CN103789396B - 一种快速筛选高产乙醇酵母菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速筛选高产乙醇酵母菌的方法，首先绘制菌株的生长曲线，据此判断其延迟期、对数生长期、稳定期；配制并分装若干试管液体培养基，其中一半倒置放入装满液体培养基的发酵小管，将两种试管培养基高压蒸汽灭菌，取出冷却；在未放发酵小管的试管液体培养基中接入菌种，振荡培养至对数生长末期，取出待用；在菌液培养期间，配制抗生素母液，过滤除菌；无菌操作将发酵小管从试管液体培养基中取出，倒置放入上述培养至对数生长末期的培养液中，保证小管内无气泡进入，并加入适量抗生素溶液，将其转而进行静止发酵培养；待培养至一个周期后，取出上述试管液体，观察发酵小管内气柱大小，气柱越大，乙醇产量越高，从而能够快速筛选出目的菌株。

Description

一种快速筛选高产乙醇酵母菌的方法

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，涉及快速初步筛选微生物高产菌株，特别是在无氧条件下能利用葡萄糖高产乙醇的微生物的快速筛选方法。

背景技术

菌种筛选一直是微生物学领域的重要研究内容之一，也是相关科研工作中需要重点解决的难点之一。对于微生物的定向筛选如定向诱变而言，其目的突变株的筛选工作复杂而重要，而如果没有筛选标记，目的菌株的筛选将更加盲目、繁重。关于目的菌株的筛选方法，国内外的科研工作者做了大量研究探讨，也提出了许多不同思路。这些思路减轻了一些研究任务，目的和方向性也更明确，但仍然工作量巨大。因此有必要对目的菌株的筛选方法做进一步探讨。

另一方面，当能源危机迫使人类开发利用新能源时，筛选高产乙醇的酵母菌菌种就成为转化纤维素或半纤维素生成乙醇的关键影响因素之一。

对于酵母菌，其利用葡萄糖的代谢机理如下：

在以葡萄糖为碳源的培养基（如YEPD培养基）或可转化为葡萄糖的培养基（如PDA培养基）中，酵母菌如酿酒酵母在有氧和无氧条件下都能利用葡萄糖进行代谢。当环境中有氧时，酵母菌能将部分葡萄糖彻底氧化获得生长繁殖所需要的能量，同时产生CO₂；当环境中无氧时，酵母菌也能够发酵葡萄糖，进行低效率的产能代谢，同时生成乙醇和CO₂。

有氧时：C₆H₁₂O₆+6O₂   6CO₂ +6H₂O+能量

无氧时：C₆H₁₂O₆  2CO₂ +2C₂H₅OH+能量 (少量)

由于酵母菌代谢的这一特点，有人提出利用发酵（杜氏）小管来定性指征酵母菌产CO₂的能力，从而间接指征酵母菌产乙醇的能力。但是，这样做的一个缺点是：酵母菌在培养前期即生长繁殖时期进行有氧代谢，将葡萄糖彻底氧化获得能量的同时也产生CO₂，而且产CO₂的效率较高，1分子葡萄糖彻底氧化可生成6分子CO₂；而无氧代谢中，1分子葡萄糖仅能转化生成2分子CO₂。这样，不容易区分发酵小管内的CO₂究竟是通过有氧代谢还是无氧代谢产生，或是前者与后者的比例有多大，如果把这些CO₂不加区分笼统地都当成葡萄糖发酵产生的，很容易得到假的高产菌株。

需要说明的是，当生长条件发生改变时，酵母菌会选择以某一种代谢方式为主。如在有氧条件下，酵母菌以有氧代谢为主，这时所消耗的葡萄糖大部分以有氧形式被代谢，但也有极少一部分以乙醇发酵方式被消耗；而在无氧条件下，酵母菌以无氧代谢为主，这时所消耗的葡萄糖绝大部分以厌氧发酵形式被代谢掉，然而仍有很少一部分以有氧代谢方式被消耗。因此在酵母菌整个培养周期中，并不能严格区分有氧代谢和无氧发酵。尽管如此，但我们仍然可以利用酵母菌在无氧条件下的代谢特点来筛选目的菌株。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种快速、准确地筛选高产乙醇的酵母菌菌株的方法。本发明是利用酵母菌在无氧条件下以乙醇发酵为主这一特点来设计试验方案。

本发明的技术方案是：

一种快速筛选高产乙醇酵母菌的方法，该方法的步骤是：

第1步、首先绘制菌株的生长曲线，据此判断其延迟期、对数生长期、稳定期；

第2步、配制并分装若干试管液体培养基，其中一半倒置放入装满液体培养基的发酵小管，将两种试管培养基高压蒸汽灭菌，取出冷却；

第3步、在未放发酵小管的试管液体培养基中接入菌种，振荡培养恰好至对数生长末期，取出待用；

第4步、在菌液培养期间，配制抗生素母液，过滤除菌；

第5步、无菌操作将第2步中的发酵小管从试管液体培养基中取出，倒置放入上述第3步培养至对数生长末期的培养液中，保证小管内无气泡进入，并加入适量第4步配制的抗生素溶液，将其转而进行静止发酵培养；

第6步、待培养至一个周期后，取出上述第5步中的试管液体，观察发酵小管内气柱大小，气柱越大，乙醇产量越高，从而能够快速筛选出目的菌株。

本发明方法的具体操作如下：

(1)酵母菌菌株生长曲线的绘制

在前期试验中已确定的、包括培养基成分及含量、培养温度、pH、培养周期、振荡速率在内的最佳培养条件下，接种酵母菌于液体培养基中并培养，以培养时间为横坐标、以菌液的吸光度值A₆₀₀为纵坐标，绘制酵母菌培养液的吸光度值A₆₀₀随培养时间变化的生长曲线，据此判断菌株生长的延迟期、对数生长期、稳定期；

(2)试管液体培养基配制及灭菌

配制含葡萄糖的培养基，如YEPD或可转化成葡萄糖的培养基如PDA培养基或豆芽汁葡萄糖培养基或麦芽汁葡萄糖培养基1000mL，分装成100个试管液体，每个9.7mL，取其中的50个试管液体，向其中倒置放入充满上述液体培养基0.3mL的发酵小管，小心操作以免小管内进入气泡，将装有发酵小管的试管液体培养基，记为a，和另外50个未装发酵小管的试管液体培养基，记为b，同时在112℃、0.5Mpa湿热蒸汽下灭菌20min，取出冷却至室温；

(3)接种与培养

以0.5%的接种量在未装发酵小管的试管液体培养基b中接入酵母菌菌株，在30℃下150 r/min振荡培养恰好至对数生长期末期，取出待用，记为c；

(4)抗生素母液配制

分别配制卡那霉素溶液母液和氯霉素溶液母液，浓度均为0.5g/100mL，两种抗生素母液分别在无菌操作下过滤除菌；抗生素母液的配制在接种后菌液培养时期进行；

(5)乙醇发酵

在无菌操作下，将a中的发酵小管从试管液体中取出，迅速倒置放入培养至对数生长期末期的培养液c中，小心操作以使发酵小管中不进入气泡，然后迅速向同一培养液中分别加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素溶液和终浓度为25μg/mL的氯霉素溶液，以上操作完成后，将装有发酵小管的试管培养液c继续在30℃下静置培养至一个培养周期；

一个培养周期包括不产乙醇的菌体生长阶段和菌体发酵葡萄糖产乙醇和CO₂阶段；

(6) 乙醇高产菌株的初筛

将上述完成一个培养周期的培养液c取出，观察试管液体中发酵小管内的气泡产生情况及排出液体情况，根据发酵小管内的气柱大小即能初步判断出酵母菌产乙醇的多少，气柱越大，间接说明乙醇产量越高，这样能够很迅速地筛选出高产乙醇的目的菌株；产乙醇的多少通过进一步定量检测来确定；

(7)初筛结果验证

将上述初筛得到的高产菌株进行产乙醇发酵，然后取样，适当稀释，运用生物传感分析仪法或液相色谱法进行产乙醇分析，以验证本方法初筛结果的准确性。

本发明的优点和有益效果：

本发明根据酵母菌在有氧和无氧条件下的代谢特点不同，合理安排放置发酵小管的时间，巧妙排除其在有氧条件下产CO₂对发酵判断的干扰，保证发酵小管内的CO₂气体绝大部分为伴随产乙醇发酵所产生，而非好氧代谢产生。使得根据发酵小管内气泡多少来判断酵母菌产乙醇能力更具有准确性。另外，本方法不仅适合于一般产乙醇酵母菌的筛选，尤其适用于酵母菌诱变突变株的筛选。本方案逻辑性严密，操作简单、易行，是一种快捷而准确地筛选方法。

附图说明

图1是酿酒酵母QD在YEPD中的生长曲线。

图2是粟酒裂殖酵母2.1621在YEPD中的生长曲线。

图3是马克斯克鲁维酵母191l在YEPD中的生长曲线。

图4是酿酒酵母QD在PDA中的生长曲线。

图5是粟酒裂殖酵母2.1621在PDA中的生长曲线。

图6是马克斯克鲁维酵母191l在PDA中的生长曲线。

图7是酿酒酵母QD在豆芽汁葡萄糖培养基中的生长曲线。

图8是粟酒裂殖酵母2.1621在豆芽汁葡萄糖培养基中的生长曲线。

图9是马克斯克鲁维酵母191l在在豆芽汁葡萄糖培养基中的生长曲线。

具体实施方式

实施例1：酵母菌在YEPD培养基中发酵葡萄糖产乙醇能力的初步判断

能发酵葡萄糖产乙醇的酵母菌菌种分别为 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)QD，来源于青岛啤酒股份有限公司，粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe) 2.1621，来源于中科院菌种保藏中心，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)191l，来源于中国工业微生物菌种保藏中心，三个均为已公开菌种。

按照常规实验方法，需要在实验中对每种酵母菌的产乙醇能力进行测试。

接种菌液的活菌浓度为1.0×10⁶ ~ 1.0×10⁷ CFU/mL；酵母菌YEPD培养基溶液是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/1000mL水溶液计分别为 酵母粉 10.0、蛋白胨 20.0、葡萄糖 20.0，余量为水，培养基的pH值自然；培养基的灭菌方式为高压蒸汽灭菌，灭菌温度为112℃，时间为20min。

通过前期试验已确定各个菌株最佳培养条件为  培养温度 30℃、培养周期 24h、振荡速率 150r/min、pH值自然。

(1) 绘制酵母菌的生长曲线

在前期试验中已确定的、包括YEPD培养基各成分的含量、培养温度、培养周期、pH、振荡速率在内的最佳培养条件下，接种酵母菌于液体培养基中并培养，以培养时间为横坐标、以菌液的吸光度值A₆₀₀为纵坐标，每隔2h取样一次，测溶液的吸光度值A₆₀₀，绘制各个酵母菌培养液的吸光度值A₆₀₀随培养时间变化的生长曲线，据此判断各菌株的延迟期、对数生长期、稳定期，参见附图，其中附图1为酿酒酵母QD生长曲线，附图2为粟酒裂殖酵母菌2.1621生长曲线，附图3为马克斯克鲁维酵母191l生长曲线。

(2)试管液体培养基配制及灭菌

配制含葡萄糖的YEPD培养基1000mL，分装成100个试管液体，每个9.7mL；取其中的50个试管液体，在其中放入倒置的充满上述液体培养基0.3mL的发酵小管，小心操作以使小管内不产生气泡，将装有发酵小管的试管液体培养基，记为a，和另外50个未装发酵小管的试管液体培养基，记为b，同时在112℃、0.5Mpa湿热蒸汽下灭菌20min，取出冷却。

(3) 接种与培养

以0.5%的接种量在未装发酵小管的试管液体培养基中接入酵母菌菌液，在30℃下150 r/min振荡培养8h，此时菌液处于对数生长期末期，取出待用，记为c。

(4) 抗生素母液配制

分别配制卡那霉素溶液母液和氯霉素溶液母液，浓度均为0.5g/100mL，两种抗生素母液分别在无菌操作下过滤除菌；抗生素母液的配制在接种后菌液培养时期进行。

(5) 乙醇发酵

在无菌操作下，将a中的发酵小管取出，迅速倒置放入培养至对数生长期末期的培养液c中，小心操作以使发酵小管中不进入气泡，然后迅速向培养液中分别加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素溶液和终浓度为25μg/mL的氯霉素溶液，以上操作完成后，将装有发酵小管的试管培养物c继续在30℃下静置培养至一个培养周期。

一个培养周期包括不放发酵小管的菌体生长阶段和放入发酵小管后菌体发酵葡萄糖产乙醇和CO₂阶段。

(6)乙醇高产菌株初筛

将上述完成一个培养周期的培养液c取出，观察试管液体中发酵小管内的气泡产生情况及排出液体情况，根据发酵小管内气柱大小即可初步判断出酵母菌产乙醇的多少，气柱越大，产乙醇越多，这样可以很迅速地筛选出高产乙醇的菌株，产乙醇的多少可通过进一步的定量检测如液相色谱法或生物传感分析仪法来确定。

(7)初筛结果验证

将上述初筛得到的高产菌株进行产乙醇发酵，取样，进行适当稀释，运用SBA-40C型生物传感分析仪进行产乙醇分析，以验证本方案的正确性。

酵母菌生长曲线参见附图1、附图2、附图3，由于YEPD培养基中营养物质丰富且便于利用，酵母菌经过短暂的延迟期后很快进入对数生长期，根据生长曲线可知：酿酒酵母QD生长的延迟期为0-2h、对数生长期为2-10h、10h以后进入稳定期；粟酒裂殖酵母菌2.1621的生长延迟期为0-2h、对数生长期为2-10h、10h以后进入稳定期；马克斯克鲁维酵母191l的生长延迟期为0-2h、对数生长期为2-10h、培养10h以后进入稳定期；

比较各个菌株发酵小管中气柱大小，得到结果参见附表1

注：根据发酵小管中产气多少分为5个等级：

a “++++”表示发酵小管中充满气体，

b “+++”表示发酵小管中充满3/4气体，

c “++” 表示发酵小管中充满l/2气体，

d “+” 表示发酵小管中充满1/4气体，

e “-” 表示发酵小管中没有气体

初筛结果的验证

对上表中列出的产气体菌株进行产乙醇发酵分析，以验证初筛结果的正确性。配制乙醇标准溶液的浓度为40mg/100mL，发酵液原液稀释40倍后，测得各个菌株的乙醇含量如下表2

注：上表中乙醇产量值为发酵原液稀释40倍后测得值

由表2中数据可以看出，酿酒酵母QD的乙醇产量相对较高，验证了表1中列出的初筛结果，说明本实验方案是正确的。

实施例2：酵母菌发酵马铃薯葡萄糖培养基产乙醇能力的初步判断

酵母菌发酵培养基溶液改为马铃薯葡萄糖(PDA)培养基，是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/1000mL水溶液计分别为马铃薯 200.0、葡萄糖 20.0，余量为水，pH值自然。

其配制方法是 称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，加葡萄糖，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管，加塞、包扎，112℃灭菌20min后取出冷却。

除培养基及其制作方法不同、培养周期为48h、取样时间间隔为4h外，其它如培养温度、振荡速率、接种活菌浓度、生长曲线绘制、试管液体分装、接种与培养、抗生素母液配制、乙醇发酵及高产乙醇菌株的初筛、初筛结果验证等都与实施例1完全相同。

图4所示为酿酒酵母QD在PDA培养液中的生长曲线，可知菌株生长的延迟期为0-4h、对数生长期为4-24h、24h以后进入稳定期；图5为粟酒裂殖酵母菌2.1621在PDA培养液中的生长曲线，可知菌株生长的延迟期为0-4h、对数生长期为4-24h、24h以后进入稳定期；图6为马克斯克鲁维酵母191l在PDA培养液中的生长曲线，可知菌株生长的延迟期为0-4h、对数生长期为4-24h、24h以后进入稳定期。

以下表3为各个菌株产气泡情况

注：根据发酵小管中产气多少分为5个等级：

a“++++”表示发酵小管中充满气体，

b“+++”表示发酵小管中充满3/4气体，

c“++” 表示发酵小管中充满l/2气体，

d“+” 表示发酵小管中充满1/4气体，

e“-” 表示发酵小管中没有气体

初筛结果的验证

在PDA培养基中，各菌株的产气泡情况与YEPD培养基中的基本相似，仍然是酿酒酵母QD产气泡较多，对上述各菌株进行产乙醇发酵分析，以验证初筛结果的正确性，得到如下表4数据

注：上表中乙醇产量值为发酵原液稀释40倍后测得值

由表4中数据可以看出，在PDA培养基中，仍然是酿酒酵母QD的乙醇产量较高，验证了表3中列出的初筛结果，说明本实验方案是正确的。

实施例3：酵母菌发酵豆芽汁葡萄糖培养基产乙醇能力的初步判断

酵母菌发酵培养基溶液改为豆芽汁葡萄糖培养基，是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/1000mL水溶液计分别为 黄豆芽 100.0、葡萄糖 50.0，余量为水，pH值自然。

配制方法  称新鲜黄豆芽100g，置于烧杯中，再加入1000 mL水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。按每100 mL10％豆芽汁加入5g葡萄糖。然后分装、加塞、包扎。高压蒸汽灭菌112℃灭菌20min后取出。

除了培养基及其制作方法不同外，其它如培养条件、取样时间间隔、接种活菌浓度、生长曲线绘制、试管液体分装、接种与培养、抗生素母液配制、乙醇发酵及高产乙醇菌株的初筛等都与实施例2完全相同。

附图7为酿酒酵母QD在豆芽汁葡萄糖培养液中的生长曲线，可知菌株生长的延迟期为0-4h、对数生长期为4-24h、24h以后进入稳定期；附图8为粟酒裂殖酵母菌2.1621在PDA培养液中的生长曲线，可知菌株生长的延迟期为0-4h、对数生长期为4-24h、24h以后进入稳定期；附图9为马克斯克鲁维酵母191l在PDA培养液中的生长曲线，可知菌株生长的延迟期为0-4h、对数生长期为4-24h、24h以后进入稳定期。

以下表5为各个菌株产气泡情况

注：根据发酵小管中产气多少分为5个等级：

a“++++”表示发酵小管中充满气体，

b“+++”表示发酵小管中充满3/4气体，

c“++” 表示发酵小管中充满l/2气体，

d“+” 表示发酵小管中充满1/4气体，

e“-” 表示发酵小管中没有气体

初筛结果的验证

在豆芽汁葡萄糖培养基中，各菌株的产气泡情况与在YEPD培养基中的基本相似，仍然是酿酒酵母QD产气泡较多，对上述各菌株进行产乙醇发酵分析，以验证初筛结果的正确性，得到如下表6数据

注：上表中乙醇产量值为发酵原液稀释40倍后测得值

由表6中数据可以看出，在豆芽汁葡萄糖培养基中，仍然是酿酒酵母QD的乙醇产量较高，定量分析的结果验证了表5中的初筛结果，说明本实验方案是正确的。

Claims (3)

1.一种快速筛选高产乙醇酵母菌的方法，其特征在于：该方法的步骤是：

第1步、首先绘制菌株的生长曲线，据此判断其延迟期、对数生长期、稳定期；

第2步、配制并分装若干试管液体培养基，其中一半倒置放入装满液体培养基的发酵小管，将两种试管培养基高压蒸汽灭菌，取出冷却；

第3步、在未放发酵小管的试管液体培养基中接入菌种，振荡培养恰好至对数生长末期，取出待用；

第4步、在菌液培养期间，配制抗生素母液，过滤除菌；

第5步、无菌操作将第2步中的发酵小管从试管液体培养基中取出，倒置放入上述第3步培养至对数生长末期的培养液中，保证小管内无气泡进入，并加入适量第4步配制的抗生素溶液，将其转而进行静止发酵培养；

第6步、待培养至一个周期后，取出上述第5步中的试管液体，观察发酵小管内气柱大小，气柱越大，乙醇产量越高，从而能够快速筛选出目的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法具体操作如下：

(1)酵母菌生长曲线的绘制

在前期试验中已确定的、包括培养基成分及含量、培养温度、pH、培养周期、振荡速率在内的最佳培养条件下，接种酵母菌于液体培养基中并培养，以培养时间为横坐标、以菌液的吸光度值A₆₀₀为纵坐标，绘制酵母菌培养液的吸光度值A₆₀₀随培养时间变化的生长曲线，据此判断菌株生长的延迟期、对数生长期、稳定期；

(2)试管液体培养基配制及灭菌

配制含葡萄糖的培养基YEPD或可转化成葡萄糖的培养基PDA或豆芽汁葡萄糖培养基或麦芽汁葡萄糖培养基1000mL，分装成100个试管液体，每个9.5m~9.8mL，取其中的50个试管液体，向其中倒置放入充满上述液体培养基0.2mL~0.5mL的发酵小管，小心操作以免小管内进入气泡，将装有发酵小管的试管液体培养基，记为a，和另外50个未装发酵小管的试管液体培养基，记为b，同时在112℃、0.5Mpa湿热蒸汽下灭菌20min，取出冷却至室温；

(3)接种与培养

以0.5%的接种量在未装发酵小管的试管液体培养基b中接入酵母菌菌株，在30℃下150 r/min振荡培养恰好至对数生长期末期，取出待用，记为c；

(4)抗生素母液配制

分别配制卡那霉素溶液母液和氯霉素溶液母液，浓度均为0.5g/100mL，两种抗生素母液分别在无菌操作下过滤除菌；抗生素母液的配制在接种后菌液培养时期进行；

(5)乙醇发酵

在无菌操作下，将a中的发酵小管从试管液体中取出，迅速倒置放入培养至对数生长期末期的培养液c中，小心操作以使发酵小管中不进入气泡，然后迅速向同一培养液中分别加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素溶液和终浓度为25μg/mL的氯霉素溶液，以上操作完成后，将装有发酵小管的试管培养液c继续在30℃下静置培养至一个培养周期；

一个培养周期包括不产乙醇的菌体生长阶段和菌体发酵葡萄糖产乙醇和CO₂阶段；

(6) 乙醇高产菌株的初筛

将上述完成一个培养周期的培养液c取出，观察试管液体中发酵小管内的气泡产生情况及排出液体情况，根据发酵小管内气柱大小即能初步判断出酵母菌产乙醇的多少，气柱越大，间接说明乙醇产量越高，这样能够很迅速地筛选出高产乙醇的目的菌株；产乙醇的多少通过进一步定量检测来确定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于该方法还包括：

(7)初筛结果验证

将上述初筛得到的高产菌株进行产乙醇发酵，然后取样，适当稀释，运用生物传感分析仪法或液相色谱法进行产乙醇分析，以验证本方法初筛结果的准确性。