CN107446827B - 一株淡紫紫孢菌及其应用 - Google Patents

一株淡紫紫孢菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株淡紫紫孢菌及其应用。该菌株为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05，于2017年05月09日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60178。该菌株在生长代谢过程产生对植物生长有促进作用的物质，特别是对烟草的生长有显著的促进作用。利用该菌株进行液体发酵，然后对发酵产物进行后处理，可制备成烟草促生长生物菌剂，该烟草促生长生物菌剂便于保存与运输，使用方便，活性稳定，能有效改善烟草农艺性状，提高烟草产量；且环境友好，对土壤和环境无污染，对实现农业可持续发展具有重要意义。

Description

一株淡紫紫孢菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体是涉及一株淡紫紫孢菌及其烟草促生长生物菌剂制备方法及其应用。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物之一，在我国，烟草总产量约占世界烟草产量的1/3，居世界第一，烟草行业是多年的利税大户，是国家和地方税收的重要经济来源。影响烟草种植产量的因素很多，包括气候、烟草品种、土壤、施肥、病虫害等，为提高烟草产量，在种植过程中施用了大量的化肥和农药，随着时间累积，对烟草种植土壤和环境造成了严重破坏。
生物菌剂利用微生物及其代谢产物来改善作物营养条件和生长环境，来刺激作物生长发育，抵抗病虫危害，从而达到提高作物产量的目的，具有天然无危害，可降解等优点，受到越来越多的关注。近年来，生物菌剂已广泛应用于各种作物栽培，对番茄、黄瓜、大豆等有明显促进生长，提高土壤肥力的作用。生物菌剂的使用，不仅可以提高作物产量，还可以降低化肥和农药的使用，减少环境污染，对实现农业可持续发展具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株淡紫紫孢菌。
本发明的另一目的在于提供上述淡紫紫孢菌的应用。
本发明的另一目的在于提供一种烟草促生长生物菌剂的制备方法。
本发明的再一的在于提供通过上述制备方法制备得到的烟草促生长生物菌剂。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株淡紫紫孢菌，菌种命名为淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)BPT05，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年05月09日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60178。
所述的淡紫紫孢菌BPT05分离自土壤，在PDA平板上菌落形态见图1，菌落为圆形，中央***，菌丝致密，表面无分泌物，有淡紫色粉质状的分生孢子；显微镜检见图2，分生孢子为单细胞，圆形、卵形或纺缍形。
所述的淡紫紫孢菌BPT05，对其进行分子鉴定：引物分别为ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS86(5'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3')，PCR扩增，测序结果如SEQ ID NO：1所示，通过比对，其与淡紫紫孢菌菌株Purpureocillium lilacinum strainNFML_CH79_5Cc83同源性达到了100％，构建的进化树见图3。
所述的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05在促进烟草生长中的应用。
一种烟草促生长生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
利用淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05进行液体发酵，对发酵液进行后处理得到烟草促生长生物菌剂。
所述的液体发酵生产方法为：从活化的淡紫紫孢菌BPT05菌种斜面挑取1～2环菌种接种到种子培养基，28～32℃，180～200r/min摇床培养24～36h得到种子液，然后按5％～10％(v/v)接种量接种到发酵培养基，摇瓶发酵条件为：28～32℃，180～200r/min发酵72～96h；发酵罐培养条件为温度28～32℃，搅拌速度150～400r/min发酵72～96h，通气量0.5～1.0vvm，pH 6.5～7.5，罐压0.01～0.03Mpa。
所述的种子培养基的成份及含量为：蔗糖30g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4·7H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水。
所述的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐；发酵培养基初始pH 6.5～7.5；所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉类水解液中的一种或几种，用量为20～40g/L；所述的氮源为玉米粉、黄豆粉、麸皮、NaNO3、NH4NO3中的一种或几种，用量为3～5g/L；所述的无机盐为K2HPO4·7H2O 2～4g/L，MgSO4·7H2O 0.2～0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.02g/L。
所述的后处理是加入填充剂、保护剂和分散剂后再进行干燥、粉粹。
所述的填充剂为沸石粉、膨润土、高岭土、稻壳粉、甘蔗渣、秸杆渣、白碳黑中的一种或几种，优选为稻壳粉、秸杆渣、甘蔗渣，用量为100～200g/L发酵液。
所述的保护剂为黄原胶、明胶、甘油、海藻糖中的一种或几种，用量为1～5g/L发酵液。
所述的分散剂为木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠中的一种或几种，用量为1～5g/L。
所述的干燥方法为喷雾干燥、闪蒸、烘干、晒干中的一种或几种，干燥温度不高于80℃。
为了提高烟草产量，同时在烟草种植过程中降低化肥和农药的使用，减少环境污染。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的烟草促生长生物菌剂是利用淡紫紫孢菌BPT05进行发酵和后处理制备而成，属于微生物类发酵产品，环境友好，对土壤和环境无污染。
本发明提供的烟草促生长生物菌剂的发酵方法是液体发酵，有利于促生长代谢物质的积累。在后处理过程中加入填充剂、保护剂和分散剂干燥而成，便于保存与运输，使用方便，活性稳定。
本发明提供的烟草促生长生物菌剂能有效改善烟草农艺性状，提高烟草产量。
该菌株在生长代谢过程产生对植物生长有促进作用的物质，特别是对烟草的生长有显著的促进作用。利用该菌株进行液体发酵，然后对发酵产物进行后处理，可制备成烟草促生长生物菌剂，该烟草促生长生物菌剂便于保存与运输，使用方便，活性稳定，能有效改善烟草农艺性状，提高烟草产量；且环境友好，对土壤和环境无污染，对实现农业可持续发展具有重要意义。
附图说明
图1是淡紫紫孢菌BPT05在PDA平板上菌落形态。
图2是淡紫紫孢菌BPT05分生孢子的显微镜检结果。
图3是构建的淡紫紫孢菌BPT05的***进化树。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中用到的云烟87、粤烟97均由市场购得。
实施例1
种子培养基：蔗糖30g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4·7H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水。
发酵培养基：蔗糖30g/L，黄豆粉4g/L，K2HPO4·7H2O 3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0。
接种活化的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05保藏号为GDMCC NO：60178于种子培养基，28℃，180r/min摇床培养24h得到种子液，然后按10％(v/v)接种量接种到发酵培养基，28～32℃，200r/min摇床发酵培养96h，取发酵液稀释20倍，以稀释20倍的发酵培养基作为对照，试验种子为云烟87包衣种子，参照GB/T 3543.4-1995进行发芽试验，结果见表1，从表1可以看出，发酵液组茎长显著长于空白对照组(P<0.05)，其他无明显差异，说明淡紫紫孢菌BPT05发酵液对烟草种子的发芽有显著促进作用。
表1淡紫紫孢菌BPT05对云烟87种子发芽的影响
试验组别 根长(mm) 茎长(mm) 发芽率
对照组 4.79±0.55 8.46±1.36 85％
发酵液组 4.54±0.34 11.07±0.53 90％
实施例2
种子培养基：蔗糖30g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4·7H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水。
发酵培养基：蔗糖25g/L，粉碎的麸皮5g/L，NaNO3 1g/L，K2HPO4·7H2O 4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水，pH 7.5。
发酵：接种活化的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05保藏号为GDMCC NO：60178于种子培养基，28℃，200r/min摇床培养24h得到种子液，然后按10％(v/v)接种量接种到发酵培养基，发酵温度30℃，通气1.0vvm，搅拌速度300r/min，发酵96h，收获发酵液。
后处理：每升发酵液中分别加入稻壳粉200g，白碳黑50g，黄原胶5g，柠檬酸钠1g，搅拌混和30min，晒干粉碎，制得水分小于10％的烟草促生长生物菌剂。
实施例3
种子培养基：蔗糖30g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4·7H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水。
发酵培养基：蔗糖30g/L，玉米粉5g/L，K2HPO4·7H2O 4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水，pH 7.2。
发酵：接种活化的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05保藏号为GDMCC NO：60178于种子培养基，28℃，200r/min摇床培养24h得到种子液，然后按10％(v/v)接种量接种到发酵培养基，发酵温度28℃，通气0.8vvm，搅拌速度300r/min，发酵72h，收获发酵液。
后处理：每升发酵液中分别加入粉碎的甘蔗渣200g，甘油5g，柠檬酸钠1g，搅拌混和30min，滚筒干燥，制得水分小于10％的烟草促生长生物菌剂。
实施例4
烟草漂浮盘育苗：分别取实施例2制备的2g和5g烟草促生长生物菌剂与100g烟草育苗基质比例充分混和均匀，试验种子为云烟87，以不加烟草促生长生物菌剂作为对照，进行漂浮盘育苗60d，育苗统计结果见表2。从表2可以看出，加入制备好的烟草促生长生物菌剂组与空白对照进行比较，烟草在株高、茎围、最大叶面积和茎干重均有显著增加(P<0.05)。
表2烟草促生长生物菌剂对烟草育苗农艺性状的影响
Figure BDA0001408884740000051
实施例5
试验地：广东南雄古市镇。
烟草品种：粤烟97。
烟苗移栽时，每株根部分别施用5g和10g实施例3制备好的烟草促生长生物菌剂，以不施用生物菌剂组作为对照，其他按正常方式管理，烟草总产量分别提高了8.57％和18.04％最终产量见表3。
表3施用烟草促生长生物菌剂对烟草产量的影响
试验组别 上等烟产量(kg/亩) 总产量(kg/亩)
对照组 41.06 110.93
5g组 54.69 120.44
10g组 58.31 130.94
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州市博仕奥生物科技有限公司
<120> 一株淡紫紫孢菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggggattct acctgatccg aggtcactct aagaaagttg ggcgttttac ggcgtgaccg 60
cctccgcgct ccggtgcgag gtgtgtgcta ctacgcaggg gaggctgcgg cggggtcgcc 120
actgcatttc gggggcggct ggtgtgccgt cccccaacac cgaggccccc gggggggctc 180
gagggttgaa atgacgctcg aacaggcatg cccgccagaa tgctggcggg cgcaatgtgc 240
gttcaaagat tcgatgattc acc 263
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaatcatc gaatctttga ac 22

Claims (9)

1.一株淡紫紫孢菌，其特征在于：名称为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05，于2017年05月09日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60178。
2.权利要求1所述的淡紫紫孢菌在促进烟草生长中的应用。
3.一种烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
利用权利要求1所述的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)BPT05进行液体发酵，对发酵液进行后处理得到烟草促生长生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的液体发酵生产方法为：从活化的淡紫紫孢菌BPT05菌种斜面挑取1～2环菌种接种到种子培养基，28～32℃，180～200r/min摇床培养24～36h得到种子液，然后按5％～10％接种量接种到发酵培养基，摇瓶发酵条件为：28～32℃，180～200r/min发酵72～96h；发酵罐培养条件为温度28～32℃，搅拌速度150～400r/min发酵72～96h，通气量0.5～1.0vvm，pH 6.5～7.5，罐压0.01～0.03Mpa；
所述的种子培养基的成份及含量为：蔗糖30g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4·7H2O1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，溶剂为水；
所述的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐；发酵培养基初始pH 6.5～7.5；所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉类水解液中的一种或几种，用量为20～40g/L；所述的氮源为玉米粉、黄豆粉、麸皮、NaNO3、NH4NO3中的一种或几种，用量为3～5g/L；所述的无机盐为K2HPO4·7H2O2～4g/L，MgSO4·7H2O 0.2～0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.02g/L。
5.根据权利要求4所述的烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的后处理是加入填充剂、保护剂和分散剂后再进行干燥、粉粹。
6.根据权利要求5所述的烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的填充剂为沸石粉、膨润土、高岭土、稻壳粉、甘蔗渣、秸杆渣、白碳黑中的一种或几种，用量为100～200g/L发酵液。
7.根据权利要求5所述的烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的保护剂为黄原胶、明胶、甘油、海藻糖中的一种或几种，用量为1～5g/L发酵液。
8.根据权利要求5所述的烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的分散剂为木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠中的一种或几种，用量为1～5g/L。
9.根据权利要求5所述的烟草促生长生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的干燥方法为喷雾干燥、闪蒸、烘干、晒干中的一种或几种，干燥温度不高于80℃。
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