CN103757069A - 树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法 - Google Patents

树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103757069A
CN103757069A CN201410010765.3A CN201410010765A CN103757069A CN 103757069 A CN103757069 A CN 103757069A CN 201410010765 A CN201410010765 A CN 201410010765A CN 103757069 A CN103757069 A CN 103757069A
Authority
CN
China
Prior art keywords
prodigiosin
adsorption
fermentation
fermented liquid
resin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410010765.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘晓侠
孙诗清
王玉洁
尤忠毓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing University
Original Assignee
Jiaxing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing University filed Critical Jiaxing University
Priority to CN201410010765.3A priority Critical patent/CN103757069A/zh
Publication of CN103757069A publication Critical patent/CN103757069A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，该方法包括以下步骤：采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养：首先进行平板活化，其次进行种子培养，最后扩大培养；针对上样量、吸附液pH、吸附时间、吸附温度进行单因素试验，并测定吸附率；根据单因素试验确定的正交试验的试验因素进行正交试验。本发明以筛选出高产红色素菌株为出发菌株，采用研究团队优化好的培养基进行摇瓶发酵，筛选最优的吸附树脂，通过单因素和正交试验设计，进行树脂对灵菌红素吸附性能的考察，并确定最佳的吸附条件，为灵菌红素的发酵分离耦合提供了依据。

Description

树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法。
背景技术
如今市场上对灵菌红素的研究需求很大，其作为天然生物中提取的脂多糖对抗癌及肿瘤有较好的效果。而且目前国内市场大多为从植物中提取的红色素，相比细菌生产，植物提取周期长，工艺复杂，会对红色素的质量以及产量造成影响。同时实验室的沙雷氏菌虽然有着较高的产量。但分离得到纯品须通过树脂层析分离，虽然效果较好，但耗时久，不利于规模化工业化生产。
所以从常见的工业发酵分离耦合方法如吸附法分离中寻求快速分离的方法是一条较好地解决方法。因此，对于灵菌红素的分离方法需要进行不断的创新，找到最优的分离耦合路线也非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，旨在为灵菌红素的发酵分离耦合提供依据。
本发明是这样实现的，一种树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法包括以下步骤：
步骤一、采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养：首先进行平板活化，其次进行种子培养，最后扩大培养；
步骤二、针对上样量、吸附液pH、吸附时间、吸附温度进行单因素试验，并测定吸附率；
步骤三、根据单因素试验确定的正交试验的试验因素进行正交试验。
进一步，所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法的实验仪器包括：722s可见分光光度计、电子天平AL204、高速离心VS-15000N、HD-930组合式全温度震荡培养箱、pH计UB-7。
所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法的试验试剂包括：D101大孔吸附树脂，盐酸，丙酮分析纯，蛋白胨、甘油、NaCl、MgSO4、甘氨酸等。
进一步，步骤一所述的采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养的具体步骤如下：
首先平板活化：将在零下70度保藏的菌种在准备好的平板上划线，37℃培养12小时；
其次种子培养：挑选平板上的长势好的单菌落接入摇瓶中培养，37℃，200r/min，12小时；
最后扩大培养：将种子培养液接入准配好的摇瓶中，28℃，200r/min，48小时。
进一步，步骤二所述的吸附率测定的具体方法如下:
将实验所得灵菌红素丙酮提取液旋转蒸发至恒重，准确称取产品0.0400g，然后用丙酮定容至50ml容量瓶中，制成0.8g/L储备液，用移液枪准确吸取150ul，200ul，250ul，300ul，350ul储备液于10ml容量瓶中，以丙酮定容，制成0.012g/L，0.016g/L，0.020g/L，0.024g/L，0.028g/L溶液，在535nm下,测其OD值，以OD值为横坐标，产品浓度为纵坐标绘制曲线；
D101对灵菌红素的吸附公式为（1）
O为吸附率（g/g），C1为灵菌红素在发酵液中的含量（g/L），C2为灵菌红素在吸附后发酵液中的含量（g/L），M为放入发酵液中的D101质量（g），V为发酵液体积（L）。
进一步，步骤二所述的单因素试验的具体方法如下：
针对上样量的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右六份，分别放入发酵液体积为10，20,30,40,50,60ml摇瓶，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡约20小时，之后与未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
针对pH的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右六份，分别放入含有10ml发酵液pH分别为1,2,3,4,5,6,7的摇瓶中，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡约20小时，之后与未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
针对吸附时间的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右六份，分别放入含有10ml发酵液的摇瓶中，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡，分别在震荡1,5,10,15,20,25h后稀释100倍测取OD值，未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
针对吸附温度的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右五份，分别放入含有10ml发酵液的摇瓶在15,20,25,30,35℃，摇床中震荡20h后稀释100倍测取OD值，未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
效果汇总
本发明以筛选出高产红色素菌株为出发菌株，采用研究团队优化好的培养基进行摇瓶发酵，筛选最优的吸附树脂，通过单因素和正交试验设计，进行树脂对灵菌红素吸附性能的考察，并确定最佳的吸附条件，为灵菌红素的发酵分离耦合提供了依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法流程流程图；
图2是本发明实施例提供的上样量对吸附率的影响曲线；
图3是本发明实施例提供的吸附时间对灵菌红素吸附率的影响曲线；
图4是本发明实施例提供的pH值对吸附率的影响曲线；
图5是本发明实施例提供的温度对吸附率的影响曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明的一种树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法流程，包括以下步骤：
S101：采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养：首先进行平板活化，其次进行种子培养，最后扩大培养；
S102：针对上样量、吸附液pH、吸附时间、吸附温度进行单因素试验，并测定吸附率；
S103：根据单因素试验确定的正交试验的试验因素进行正交试验。
进一步，所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法的实验仪器包括：722s可见分光光度计、电子天平AL204、高速离心VS-15000N、HD-930组合式全温度震荡培养箱、pH计UB-7。
所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法的试验试剂包括：D101大孔吸附树脂，盐酸，丙酮分析纯，蛋白胨、甘油、NaCl、MgSO4、甘氨酸等。
进一步，步骤S101所述的采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养的具体步骤如下：
首先平板活化：将在零下70度保藏的菌种在准备好的平板上划线，37℃培养12小时；
其次种子培养：挑选平板上的长势好的单菌落接入摇瓶中培养，37℃，200r/min，12小时；
最后扩大培养：将种子培养液接入准配好的摇瓶中，28℃，200r/min，48小时。
进一步，步骤S102所述的吸附率测定的具体方法如下:
将实验所得灵菌红素丙酮提取液旋转蒸发至恒重，准确称取产品0.0400g，然后用丙酮定容至50ml容量瓶中，制成0.8g/L储备液，用移液枪准确吸取150ul，200ul，250ul，300ul，350ul储备液于10ml容量瓶中，以丙酮定容，制成0.012g/L，0.016g/L，0.020g/L，0.024g/L，0.028g/L溶液，在535nm下,测其OD值，以OD值为横坐标，产品浓度为纵坐标绘制曲线；
D101对灵菌红素的吸附公式为
Figure BDA0000455222480000061
（1）
O为吸附率（g/g），C1为灵菌红素在发酵液中的含量（g/L），C2为灵菌红素在吸附后发酵液中的含量（g/L），M为放入发酵液中的D101质量（g），V为发酵液体积（L）。
进一步，步骤S102所述的单因素试验的具体方法如下：
针对上样量的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右六份，分别放入发酵液体积为10，20,30,40,50,60ml摇瓶，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡约20小时，之后与未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
针对pH的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右六份，分别放入含有10ml发酵液pH分别为1,2,3,4,5,6,7的摇瓶中，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡约20小时，之后与未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
针对吸附时间的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右六份，分别放入含有10ml发酵液的摇瓶中，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡，分别在震荡1,5,10,15,20,25h后稀释100倍测取OD值，未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
针对吸附温度的试验：准确称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g左右五份，分别放入含有10ml发酵液的摇瓶在15,20,25,30,35℃，摇床中震荡20h后稀释100倍测取OD值，未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式（1）测吸附率。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
由图3可见，随着上样量的增加大孔树脂的吸附率也在上升，因此上样量达到40ml时上升幅度不明显，达到40,50,60ml上样量吸附率没有明显的增长了，故选择40ml为最佳上样量。
由图4中的结果可看出在吸附的前十个小时吸附率的提升较为明显，15h，20h对吸附率提升不明显，可能是树脂吸附接近饱和了，但依然有增加吸附率。所以选择20h吸附为最佳吸附时间。
由图5可看出在pH分别在1与7时的吸附效果差，而在pH为2,3,4,5,6时吸附率接近并在pH在2和3时有较高值，这可能与灵菌红素的适宜范围为酸性有关，所以选择pH=3为最佳吸附pH。
分析可得：在较低温度15,20℃时吸附率较低，而在温度为25,30,35℃时吸附率虽然增加但变化不明显,25℃是吸附率较高，故选择25℃为最佳吸附温度。
选定正交表后按四因素三水平的因素水平表进行试验，并对结果进行分析，得到下表：
Figure BDA0000455222480000081
从正交试验来看，时间对吸附率影响最大，其次是pH和上样量，而吸附温度对吸附率的影响最小。
由图2可见随着上样量的增加D101树脂的吸附率也在上升，但在30ml上样量之后上升幅度明显减少，之后的40,50,60ml上样量吸附率没有明显的增长了，故选择40ml为最佳上样量；由图3中的结果可看出在吸附的前十个小时吸附率的提升较为明显，15h，20h对吸附率提升不明显，可能是树脂吸附接近饱和了，但依然有增加吸附率。所以选择20h吸附为最佳吸附时间;由图4可看出在pH分别在1与7时的吸附效果差，而在pH为2,3,4,5,6时吸附率接近并在pH在2和3时有较高值，这可能与灵菌红素的适宜范围为酸性有关，所以选择pH=3为最佳吸附pH;由图5可以看出在较低温度15,20℃时吸附率较低，而在温度为25,30,35℃时吸附率虽然增加但变化不明显，从图中来看25℃是吸附率较高，故选择25℃为最佳吸附温度。
故在D101大孔吸附树脂质量为0.5g左右时，最佳吸附条件为pH=2，发酵液50ml，30℃，吸附时间25h,吸附率为每克D101树脂吸附0.1455的灵菌红素。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述的研究方法包括以下步骤：
步骤一、采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养：首先进行平板活化，其次进行种子培养，最后扩大培养；
步骤二、针对上样量、吸附液pH、吸附时间、吸附温度进行单因素试验，并测定吸附率；
步骤三、根据单因素试验确定的正交试验的试验因素进行正交试验。
2.如权利要求1所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法的实验仪器包括：722s可见分光光度计、电子天平AL204、高速离心VS-15000N、HD-930组合式全温度震荡培养箱、pH计UB-7；
所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法的试验试剂包括：D101大孔吸附树脂，盐酸，丙酮分析纯，蛋白胨、甘油、NaCl、MgSO4、甘氨酸。
3.如权利要求1所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，步骤一所述的采用二级发酵进行灵菌红素的发酵培养的具体步骤如下：
首先平板活化：将在零下70度保藏的菌种在准备好的平板上划线，37℃培养12小时；
其次种子培养：挑选平板上的长势好的单菌落接入摇瓶中培养，37℃，200r/min，12小时；
最后扩大培养：将种子培养液接入准配好的摇瓶中，28℃，200r/min，48小时。
4.如权利要求1所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，步骤二所述的吸附率测定的具体方法如下:
将所得灵菌红素丙酮提取液旋转蒸发至恒重，称取产品0.0400g，然后用丙酮定容至50ml容量瓶中，制成0.8g/L储备液，用移液枪准确吸取150ul，200ul，250ul，300ul，350ul储备液于10ml容量瓶中，以丙酮定容，制成0.012g/L，0.016g/L，0.020g/L，0.024g/L，0.028g/L溶液，在535nm下，测其OD值，以OD值为横坐标，产品浓度为纵坐标绘制曲线；
D101对灵菌红素的吸附公式为
Figure FDA0000455222470000021
O为吸附率，单位为g/g，C1为灵菌红素在发酵液中的含量，单位为g/L，C2为灵菌红素在吸附后发酵液中的含量，单位为g/L，M为放入发酵液中的D101质量，单位为g，V为发酵液体积，单位为L。
5.如权利要求1所述的树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法，其特征在于，步骤二所述的单因素试验的具体方法如下：
针对上样量的试验：称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g六份，分别放入发酵液体积为10，20,30,40,50,60ml摇瓶，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡20小时，之后与未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式
Figure FDA0000455222470000031
测吸附率；
针对pH的试验：称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g六份，分别放入含有10ml发酵液pH分别为1,2,3,4,5,6,7的摇瓶中，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡20小时，之后与未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式
Figure FDA0000455222470000032
测吸附率；
针对吸附时间的试验：称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g六份，分别放入含有10ml发酵液的摇瓶中，放入28℃，200r/min的恒温摇床中震荡，分别在震荡1,5,10,15,20,25h后稀释100倍测取OD值，未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式 O = ( C 1 - C 2 M ) · V 测吸附率；
针对吸附温度的试验：称取以乙醇活化过的D101大孔吸附树脂0.5g五份，分别放入含有10ml发酵液的摇瓶在15,20,25,30,35℃，摇床中震荡20h后稀释100倍测取OD值，未吸附的发酵液一并稀释100倍测取OD值，按照公式
Figure FDA0000455222470000034
测吸附率。
CN201410010765.3A 2014-01-09 2014-01-09 树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法 Pending CN103757069A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410010765.3A CN103757069A (zh) 2014-01-09 2014-01-09 树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410010765.3A CN103757069A (zh) 2014-01-09 2014-01-09 树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103757069A true CN103757069A (zh) 2014-04-30

Family

ID=50524385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410010765.3A Pending CN103757069A (zh) 2014-01-09 2014-01-09 树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103757069A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480224A (zh) * 2014-12-13 2015-04-01 河南天冠企业集团有限公司 一种微生物发酵过程ph值的调节方法
CN104711295A (zh) * 2015-03-14 2015-06-17 国家***第一海洋研究所 一种大孔吸附树脂动态发酵吸附真菌色素的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1563400A (zh) * 2004-04-19 2005-01-12 华东理工大学 一种分离制备灵菌红素的方法
CN102002469A (zh) * 2010-09-28 2011-04-06 嘉兴学院 生产灵菌红素的菌株及其方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1563400A (zh) * 2004-04-19 2005-01-12 华东理工大学 一种分离制备灵菌红素的方法
CN102002469A (zh) * 2010-09-28 2011-04-06 嘉兴学院 生产灵菌红素的菌株及其方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XUEDONG WANG ET AL.: "Development of an adsorption procedure for the direct separation and purification of prodigiosin from culture broth", 《BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM.》, vol. 40, no. 3, 31 December 2004 (2004-12-31) *
何志伟等: "大孔吸附树脂纯化乌饭树果色素的研究", 《食品科技》, no. 9, 20 September 2007 (2007-09-20), pages 88 - 92 *
王增等: "灵菌红素提取工艺的优化方案", 《嘉兴学院学报》, vol. 23, no. 6, 11 November 2011 (2011-11-11), pages 96 - 99 *
黄永春等: "采用大孔吸附树脂D-101初步分离提取TJ430菌株发酵液中的抗生素", 《植物保护》, vol. 39, no. 4, 8 August 2013 (2013-08-08), pages 85 - 89 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480224A (zh) * 2014-12-13 2015-04-01 河南天冠企业集团有限公司 一种微生物发酵过程ph值的调节方法
CN104711295A (zh) * 2015-03-14 2015-06-17 国家***第一海洋研究所 一种大孔吸附树脂动态发酵吸附真菌色素的方法
CN104711295B (zh) * 2015-03-14 2018-05-25 国家***第一海洋研究所 一种大孔吸附树脂动态发酵吸附真菌色素的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102084780B (zh) 一种高含量生物活性物质的蛹虫草子实体栽培方法
CN104178564B (zh) 高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用
CN101671712B (zh) 阿维菌素发酵过程优化与放大的方法与装置
CN103757069A (zh) 树脂吸附原位分离并耦合发酵生产灵菌红素的方法
CN204028066U (zh) 一种土壤释放气体的常压培养模拟装置
CN111134007B (zh) 一种提高东北刺人参不定根中黄酮含量的方法
CN101398413B (zh) 亚氨基二乙酸的液相分析方法
CN108866128A (zh) 一种提高春雷霉素生物效价方法
CN102937631A (zh) 一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法
CN107629980A (zh) 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌sxz‑n5菌株及用途
CN102417888B (zh) 一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌及其应用
Sun et al. Analysis of metabolomic changes in xylem and phloem sap of cucumber under phosphorus stresses
CN105628631A (zh) 一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法
CN105176852A (zh) 一种工业化快速发酵生产皮状丝孢酵母的方法
CN102676444B (zh) 一种促进芽孢杆菌生长的培养基及其应用
CN109060995A (zh) 一种杏仁香茶树种质资源的筛选方法
CN103323551A (zh) 一种检测枸杞酸含量的方法
CN101008000A (zh) 一种生产β－胡萝卜素的粘性红圆酵母、β－胡萝卜素及其生产方法
CN107523522A (zh) 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的解淀粉芽孢杆菌sxz‑n2菌株及用途
CN103642691B (zh) 深孔细胞培养板
CN103509737B (zh) 一种摩氏摩根菌及其在麻疯树饼粕发酵脱毒中的应用
CN101974435A (zh) 新霉素菌种选育快速筛选方法
CN104569185B (zh) 一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中柠檬酸的方法
CN104569182B (zh) 一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中酒石酸的方法
CN104569183B (zh) 一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140430