至1000mL。

1.8原装显色溶液：北京中检维康公司提供。

1.9配制显色溶液：取1mL的原装显色溶液，加入9ml水混匀，需每次使用前配制。

1.10荧光光度计校准溶液：北京中检维康公司提供。红色标定液荧光光度计中读数相当于22μg/L黄曲霉毒素标准溶液，绿色标定液相当于-0.100μg/L黄曲霉毒素标准溶液，黄色标定液相当于11μg/L黄曲霉毒素标准溶液。

2仪器和设备

2.1 VICAM-4荧光光度计

2.2超声波提取器

2.3黄曲霉毒素免疫亲和柱

2.4玻璃纤维过滤纸：直径11cm，孔径1.5μm

2.5玻璃注射器：10mL，20 mL。

2.6玻璃试管：直径12mm，长75mm，无荧光性。

2.7空气压力泵。

3分析步骤

3.1提取

准确称取经过磨细的(小于2mm)的10.0g于150mL具塞三角瓶中，加入2.0g氯化钠及准确50.0mL(V₁)60-80％甲醇-水溶液，超声10min。定量滤纸过滤，准确移取10.0mL(V₂)滤液并30.0mL(V₃)稀释。用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。

3.2净化

将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL(V₄)样品提取液注入玻璃注射器下，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。先用10.0mL吐温-20/PBS溶液淋洗柱1～2次，后用10.0mL甲醇-水(2+8)溶液淋洗柱子，最后用10.0mL水清洗亲和柱，弃去全部流出液，并使柱内液体排空。准确加入1.0mL(V)色谱级甲醇溶液洗脱，流速为1mL/min～2mL/min，收入全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

3.3测定

3.3.1荧光光度计校准

根据仪器的操作说明，对仪器进行校正。先用红色的标定管进行标定，键入正确的读数44ppb；再用绿色的标定管进行标定，键入正确的读数-0.1ppb；最后检测黄色的标定管，读数应为22±2ppb。

3.3.2样液测定

取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.0mL显色溶液，混匀，静置1min，按3.3.1条件进行操作，于荧光光度计中读取中的黄曲霉毒素(B₁+B₂+G₁+G₂)的浓度c(μg/kg)。

3.3.3空白试验

用水代替试样，按4.3.1～3.3.2做空白试验。

3.3.4结果计算

检测结果按公式(2)计算：

X＝c₁-c₀    ………(2)

式中：X——试样中黄曲霉毒素的含量，μg/kg；

c₁——样液中黄曲霉毒素的含量，μg/L；

c₀——空白试样黄曲霉毒素含量，μg/L。

六、本发明稻谷中黄曲霉毒素的检测方法与国标相比主要有以下不同点：

2.试样和试剂用量

国标GB/T 18979-2003中，样品25.0g，甲醇(6+4)溶液125.0mL；与本发明方法则是取样品10.0g，甲醇(6+4)溶液50.0mL。主要是为了减少试剂的使用量，降低检测成本，减少对环境的污染。

2.提取方法

国标GB/T 18979-2003中，是用高速搅拌器提取；本发明的检测方法中是用超声提取。这主要是由于试剂减少，用超声提取更为方便。

3.样品稀释比例

国标GB/T 18979-2003中，取15.0mL滤液加入30.0mL水稀释；本发明方法是用10.0mL滤液加入30.0mL水稀释。这主要为计算方便。

3.净化过程

国标GB/T 18979-2003用10.0mL水清洗柱子2次；而本发明的检测方法则是：用先用10.0mL吐温-20/PBS溶液淋洗柱1～2次，再用10.0mL甲醇(2+8)溶液清洗柱子，最后用10.0mL水清洗柱子。这主要助于有效除去柱上的杂质，减少杂质对检测结果的干扰，平行样品的检测重现性更好，检测结果更接近真实值。

4.与国标GB/T 18979-2003相比，本发明方法检测稻谷中的黄曲霉毒素加样回收率和精密度比较。

国标GB/T 18979-2003检测稻谷，加样回收率在110％～250％之间，平均回收率为155％，平行样品精密度为31.6％；

本发明方法检测稻谷，加样回收率在85％～92％，平均回收率为89％，平行样品精密度为4.4％。

七.与国标GB/T 18979-2003相比，本发明方法检测稻谷中的黄曲霉毒素具有以下优点

本发明通过修改后的方法与国标GB/T 18979-2003方法相比较，回收率更接近真实值，精密度更高，减少了试剂的使用量，降低检测成本，减少对环境的污染，计算方便等优点。

Claims (2)

1.稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱-荧光光度的测定方法，它依次包括提取、净化、测定和计算步骤，经过甲醇-水提取，提取液经过过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱，层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在亲和柱层析介质的抗体上，清洗亲和柱，后以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，用甲醇洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素的总量；

其特征在于：

提取步骤中取10.0g样品，加入2.0-2.5g氯化钠及60-80％甲醇-水溶液50.0mL，超声10-20min提取；

净化步骤中清洗亲和柱时，先用吐温-20/PBS溶液淋洗亲和柱，后用甲醇∶水＝2∶8的溶液淋洗亲和柱，最后用水清洗亲和柱。

2.如权利要求1所述的稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱一荧光光度的测定方法，其特征在于：提取步骤中，样品滤液与稀释它的水体积比例为1∶3。