CN103619873A - Tfeb变体及其应用 - Google Patents

Tfeb变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103619873A
CN103619873A CN201280012155.6A CN201280012155A CN103619873A CN 103619873 A CN103619873 A CN 103619873A CN 201280012155 A CN201280012155 A CN 201280012155A CN 103619873 A CN103619873 A CN 103619873A
Authority
CN
China
Prior art keywords
disease
type
tfeb
sick
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280012155.6A
Other languages
English (en)
Inventor
C·塞滕布里
A·巴拉比奥
D·L·梅迪纳萨纳巴里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fondazione Telethon
Original Assignee
Fondazione Telethon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondazione Telethon filed Critical Fondazione Telethon
Publication of CN103619873A publication Critical patent/CN103619873A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5386—1,4-Oxazines, e.g. morpholine spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans

Abstract

本发明涉及组成型定位在真核细胞核内的TFEB相关分子，如变体、突变体、截短蛋白、嵌合体等。这类分子在需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体***的所有疾病中具有治疗应用性，所述疾病例如溶酶体贮积症、神经变性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。

Description

TFEB变体及其应用
技术领域
本发明涉及组成型定位在真核细胞核内的TFEB相关分子，如变体、突变体、截短蛋白、嵌合体等。这类分子在需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体***的所有疾病中具有治疗应用性，所述疾病例如溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
背景和现有技术
自体吞噬是一种分解代谢过程，依赖于自噬体和溶酶体这两种不同类型细胞器的协同作用(1)。饥饿期间，细胞扩张这两种细胞区室（compartment）以促进降解和再循环过程。
所述溶酶体维持细胞内稳态并调节多种生理过程，包含细胞清除、脂质内稳态、能量代谢、质体膜修复、骨重塑和抵御病原体。所有这些过程需要溶酶体对环境信号的适应性且动态的反应。确实，生理信号（例如衰老和饥饿）和病理病症（包含溶酶体贮积症(LSD)、神经退行性疾病、损伤和感染）可以产生所述溶酶体的适应性反应(34、35、36)。
对调解溶酶体功能的机制和溶酶体适应的基本机制的理解仍然处在初始阶段。调解溶酶体生物发生的主要作用物是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)亮氨酸拉链转录因子－TFEB(2)。已确定的TFEB转录靶标有参与底物降解的溶酶体水解酶，调解溶酶体与其他细胞结构相互作用的溶酶体膜蛋白，和参与溶酶体酸化的液泡H+-ATP酶(vATP酶)复合物的组件(37,2)。
WO2010/092112涉及能增强作用于所谓清除元件（CLEAR element）上的细胞降解通路的分子；其中列有TFEB。
发明内容
本申请人显示了在饥饿期间，细胞活化能控制自体吞噬通路的主要步骤的转录程序，所述步骤包含自噬体形成、自噬体－溶酶体融合和底物降解。所述转录因子EB(TFEB)此前已鉴定为溶酶体生物发生的主要基因（2），该转录因子通过驱动自体吞噬和溶酶体基因的表达来调整这种转录程序。
本申请人发现TFEB的核定位和活性由特异性丝氨酸磷酸化来调节。与饥饿相似，基于药理或基因突变对特异性磷酸化的抑制通过活化TFEB来诱导自体吞噬。这些数据公开了通过控制两种协同细胞器的生物发生和合作而参与调节溶酶体－自体吞噬通路的一种新的激酶依赖性机制。
因此，本发明的一个目标是组成型定位在真核细胞核内的TFEB变体蛋白。本发明所述TFEB变体蛋白包含丝氨酸残基的取代或改变以使其对磷酸化不敏感。本领域普通技术人员会识别能进行除了酪氨酸以外的其他氨基酸取代以使所述TFEB变体对磷酸化不敏感。例如，丝氨酸残基能取代为天然氨基酸，例如中性氨基酸如丙氨酸，或非天然氨基酸。组成型定位在真核细胞核内的TFEB变体蛋白包含TFEB的突变体、截短蛋白、嵌合体。
在优选的实施方式中，所述TFEB变体蛋白由Seq.Id No.2所含的氨基酸序列组成，并且其中丝氨酸残基的取代在Seq.Id No.2的SER142和/或SER211处。优选Seq.Id No.2所含的氨基酸序列是氨基酸117－氨基酸166，并且丝氨酸残基的取代是在Seq.Id No.2的SER142处(Seq Id No.4)。或者，所述氨基酸序列实质上由Seq.Id No.2组成，并且丝氨酸残基的取代是在SER142和/或SER211处。在最优选实施方式中，Seq.Id.No.2的SER142和/或SER211处由ALA取代。
本发明的另一个目标是供医学应用的上述TFEB变体蛋白的。
上述TFEB变体蛋白用于治疗需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体***的疾病中具有优势，其优选用于治疗任意下列病变：溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
溶酶体贮积症的示例有：激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积病、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯（Farber）病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、高歇（Gaucher）病(包含I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积病(包含婴儿型、晚婴型/少年型、成年型/慢性)、I细胞疾病/黏脂沉积症II型、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(包含婴儿发病、迟发性)、异染性脑白质营养不良、假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积症IIIA型、MPS I型贺勒综合征、MPS I型施艾氏综合征、MPS I型贺勒氏-施艾氏综合征、MPS II型亨特综合征、A型沙费利波综合征/MPS IIIA型、B型沙费利波综合征/MPSIIIB型、A型莫奎欧氏症/MPS IVA型、B型莫奎欧氏症/MPS IVB型、MPS IX型透明质酸酶缺乏症、尼曼-匹克氏（Niemann-Pick）病(包含A型、B型和C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积病(包含CLN6病、非典型晚婴型、迟发型变异、幼年(earlyjuvenile)巴-斯-沃三氏（Baten-Spielmeyer-Vogt）/少年型NCL/CLN3病、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏（Jansky-Bielschowsky）病/晚婴型CLN2/TPP1病、Kufs/成年发病型NCL/CLN4病、北方癫痫/异晚婴型CLN8和神经元蜡样脂褐质沉积症(Santavuori-Haltia)/婴儿型CLN1/PPT病)、β-甘露糖苷贮积症、庞培氏病/II型糖原贮积病、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病型/GM2神经节苷脂累积病、婴幼儿山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病、青少年山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴(Tay-Sachs)/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、多发性硫酸酯酶缺乏症。
肝病的示例有：α1抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
肌肉疾病的示例有：自体吞噬液泡肌病和过度自噬X连锁肌病。
代谢疾病的示例有：高胆固醇血症和脂肪肝病。
神经退行性疾病的示例有：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特-雅各布病和脊髓性小脑萎缩症。
本发明的另一个目标是包含上述TFEB突变蛋白的编码序列的核酸。优选所述核酸包含Seq.Id No.3的序列。
本发明的另一个目标是于适当调节序列下包含上述核酸的表达载体。
本发明所述表达载体对用于基因治疗是有利的。
本发明的另一个目标是提高离体培养细胞中内源或重组溶酶体酶的产量的方法，所述方法包含以下步骤：–将所述核酸或上述表达载体导入所述细胞，和–使所编码的TFEB变体蛋白得以表达。
本发明的另一个目标是通过给予对象以治疗有效量的上述TFEB变体蛋白来治疗疾病的方法，优选当所述疾病通过诱导细胞自体吞噬/溶酶体***得以缓解时。
更优选所述疾病选自：溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。上文提供了这些疾病的示例。
附图说明
图1：TFEB诱导自体吞噬。(A)稳定过量表达TFEB的HeLa细胞用GFP-LC3质粒转染，并且如图示来处理。各实验分析大约100个细胞，均一式三份。图显示了GFP阳性囊泡的定量。(B-F)在TFEB-3xflag稳定过量表达(+)和对照细胞(-)中LC3的Western印迹分析(B)。图表示使用imageJ软件对三个独立印迹分析LC3II表达(相对于肌动蛋白)的定量；(C)血清和氨基酸饥饿(Starv)了指定时间(h=小时)的TFEB稳定过量表达细胞，(D-F)从(D)正常培养基、(E)饥饿培养基或者(F)补充有巴伐洛霉素的饥饿培养基(4h;400nM)中培养的TFEB-RNAi和用乱序RNAi(对照（ctr）)处理的对照细胞中分离的细胞裂解液。图表示三个独立印迹中LC3II表达(相对于肌动蛋白)的定量，并且条带强度使用imageJ软件分析定量。(G)TFEB mRNA水平通过qPCR分析，所用cDNA从转染了靶定TFEB的3种不同siRNA寡核苷酸(寡核苷酸#1、#2、#3)或者乱序siRNA寡核苷酸(ctr)的细胞中制备。(H)用空(对照)或TFEB载体转染的、稳定表达GFP-mRFP-LC3的HeLa细胞固定的代表性共聚焦照片。最少计数2000个细胞，并且所述值表示获自三个独立实验的囊泡的平均数值(相对于对照，%)。AL(自噬溶酶体)=mRFP阳性/GFP阴性囊泡；总体：mRFP阳性囊泡。(所有误差线代表标准偏差。T检验(未配对)p值(*)<0.05,(**)<0.01)
图2：饥饿调节TFEB的核移位和活性。(A)散点图显示不同条件下培养的HeLa细胞中51个自体吞噬相关基因的相对表达水平中倍数变化差异的对数值。X轴=对照组。Y轴=处理组。圆圈表示有增加(红色)或降低(绿色)倍数变化的基因。如指示进行比较。(B)染色质免疫沉淀(ChIP)分析。柱状图显示由qPCR试验测得的免疫沉淀的DNA的量。数值相对进样来标准化，并且以对模拟对照的相对富集作图。实验进行一式三份。(C)正常、饥饿和TFEB-siRNA饥饿细胞中TFEB靶标基因表达的qPCR分析。GAPDH和HPRT表示持家基因，而ATG10、ATG9A和ATG4D表示对照基因(非TFEB靶标基因)。(D-F)稳定过量表达TFEB的HeLa细胞保持不处理或者营养饥饿4小时。(D)就TFEB核定位分析各包含50-100个细胞的5个区域。P值(*)=<0.01。(E)细胞进行核/胞质分级分离，并用Flag抗体印迹。H3和微管蛋白分别用作核和胞质的标记。(F)核部分用Flag和H3(加样对照)抗体印迹。(G)核提取物中Flag、微管蛋白和H3的Western印迹分析，所述核提取物从正常、饥饿和饥饿/正常培养基刺激1小时(正常)或者培养基刺激前用AP-2(AKT抑制剂)、雷帕霉素(mTOR抑制剂)和U0126(MEK抑制剂)预处理1小时的细胞中制备。总提取物用于确证抑制剂的效率。(H)用组成型活性MEK(caMEK)质粒或用空载体转染的TFEBsiRNA或TFEB乱序对照细胞中溶酶体和自体吞噬基因的qPCR分析。如图所示进行饥饿。(所有误差线代表标准偏差。T检验(未配对)p值(*)<0.05,(**)<0.01)
图3：丝氨酸磷酸化调节TFEB活性。(A)在表达突变形式TFEB-3xFlag的HeLa细胞中的TFEB亚细胞定位，用Flag抗体免疫染色。分析来自三个独立实验的各自包含50-100个细胞的5个区域。(B)对空、正常和突变TFEB质粒转染后24小时TFEB靶标基因表达的qPCR分析。(C,D)蛋白提取物中LC3II(C)和Lamp1(D)的Western印迹分析，蛋白提取物来自以等量空(pcDNA)、TFEB-3xFlag或TFEBS142A-3xFlag载体转染的HeLa细胞。如图所示加入巴伐洛霉素。实验进行一式三份，并且对肌动蛋白水平来标准化蛋白水平的定量。(E)稳定表达GFP-mRFP-LC3并用pcDNA、Tfeb或Ser-Tfeb转染24小时的HeLa细胞中的自噬溶酶体分析(AL=RFP阳性/GFP阴性)。如图1H所述定量。(F)用抗Erk抗体对HeLa细胞的Western印迹分析，所述HeLa细胞用HA-Erk2和/或TFEB-3xFlag转染、在全血清中维持或营养饥饿中保持4小时，以及用抗Flag抗体免疫沉淀。裂解液用抗FLAG免疫沉淀，并且用抗Erk抗体印迹。(G)体外激酶试验。在ATP-γ32P以及TFEB蛋白的氨基酸120–170的肽(TFEB-S-142)或丝氨酸142被丙氨酸取代的相似肽(TFEB-A-142)存在下孵育重组激酶。以所述肽整合放射性的量来测量磷酸化效率(“磷酸化灵敏度”)。(H)过量表达TFEB的HeLa稳定克隆用ERK1/2特异性siRNA寡核苷酸或者对照siRNA转染。48h后，细胞在不处理、血清饥饿或者血清和氨基酸(a.a.)饥饿下保持4小时，收集并进行核分离和Flag免疫印迹。总裂解液用ERK抗体探测。所有误差线代表标准偏差。P值(*)=<0.05。
图4：TFEB介导的自体吞噬诱导的体内分析。(A)在进食、16小时禁食和24小时禁食的小鼠中GFP阳性囊泡的免疫荧光分析。图中显示囊泡的定量。(B)来自进食和禁食动物的肝样品中TFEB靶标基因表达的qPCR分析(n=3;误差线代表标准偏差。p值(*)<0.05)。Gapdh和Hprt用作参比基因。(C,D)在用AAV2/9Tcfeb-HA感染并且处死前禁食16小时的2月龄野生型小鼠中TFEB亚细胞定位的分析。(C)HA免疫荧光分析。图显示了核HA信号的定量。对各个肝计数100个转导的细胞。n=3只小鼠/组。*=<0.001。(D)在进行核分级分离的肝样品中的HA、微管蛋白和H3的Western印迹分析。总的肝裂解液用HA抗体探测以确证进食和禁食动物中相似的转基因表达。(E)注射有AAV2/9Tcfeb-HA的小鼠的肝提取物中LC3、肌动蛋白、p-ERK1/2和ERK1/2的Western印迹分析。(F)来自2月龄GFP-LC3转基因小鼠的冻存肝切片中GFP Western印迹分析和DAPI染色，所述转基因小鼠注射有AAV-Tcfeb-HA或盐水溶液(对照组)，并且在处死前自由进食或禁食24小时。图中显示了GFP阳性囊泡的定量。(G)分离自条件型Tcfeb-3xFLAG转基因小鼠(Tcfeb-3xflag;AlbCRE)的肝样品中自体吞噬和溶酶体TFEB靶标基因表达的qPCR分析，其中转基因表达由肝特异性CRE重组酶(即白蛋白-CRE)驱动。(H)来自Alb-CRE、Tcfeb-3xFlag和Tcfeb-3xFlag;Alb-CRE小鼠的肝蛋白提取物中LC3和肌动蛋白的Western印迹分析。
图5：TFEB瞬时过量表达诱导自体吞噬。(A)HeLa细胞瞬时转染有编码带flag标签的TFEB蛋白的质粒。转染后48小时，细胞收集、裂解，并且对10mg蛋白样品分析LC3、Flag和肌动蛋白免疫反应性。实验进行一式三份，并且使用imageJ软件分析定量条带强度。(误差线代表标准偏差。p值(*)<0.05)(B)COS-7细胞瞬时转染有空载体或TFEB-3xFlag载体。24小时后，细胞用溶酶体抑制剂(抑胃酶肽/E64,10μg/ml，西格玛公司(SIGMA))处理4小时。10μg细胞裂解液用于LC3和肌动蛋白免疫印迹。
图6：在TcFEB过量表达型MEF中诱导自体吞噬。(A,B)用表达TcFEB的慢病毒感染的MEF和对照细胞的电子显微图。(a)TcFEB表达后观察到的自体吞噬结构，其包含自噬体(AV)和自噬溶酶体(AL)。(B)早期自噬体的形成。电子密集细胞质材料周围的膜分离（箭头）。(C)自体吞噬结构(AV和AL)数目和(D)早期自噬体数目的定量。至少分析30个细胞/组。误差线表示SEM;p值(*)<0.05;(***)<0.0001。
图7：TFEB促进自噬体形成。(A)对照和稳定过量表达TFEB的细胞用巴伐洛霉素(baf;12小时400nM)处理，收集并且用于LC3II、Flag和肌动蛋白免疫印迹。(B)对照和稳定过量表达TFEB的细胞保持不处理或用10μg/ml溶酶体抑制剂抑胃酶肽/E64处理4小时，裂解并且用于LC3、Flag和肌动蛋白免疫印迹。实验进行一式三份，并且使用imageJ软件分析定量带强度。(误差线代表标准偏差。p值(*)<0.05)
图8：TFEB增强溶酶体蛋白水解。在正常或饥饿条件下，TFEB过量表达、TFEB枯竭和对照细胞中长寿命蛋白降解的速率。如图所示加入3-甲基腺嘌呤(3MA)。(误差线代表标准偏差。p值(*)<0.05)
图9：自体吞噬基因亚组的启动子区域中TFEB推定的结合元件的分布。数字指示结合元件距离转录起始位点(TSS)的距离。
图10：饥饿增强TFEB活性。萤光素酶报导试验使用载有四个TFEB结合位点串联拷贝的构建物。正常和TFEB过量表达的HeLa细胞转染有含TFEB结合位点的人工启动子。在饥饿条件下培养时，两种细胞类型都显示增强的反式激活潜能。(误差线代表标准偏差p(*)<0.05)
图11：饥饿通过MAPK诱导TFEB的核移位。(A)饥饿诱导胞质TFEB迁移率改变和核移位。正常培养基；饥饿培养基(4小时)；饥饿+正常，表示细胞在饥饿培养基中培养(4小时)，再补充正常培养基培养1小时然后收集。胞质和核部分用于Flag免疫印迹。(B)如图2G所示处理的HeLa细胞中通过免疫荧光分析TFEB细胞定位。图显示呈现TFEB核定位的细胞的百分比。误差线代表标准偏差。P值(*)=<0.05。
图12：TFEB核移位依赖于S142磷酸化。(A)表达TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag、S332-3xFlag或S423-3xFlag蛋白的HeLa细胞用于核蛋白分离。等量的核蛋白用丽春红染色确证。(B)在正常和饥饿条件下，表达TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag和S142D-3xFlag蛋白的HeLa细胞用于核蛋白分离。(C)从表达TFEB-3xFlag和TFEB-S142A-3xFlag的HeLa细胞分离的胞质蛋白的Flag免疫印迹显示在正常培养基中S142A以相比野生型（WT）TFEB较低分子量的条带迁移，而在饥饿条件下这种变化不再明显。(D)从表达TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag和S142D-3xFlag的受饥饿HeLa细胞分离的胞质蛋白的Flag免疫印迹显示TFEB-S142D的变化减弱。
图13：S142A TFEB突变显示活性增强。稳定过量表达GFP-LC3的HeLa细胞转染以等量的空、TFEB-3xFlag或S142A-TFEB-3xFlag质粒，并且定量自噬体数。各点分析至少10个区域(包含4-10细胞)。实验进行一式三份。误差线代表标准偏差。p值(*)<0.05。
图14：与TFEB旁系同源物（paralogue）、MITF和相关TFEB有关家族成员的TFEB-人（human）S142磷酸化位点的多序列比对。通过对ExPASy蛋白组学服务器上的UniProtKB数据库的BLAST检索(2.2.17)鉴定出TFEB_human同源物。申请人去除带有关键词“推定”、“未鉴定”和“cDNA”的记录以及没有基因名称的记录。下一步，发明人用ClustalW(1.82)比对剩余的同源物。由Seaview生成多个序列的比对。图仅显示TFEB_HUMAN序列中长20个氨基酸的片段与来自TFEB、MITF、TCFEB、TFE3和TCFE3家族的其他蛋白的比对。“sp”表示SwissProt条目，而“tr”表示Tremble条目。P19484是UniProrKB登录代码。TFEB_HUMAN分别表示基因名称和物种名称。
图15：体内TcFEB过量表达的策略。(A)用抗HA抗体免疫染色的冻存肝切片的代表性图片(以确证病毒转导效率)。(B)来自Tcfeb-HA注射小鼠和对照小鼠的肝蛋白提取物用HA和肌动蛋白抗体免疫印迹。(C)生成TcFEB条件型过量表达的转基因小鼠系。顶部显示CRE重组酶之前和之后的转基因载体图。左侧显示同窝幼畜的代表性基因型，而右侧显示小鼠n4中相应的肝特异性TFEB过量表达。
图16：TFEB过量表达增加MEF、NSC、HeLa和COS-7细胞的培养基中溶酶体酶的释放。在培养基和转染有空载体或TFEB表达载体的细胞中测定溶酶体酶酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和β-己糖胺酶的活性。根据生产商方案，使用PolyFect转染试剂(凯杰公司(Qiagen))或Lipofectamine2000试剂(英杰公司(Invitrogen))转染HeLa、Cos7细胞和来自小鼠模型MLIV(S7)、MPSIIIA(S7)和MSD的小鼠胚胎成纤维细胞。TFEB-3xFLAG HeLa稳定细胞系(CF7)已有描述(2)。图显示释放的酶活性相较总活性的百分比。
图17：TFEB正向控制溶酶体的胞吐。MPSIIIA MEF细胞维持在补充有10%FBS和青霉素/链霉素(正常培养基)的DMEM中。根据生产商方法，亚融合细胞使用LipofectamineTM2000(英杰公司)转染。使用编码带标签硫酸胺酶(SGSH3XFlag)的质粒和空质粒或编码TFEB的质粒共转染MPS-IIIA MEF。转染后一天，培养基置换为DMEM0.5%FBS。转染后两天，收集条件培养基和球团用于硫酸胺酶活性测量，并且计算酶释放到培养基中的百分比。
图18：溶酶体应激诱导TFEB核移位。免疫印迹：经氯喹(CQ)或水杨酰胺A(Salicylihalamide A，SalA)处理的表达TFEB–3 x Flag的HeLa细胞中提取的蛋白用于核/胞质分级分离并用FLAG抗体印迹以检测TFEB。组蛋白3（H3）和微管蛋白分别用作核和胞质的标记。印迹是三个平行实验的代表。
图19：mTORC1调节TFEB。(A)溶酶体应激抑制mTOR信号转导。如图示，处理过夜的HeLa细胞中分离的蛋白提取物的免疫印迹。膜用p-T202/Y204-ERK1/2、ERK1/2、p-T389-S6K和S6K的抗体探测以测量ERK和mTORC1活性。(B)Torin1诱导TFEB去磷酸化和核移位。从经无氨基酸培养基中培养并且如图示后续刺激至少3小时的TFEB–3 x FLAG HeLa细胞分离的胞质和核部分的FLAG免疫印迹。用H3和微管蛋白抗体确证正确的亚细胞分级分离。(C,D)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核移位的影响和剂量反应曲线。TFEB–GFP HeLa细胞接种入384孔板，培养12小时，并用2.54nM-50μM范围内10种不同浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin1和Torin2处理。37℃下在包含各个化合物的RPMI培养基中保持3小时后，细胞洗涤、固定，再用DAPI染色，并用共聚焦自动显微镜(Opera高内涵***，帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))照相。(C)各化合物测试浓度的代表性图片。比例尺代表30μm。(D)图显示各化合物的10个不同浓度(以浓度的对数显示)下核移位的百分比。使用Prism软件计算各化合物的EC50(详见材料和方法)。(E)氨基酸诱导TFEB分子量变化。从HEK-293T细胞分离的蛋白提取物的免疫印迹，所述HEK-293T细胞转染有TFEB-3XFLAG或空载体，经营养饥饿和用氨基酸(a.a.)刺激50分钟。所用抗体是p-T389-S6K、S6K和FLAG。(F)Rag敲减诱导TFEB核移位。稳定表达Flag–3 x TFEB的HeLa细胞用编码短发夹(Sh-)RNA的慢病毒感染，所编码的Sh-RNA靶定萤光素酶（对照）或者RagC和RagD mRNA。转染96h后，细胞保持不处理(N=正常培养基)、饥饿(S=饥饿培养基)或者用Torin1(T=Torin1)处理4小时，然后用于核/胞质分级分离。用FLAG抗体检测TFEB定位，而微管蛋白和H3分别用作胞质和核部分的对照；S6K磷酸化水平用于检测RagC和RagD敲减效率。(G)mTORC2不影响TFEB磷酸化。从Sin1-/-或对照胚胎(E14.5)分离的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用编码TFEB–3 x FLAG的逆转录病毒感染；感染后48小时，细胞如图示用Torin1(T)处理4小时，用于核/胞质分级分离并且用FLAG、微管蛋白和H3免疫印迹。
图20：mTORC1在丝氨酸142(S142)处磷酸化TFEB。(A)Torin1诱导S142去磷酸化。如图示处理HeLa细胞，并将总提取物和核提取物用TFEB p-S142磷酸化抗体和抗FLAG抗体探测。(B)TFEB蛋白结构示意图显示预测的mTORC1磷酸化位点和它们在脊椎动物中的保守性。根据人同种型1编号。(C)所述磷酸化位点的序列保守性评分，以及mTOR共有基序和TFEB磷酸化位点附近序列之间的定量一致性。(D)S142和S211调节TFEB定位。表达丝氨酸-向-丙氨酸突变形式TFEB–3 x Flag的HeLa细胞中TFEB亚细胞定位的Flag免疫染色。核用DAPI进行染色。数值是包含至少50个转染细胞的五个区域的平均。学生t检验(未配对)***P<0.001。比例尺代表30μm。
图21：溶酶体通过TFEB调节基因表达。(A)氯奎处理抑制原代肝细胞中mTORC1的活性。从2月龄Tcfebflox/flox(对照)和Tcfebflox/flox;Alb-Cre(Tcfeb-/-)小鼠分离的原代肝细胞保持不处理或用Torin1、U0126或氯奎处理过夜。随后，细胞裂解，并且蛋白提取物用图示抗体免疫印迹。(B,C)TFEB调节对氯奎和Torin1的转录反应。来自对照(flox/flox)和Tcfeb-/-(flox/flox;alb-Cre)小鼠的原代肝细胞中TFEB靶标基因的定量PCR(qPCR)。细胞用氯奎(左)和Torin1(右)处理。表达水平显示为所述经处理对比相应未处理样品的表达增加%。数值表示三个独立的肝细胞制备(三只小鼠/基因型)的平均值±s.d.。学生t检验(双尾)*P值≤0.05。
材料和方法
细胞培养、培养基、药物和细胞处理HeLa和COS以及HEK-293T细胞购自ATCC。细胞在下列培养基中培养：(正常)补充有10%FBS的DMEM高葡萄糖；(饥饿)补充有10mM HEPES、有Ca和Mg的HBSS培养基；(血清)补充有20%FBS的EBSS；(氨基酸培养基)无葡萄糖和无血清DMEM；药物处理：雷帕霉素(2.5mg/ml,西格玛公司(SIGMA))2-4小时，除非另有说明；巴伐洛霉素(400nM,西格玛公司)2-4小时；胰岛素(100ng/ml西格玛公司)2小时；EGF、FGF(BD生物科学公司(BDbiosciences))；LIF(100ng/ml;ESGRO,密理博公司(Millipore))2小时；PMA(1μg/ml)2小时。U0126(MEKi)于25mM(细胞信号转导公司(Cell Signaling))使用，API2(AKT抑制剂)于1mM使用。溶酶体抑制剂是抑胃酶肽和E64(10mg/ml4小时西格玛公司)。在图18-2的实验中使用下列药物：西格玛公司的雷帕霉素(2.5μM5μM,除非另有说明)；TOCRIS公司的Torin1(250nM250nM，除非另有说明);细胞信号转导技术公司(Cell Signaling technology)的U0126(50μM50μM)；西格玛公司的氯奎(100μM100μM)；Jeff De Brabander(德克萨斯大学西南医学中心(UT Southwestern))友情馈赠的水杨酰胺A(2μM2μM)。
如下述生成原代肝细胞：2月龄小鼠用阿佛丁(240mg/kg)深度麻醉，并首先用补充有10mM HEPES和0.5mM EGTA的25ml HBSS(西格玛公司H6648)的灌注，然后用包含100U/ml胶原酶(Wako公司)和0.05mg/ml胰蛋白酶抑制剂(西格玛公司)的相似溶液灌注。肝在皮氏培养皿中分离，细胞球团在HBSS中洗涤，并且以浓度5x105细胞/35mm涂板，并在补充有10%FBS、2mM谷胺酰胺、0.1mM胰岛素、0.1mM***和青霉素/链霉素的威廉姆斯E培养基中培养。第二天，如本文所述处理细胞。Sin1-/-和对照MEF如原先所述(46)生成，并且维持在补充有10%FBS、谷胺酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中。
生成Tcfebflox小鼠系
申请人使用公共可得的胚胎干细胞(ES)克隆(http://www.eucomm.org/)，其中通过同源重组靶定Tcfeb外显子4和5处。重组ES细胞克隆注射入胚泡中，胚泡用于生成载有工程改造等位基因的小鼠系。肝特异性KO通过杂交Flox/Flox小鼠与在白蛋白启动子下表达CRE的转基因系(ALB-CRE)而生成，所述转基因系获自杰克逊实验室(Jackson laboratory)。所有涉及小鼠的方法得到贝勒医学院动物护理和使用委员会的批准。
转染、质粒和siRNA
质粒和siRNA都用Lipofectamine LTX(英杰公司)利用反向转染方法来转染。经siRNA转染的细胞于48或72小时后收集。siRNA TFEB在50nM(达马可公司(Dharmacon))下使用，siRNA ERK1/2在100nM(细胞信号转导公司)下使用。
根据生产商方法使用Lipofectamine2000或LTX(英杰公司)，用DNA质粒pRK5-mycPAT1、pCEP4-TFEB-his、pC1G2-TFEB和p3 x FLAG-CMVTFEB瞬时转染细胞。定位突变根据生产商(司查塔基公司(Stratagene))指示进行，通过测序证实正确的突变。
Western印迹
细胞或组织溶解在补充有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(ROCHE))和磷酸酶抑制剂(西格玛公司)的RIPA缓冲液中。加载10-30微克到4-12%Bis-Tris凝胶(NUPAGE，英杰公司)，转移到PVDF膜，并且使用ECL方法(皮尔斯公司(Pierce))通过western印迹分析。使用以下抗体：LC3(诺复斯生物制品公司)、FLAG、b-肌动蛋白、微管蛋白(西格玛公司)、HA(科文斯公司(Covance))、H3、ERK1/2、p-ERK1/2、p-AKT、p-70S6K(细胞信号转导公司)、ERK2(圣克鲁兹公司(Santa Cruz))。蛋白水平使用ImageJ软件分析定量。
核/胞质分级分离
细胞以50%融合接种入6孔板，并且血清饥饿过夜(ON)。第二天在DMSO或激酶抑制剂存在下加入正常培养基。如原先所报导进行亚细胞分级分离。简单说，细胞在0.5曲通X-100裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5%曲通、137.5mM NaCl、10%甘油、5mM EDTA，补充有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中裂解。上清液代表胞质部分，而核球团洗涤两次，并在0.5曲通X-100缓冲液0.5%SDS中裂解并超声处理。
长寿命蛋白的降解
亚融合细胞用L-U14C-丝氨酸培养20小时，并且用冷培养基追踪1小时以降解短寿命蛋白。随后细胞用正常培养基或饥饿培养基(最终存在3-MA)培养4小时。长寿命蛋白的降解速率用培养基中的溶解放射性与可酸性沉淀的细胞球团中的不溶放射性的比率来计算。
RNA提取、逆转录、ChIP和定量PCR
使用TRIzol(英杰公司)从组织中提取或者使用RNAesy柱(凯杰公司)从细胞中提取总RNA。使用TaqMan逆转录试剂(应用生物***公司)进行逆转录。溶酶体和自体吞噬基因特异性引物此前已报导2。自体吞噬基因引物和小鼠引物购自SA生物科学公司（SABiosciences）。倍数变化使用SA生物科学公司的在线数据分析网站(http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)计算，该网站使用DDCt方法。简单说，最稳定的持家基因(GAPDH、ACTB、B2M、RPL13A、HPRT和亲环素)的平均用作“标准化”基因以计算DCt值。然后，计算“对照”组和“实验”组之间的DDCt值。最后，使用2(-DDCt)计算倍数变化。将生物学重复分组以计算倍数变化值。用未配对T检验计算统计学显著性。图中星号指示P值<0.05。
蛋白激酶预测
申请人使用了五种方法，包括CrPhos0.8、GPS-2.1、PhosphoMotifFinder、Networkin和PHOSIDA，采用默认参数(15-19)。根据其置信评分，进一步过滤CrPhos0.8和GPS-2.1预测。对前者而言，用假阳性率(FPR)等于或小于30%来考虑预测。对后者而言，用评分等于或大于5来考虑预测。计算GPS-2.1评分为实际评分和临界值之间的差异。从其他三种方法中取所有预测。Networkin的情形中，结合Networkin和Networkin2的预测。各方法描述了在不同激酶分类中与S142位点相关的激酶，所述分类简单涉及四种层次水平：激酶组、激酶家族、激酶亚族和激酶本身。为获得各层次等级的一般共性，如果所述预测尚未以这四种层次等级的方式分类，那么我们将各预测按这四种层次等级分类。在http://kinase.org/kinbase数据库的脊椎动物进化支和人物种下检索缺失分类。根据各分类中的主要得票发现各分类的共性。
体外激酶实验
TFEB-S-142:Seq Id No.2的氨基酸（aa.）117-166：
PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
和TFEB-A-142:Seq Id No.4，对应Seq Id No.2的氨基酸117-166，其中Ser142Ala(粗体)：
PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
其由GENESCRIPT公司合成。所述测试肽TFEB-A-142和TFEB-S-142在50mMHEPES pH7中制成1mM。看来没有溶解问题。使用密理博公司的标准放射性测量试验，所述激酶试验在室温下以200μM ATP和100μM各个肽进行40分钟。所有蛋白激酶在其标准KinaseProfilerTM试验浓度下使用。孵育之后，所有试验通过加酸来终止，并取等分样品点样在P30和Filtermat A上以分离产物。所有测试进行一式三份，并且包括各蛋白激酶的常见底物作为对照。
体内基因递送
小鼠饲养在贝勒医学院的转基因小鼠实验室中(美国德克萨斯州休斯顿)。GFP-LC3转基因小鼠是N.Mizushima的友情馈赠。除非另有说明，使用C57B6雌性小鼠(4周龄)。所述AAV载体由TIGEM AAV载体中心实验室生成。简单说，通过取代GFP序列而把小鼠TFEB(TcFEB)编码序列克隆到pAAV2.1-CMV-GFP质粒中并与HA标签一同并入框架中。然后将所得的pAAV2.1-CMV-TcFEB-HA与pAd-Helper和pack2/9包被质粒三重转染入亚融合293细胞内。重组AAV2/9载体通过两轮CsCl纯化。表达为基因组拷贝数(GC/mL)的载体滴度通过使用TaqMan(马萨诸塞州沃森姆的帕金埃尔默公司，生命和分析科学)PCR定量和点印迹分析来估算。各小鼠眼窝窦后注射1.25x1011病毒颗粒，并在3周后处死。分析基因表达时，饥饿小鼠已缺食16小时，或者分析GFP-LC3点数目时，已缺食24小时。
组织学和免疫荧光
收集肝样品，并且在含4%多聚甲醛的PBS中固定过夜。在含10和30%蔗糖的PBS中冷冻保护后，样品在OCT(加利福尼亚州托兰斯SF公司(Sakura Finetech))中冷冻，并且切片成30μm厚度。在Axioplan2(纽约州桑伍德的蔡司公司(Zeiss))上照相。对免疫荧光而言，切片在含2.5%BSA的PBS+0.1%曲通X-100中室温封闭2小时。封闭后，样品用一抗孵育20小时，并在PBS+0.05%TX-100中洗涤三次后，用偶联有Alexafluor488或Alexafluor555(英杰公司)的二抗孵育3小时。对HA的免疫组织化学分析，使用亲和素-生物素复合物(ABC)方法(Vectastain Elite ABC试剂盒)。抗GFP来自阿柏堪穆公司（Abcam）;(稀释1:500)。
电子显微术
对照和TFEB过量表达细胞用PBS洗涤，并且在溶解有1%戊二醛的0.2M Hepes缓冲液(pH7.4)中室温固定30分钟。细胞然后在OsO4中再固定2h。在梯度乙醇中脱水后，细胞包埋入Epon812(伏路卡公司（Fluka）)中，并且在60℃聚合72小时。在Leica EM UC6中切出薄切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅复染。使用装备有ULTRAVIEW CCD数码照相机(荷兰埃因霍温的飞利浦公司(Philips))的Philips Tecnai-12电子显微镜，从薄切片获得EM图片。空泡形成的定量使用AnalySIS软件(德国明斯特的软成像***公司(Soft Imaging Systems))进行。定量用细胞的选择是基于其对体视学（stereologic）分析的适宜性，即仅仅分析经其中心区域切过的细胞(基于高尔基膜的存在测定)。
动物模型
所有涉及小鼠的方法都得到贝勒医学院动物护理和使用委员会的批准。GFP-LC3转基因系如原先所述。如下产生Tcfeb的组织特异性过量表达：将Tcfeb-3xFlag cDNA***CAGCAT盒[鸡肌动蛋白启动子(CAG)后有侧接2loxP位点的氯霉素乙酰转移酶(CAT)cDNA]后，并且用于生成转基因小鼠(贝勒医学院转基因中心)。小鼠然后与白蛋白-CRE(获自杰克逊实验室)系杂交。对48饥饿方案而言，小鼠缺食22小时，随后进食2小时，再禁食24小时后处死。
酶活性
溶酶体酶酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和β-己糖胺酶的活性采用合适的荧光或显色底物来测定。SGSH活性按照Fraldi等Hum Mol Gen2007(33)中所述测定。
免疫印迹和抗体
小鼠抗TFEB单克隆抗体购自MB公司（My Biosource）目录号MBS120432。为了生成抗pS142特异性抗体，兔子免疫接种偶联有KLH的如下肽：AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后，处死兔子并收集血清。通过循环流过含非磷酸化抗原的柱来除去血清中非磷酸化特异性的抗体。然后使用含磷酸化肽的柱来纯化磷酸化特异性抗体。
细胞用包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(西格玛公司)的M-PER缓冲液(赛默公司(Thermo))裂解；如上所述分离核/胞质部分。蛋白通过SDS–PAGE(英杰公司；还原NuPAGE4–12%Bis-tris凝胶，MES SDS缓冲液)分离。如需要，所述凝胶使用20mlImperial蛋白染色剂(塞摩费舍尔公司(Thermo Fisher))在室温染色1小时，并且用水脱色。通过用I-Blot(英杰公司)把蛋白转印到硝酸纤维素膜上来进行免疫印迹分析。所述膜用含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液(含0.05%吐温20的TBS)封闭，并且用一抗抗体抗FLAG和抗TUBULIN(西格玛公司;1:2000)、抗H3(细胞信号转导公司;1:10000)在室温孵育2小时，而下列抗体在5%BSA中孵育过夜（ON）：抗TFEB(MB公司;1:1000)、抗P TFEB(1:1000)ERK1/2、p-ERK1/2、p-P70S6K、P70S6K(细胞信号转导公司;1:1000)。所述膜用TBS-T缓冲液洗涤三次，并且用碱性磷酸酶偶联的IgG(普洛麦格公司;0.2mg/ml)室温孵育1小时。所述膜用TBS缓冲液洗涤三次，并使所表达的蛋白通过加入10ml Western Blue稳定底物(普洛麦格公司)而显现。
高内涵核移位试验
TFEB-GFP细胞接种入384孔板，培养12小时，并且用10个不同浓度(50000nM、16666.66nM、5555.55nM、1851.85nM、617.28nM、205.76nM、68.58nM、22.86nM、22.86nM、7.62nM和2.54nM)的ERK抑制剂U0126(西格玛奥德里奇公司)和mTOR抑制剂雷帕霉素(西格玛奥德里奇公司)、Torin1(Biomarin公司)和Torin2(Biomarin公司)处理。37℃下RPMI培养基中3小时后，细胞洗涤、固定并且用DAPI染色。为了获得图像，通过使用共聚焦自动显微镜(Opera高内涵***，帕金埃尔默公司)，对384孔板的各孔照10张照片。开发专门的脚本（script）来对不同图像中的TFEB定位进行分析(Acapella软件，帕金埃尔默公司)。所述脚本计算来自核TFEB-GFP荧光的平均强度除以TFEB-GFP荧光胞质强度均值的比值。所得结构使用相同板中的阴性(RPMI培养基)和阳性(HBSS饥饿)对照样品来标准化。数据通过使用Prism软件(GraphPad软件)由各化合物不同浓度下的核移位百分比来表示。使用非线性回归拟合(Prism软件)计算各化合物的EC50。
结果
TFEB诱导自体吞噬
(巨)自体吞噬是进化保守的机制，该机制把胞质内材料靶定到溶酶体，因而在营养饥饿期间提供能量供应(1,3)。饥饿期间的自体吞噬活性由mTOR调节，mTOR的活性依赖于细胞能量需要。
由于自体吞噬是自噬体和溶酶体紧密关联的结果(1)，申请人测试了TFEB是否调节自体吞噬，TFEB是控制溶酶体生物发生的转录因子。因为TFEB对溶酶体生物发生和功能(2)以及溶酶体的胞吐起到正向控制(图16和17)，应该预期TFEB过量表达会由于其通过溶酶体增加降解而减少自噬体数。令人惊讶的是，如使用LC3标记所测定，HeLa细胞中稳定的TFEB过量表达显著增加了自噬体数，所述LC3标记特异性结合自噬体(4-7)(图1a,b)。通过HeLa和Cos细胞中瞬时过量表达TFEB获得相似数据(图5)。在感染慢病毒过量表达TFEB的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，通过电子显微术也检测到自噬体数的增加(图6)。在用自噬体的溶酶体抑制剂/LC3II降解巴伐洛霉素和抑胃酶肽/E64(8)处理的细胞中持续这种增加，表明TFEB激活自噬体的形成(图1a和图7)。在TFEB过量表达的细胞中，营养饥饿没有进一步增加自噬体数(图1a,c)，提示TFEB过量表达对自体吞噬的饱和效应，并提出了TFEB可能是饥饿诱导的自体吞噬的重要调节物的可能性。
与这些发现一致，HeLa细胞中TFEB的RNA干扰(RNAi)造成正常和饥饿条件下有或没有巴伐洛霉素存在时LC3II水平都有降低(图1d-f)。显然，LC3II的降低与不同RNAi寡核苷酸造成的TFEB水平下调有关，这显示了试验的特异性(图1g)。这些功能增减的数据提示自噬体和溶酶体的生物发生（biogeneses）受TFEB共同调节。申请人然后使用带RFP-GFP串联标签的LC3蛋白测量自噬体向溶酶体运输的速率(9)，所述蛋白区分早期溶酶体细胞器(GFP-阳性/mRFP-阳性)与酸化的自噬溶酶体(GFP-阴性/mRFP-阳性)，因为GFP信号(但mRFP不会)在酸性细胞器内被淬灭(9)。发现了TFEB过量表达细胞中自噬溶酶体数高于对照细胞，表明TFEB提高自噬体－溶酶体融合，因而促进溶酶体流动(图1h)。TFEB调节自体吞噬作用的功能证据来自以下观察：长寿命蛋白的降解因TFEB过量而增强，因TFEB敲减而降低。自体吞噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)消除这种增强(10)(图8)。
为了测试TFEB是否调节自体吞噬基因的表达，申请人分析了一组51个基因的mRNA水平，这些基因据报导参与自体吞噬通路中数个步骤(1,12,13)。观察到过量表达TFEB的细胞中自体吞噬基因表达水平的提高与饥饿期间所得提高非常相似(HeLa细胞在EBSS培养基中4小时)(皮尔逊(Pearson)相关：r值=0.42;p值=0.001)，而其在TFEB沉默之后下调(图2a与表1和2)。其中，UVRAG、WIPI、MAPLC3B、SQSTM1、VPS11、VPS18和ATG9B的表达受TFEB过量表达的影响最显著(表1和2)。已知这些基因在自体吞噬的不同步骤中起作用，并且看来是TFEB的直接靶标，因为其启动子中带有至少一个CLEAR位点(2)(图9)。有趣的是，VPS11、VPS18和UVRAG在自噬体运输到溶酶体中起作用(14)，这与TFEB过量表达细胞中溶酶体－自噬体融合的显著增强一致。
这些数据指示TFEB参与饥饿诱导的自体吞噬的转录调节。这个结论得到下面观察的强烈支持。第一，萤光素酶报导试验(2)显示饥饿增强了TFEB对靶标基因转录的影响(图10)。第二，TFEB直接靶标的表达在饥饿细胞中上调，并且这种上调受TFEB沉默的抑制(图2a,c)。
饥饿调节TFEB的核移位和活性。
为了鉴定饥饿诱导活化TFEB的机制，申请人分析了饥饿细胞中TFEB的亚细胞定位和转录后修饰。在正常条件下，TFEB定位于胞质(2)。观察到营养饥饿(EBSS培养基)快速诱导TFEB的核移位(图2d,e)，以及饥饿细胞的胞质TFEB看来分子量低于正常进食细胞的TFEB，如western印迹分析所示(图11a)。这个分子量改变发生快速但短暂，并且在向饥饿细胞中再加入正常培养基后1小时内消除，同时核TFEB降低(图11a)。通过向EBSS培养基补充血清、氨基酸或者生长因子（即胰岛素或EGF），申请人观察到TFEB核移位相较仅用饥饿培养基有显著抑制(图2f)。当EBSS补充有细胞因子(即INF或LIF)时，几乎未见影响(图2f)，这提示TFEB活化是受对营养和生长因子敏感的信号转导机制调节的过程。申请人用补充有mTOR激酶抑制药物(雷帕霉素)、PI3K-AKT激酶抑制药物(曲西立滨)和MEK激酶抑制药物(U0126)的正常培养基刺激饥饿的细胞。MEKi抑制导致TFEB核定位，其水平与饥饿类似，而AKT和mTOR抑制没有影响(图2g和图11b)。这些数据提示TFEB活性受MAP激酶调节，揭示了这个信号转导通路在调节饥饿诱导的自体吞噬中的意外作用。此外，HeLa细胞中组成型活性MEK(caMEK)的表达导致饥饿期间TFEB靶标基因表达的下调，因而模拟了TFEB敲减的效果(图2h)，而TFEB消耗细胞中caMEK过量表达对TFEB靶标基因的表达没有影响(图2h)。
丝氨酸磷酸化调节TFEB活化
为了更详细分析MAPK信号转导和TFEB之间的关系，申请人进行了质谱分析，并且鉴定了至少三个丝氨酸(即S142、S332和S402)在营养富集培养基中被磷酸化，但是在饥饿培养基中则不然。把这三个丝氨酸各自突变成丙氨酸以消除磷酸化。在HeLa细胞中表达各突变的TFEB蛋白，并且分析TFEB核移位。TFEB(S142A)突变显示核定位比TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)显著增加(图3a和图12a)。相反，磷酸模拟突变(TFEB S142D)在营养饥饿中不能移位入核(图12b)。S142A TFEB突变在正常培养基中以较低分子量迁移，但是在饥饿培养基中则不然，而S142D突变在饥饿期间显示比WT TFEB的变化减弱(图12c,d)，进一步证明了S142在正常培养基中磷酸化，但是饥饿培养基中则不然。TFEB(S142A)的表达造成TFEB靶标基因表达水平相较TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)有提高(图3b)。一致地，TFEB(S142A)导致的自体吞噬/溶酶体***的诱导强于wt TFEB，如自噬体(图3c和图13)、溶酶体(图3d)和自噬溶酶体(图3e)数目增加所显示。因此，TFEB核移位和活化受丝氨酸142磷酸化的调节。
为了鉴定负责丝氨酸142磷酸化的具体激酶，申请人进行生物信息学分析，所用分析方法基于在一组实验确证的磷酸化位点基础上构建的计算模型(15-19)(详细见方法)。与前面结果一致，申请人鉴定出丝氨酸特异性胞外调节激酶(ERK)作为丝氨酸142磷酸化的一流（top-ranking）候选(表3)。有趣地是，丝氨酸142在其他HLH-亮氨酸拉链基因家族成员中高度保守，例如小眼畸形（Microphthalmia）转录因子(MITF)(图14)，发现其由ERK2磷酸化(20)。ERK2介导TFEB磷酸化的其他证据来自在正常培养基中ERK2-TFEB的免疫共沉淀(图3f)，但是在饥饿培养基中则不然。此外，siRNA介导的ERK1/2蛋白敲减诱导的TFEB核移位程度与营养饥饿相似(图3h)。
TFEB介导的自体吞噬诱导的体内分析。
申请人分析了GFP-LC3转基因小鼠体内溶酶体/自体吞噬通路的TFEB介导控制的生理相关性(11)。由于有报导观察到营养耗减时肝中的自体吞噬反应，申请人关注于肝的研究。肝中，GFP阳性囊泡数在禁食24小时后开始增加，并且在48小时达到峰值(48小时饥饿方案见材料和方法)(图4a)，而自体吞噬和溶酶体TFEB靶标基因的转录诱导在禁食16小时后显现(图4b)。因此，转录活化先于自噬体的体内形成。重要地是，禁食16小时时，TFEB亚细胞定位完全在核中(图4c,d)，并且ERK磷酸化水平比进食动物有降低(图4e)，饥饿表明调节体内TFEB活性，这与培养细胞中观察到的相似。
申请人使用病毒和转基因介导的TFEB过量表达来评价TFEB是否足以诱导体内自体吞噬。用包含带HA表位标签的鼠TcfebcDNA的腺关联病毒(AAV)载体(AAV2/9–Tcfeb-HA)全身注射GFP-LC3转基因小鼠(11)(图15a,b)。来自Tcfeb注射动物的肝样品显示GFP阳性囊泡数显著增加，并且这种增加由饥饿进一步增强(图4e,f)。另外，来自条件Tcfeb-3xFLAG转基因小鼠的肝样品(其中转基因表达由肝特异性CRE重组酶驱动(即白蛋白-CRE)(图15c))显示溶酶体和自体吞噬基因的表达和自噬体数相比对照同胞仔都有显著增加(图4g,h)。总之，这些数据表明饥饿诱导TFEB在自体吞噬的转录调节中的重要作用。
TORC1调节TFEB亚细胞定位
然后在HeLa和HEK-293T细胞中分析TFEB亚细胞定位，所述细胞瞬时转染有TFEB–3 x FLAG质粒，并经溶酶体功能抑制剂处理过夜。这些处理包括使用溶酶体pH梯度抑制剂氯奎和v-ATP酶选择性抑制剂水杨酰胺A(SalA)(38)。核/胞质分级分离后进行的免疫印迹显示溶酶体应激也诱导外源表达TFEB的核移位，并且TFEB核积聚也与TFEB–3 x FLAG向更低分子量变化有关，提示溶酶体应激可能影响TFEB磷酸化状态(图18)。
基于mTORC1位于溶酶体膜且其活性依赖于营养和溶酶体功能(39,40)，申请人假定溶酶体应激对TFEB核移位的影响可能受mTORC1介导。与这个观点一致，按已知mTORC1底物p-P70S6K的水平所测得，氯奎或SalA抑制mTORC1活性，(图19A)(40)。mTOR的参与看来与原先观察到已知mTOR抑制剂雷帕霉素不影响TFEB活性的情形相反。然而，近期数据指示雷帕霉素是mTOR的部分抑制剂，因为在这种药物存在下，一些底物仍然被有效地磷酸化(41)。因此，申请人使用激酶抑制剂Torin1和Torin2（属于靶向mTOR催化位点的新分子类型）由此完全抑制mTOR活性(41,47,48)。
申请人用补充有Torin1(250nM)、雷帕霉素(2.5μM)或ERK抑制剂U0126(50μM)的富氨基酸培养基刺激饥饿细胞，在所述细胞中TFEB被磷酸化并且定位到核。仅用营养刺激饥饿细胞诱导TFEB分子量显著变化，并且重新定位到胞质中(图19B)。在浓度为50μM的ERK抑制剂U0126存在下，营养刺激仅诱导部分TFEB分子量变化，提示受ERK的磷酸化部分导致TFEB胞质定位。用2.5μM雷帕霉素处理也造成部分分子量变化，但是不影响TFEB的亚细胞定位(图19B)。然而，Torin1(250nM)处理完全阻止营养诱导的分子量变化，并继而造成大量TFEB核积聚。使用稳定过量表达融合有绿色荧光蛋白的TFEB(TFEB-GFP)的HeLa细胞在基于细胞的高内涵试验中证实了这些数据。在这个试验中，通过自动共聚焦显微镜(OPERA***)获得经处理细胞的图像，并且用Acapella图像软件分析这些图像以计算细胞的胞质和核之间TFEB-GFP的平均荧光强度之比(详细见材料和方法)(图19C和D)。因为Torin1抑制mTORC1和mTORC2复合物，申请人然后评价了各复合物对TFEB调节的作用。下面三个观察提示TFEB主要受mTORC1调节：(1)用氨基酸刺激饥饿细胞（所述氨基酸活化mTORC1但是不活化mTORC2）诱导了广泛的TFEB分子量变化，强烈提示磷酸化活动(图19E);(2)调节氨基酸向mTORC1信号的RagC和RagD的敲减造成TFEB核积聚，即使在保持于全营养培养基的细胞中亦然(图19F);(3)在mTORC2信号被破坏的细胞(Sin1-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))(49,50,46)中，TFEB在Torin1处理后经历与对照细胞相似的分子量变化和核移位(图19G)。
mTORC1通过S142磷酸化控制TFEB亚细胞定位
为了测试mTORC1是否在S142磷酸化TFEB，申请人生成了仅识别S142磷酸化的TFEB的磷酸特异性抗体。使用这种抗体，申请人观察到在营养耗尽培养基中培养的稳定过量表达TFEB–3 x FLAG的HeLa细胞中，TFEB不再有S142磷酸化，这与申请人上面报导的结果一致(图20A)。
然后，分析了在补充以含或不含Torin1或雷帕霉素的正常培养基的饥饿细胞中的S142磷酸化水平。Torin1清楚地减弱营养诱导的S142磷酸化时，但雷帕霉素却没有这种效果，提示S142表示雷帕霉素抗性mTORC1位点(图20A)。这些结果清楚地表明TFEB是mTOR底物，并且S142是mTOR对TFEB磷酸化的关键残基。
近期的发现提示mTORC1在多个位点磷酸化其靶标蛋白(42,43,44)。为了鉴定可被mTOR磷酸化的其他丝氨酸残基，申请人检索了TFEB编码序列中mTORC1的共有磷酸受体基序(42)(图20B和C)。将所有推定为mTORC1靶标的TFEB氨基酸残基突变成丙氨酸。然后测试了各个突变对TFEB亚细胞定位的影响，并且发现，与S142A相似，位点211的丝氨酸-向-丙氨酸突变(S211A)造成TFEB的组成型核定位(图20D)。其他丝氨酸残基的突变与野生型TFEB的表现相似(图20D)。
总之，这些数据表明，除S142以外，S211也在TFEB亚细胞定位中起作用，并且提示S211表示mTORC1的额外靶标位点。
溶酶体调节TFEB中的基因表达
因为TFEB与mTORC1的相互作用控制TFEB核移位，申请人测试TFEB调节基因表达的能力是否也受这种相互作用影响。在来自肝中删除TFEB的条件敲除小鼠系(Tcfebflox/flox;alb-CRE)和对照小鼠系(Tcfebflox/flox)的原代肝细胞中，测试已显示为TFEB靶标的数个溶酶体/自体吞噬基因的表达(37)。细胞用氯奎或Torin1处理，或保持不处理。按p-S6K水平所测，这些处理抑制mTOR，而p-ERK的水平没有受影响(图21A)。相较对照肝细胞，从TFEB条件敲除小鼠中分离并且在常规培养基中培养的原代肝细胞在数个TFEB靶标基因的表达水平上没有显示显著差异。然而，尽管TFEB靶标基因的表达在用氯奎处理后的对照小鼠肝细胞中有上调，但是这种上调在TFEB条件敲除小鼠的肝细胞中显著减弱(图21B)。相似地，对Torin1处理的转录反应在TFEB条件敲除小鼠的肝细胞中显著减弱(图21C)。总之，这些结果表明TFEB在通过mTOR的溶酶体诱导的转录反应中起关键作用。
已经描述了调节自体吞噬的转录依赖性机制(24,25)和不依赖性机制(26,27)。这个研究鉴定了新的激酶依赖性调节回路，所述回路控制自噬体通路的多个关键步骤，例如自噬体形成、自噬体－溶酶体融合和溶酶体介导的自噬体内容物降解。有趣的是，申请人观察到自体吞噬/溶酶体基因的转录诱导先于自噬体形成。可以设想的是这种转录依赖性机制保证了更长久且持续的自体吞噬活化。
自体吞噬功能障碍与数种遗传疾病有关(28-30)，相反，原先的研究显示了在神经退行性疾病和肝纤维化的动物模型中自体吞噬的增强有治疗效果(29,31,32)。
在转录水平控制溶酶体－自体吞噬通路的新机制的发现提示调节这些疾病中细胞清除的新方法。另外，提供了基于溶酶体酶的治疗方法的副产品，提示提高细胞系生成内源或重组溶酶体酶的产量的新策略(图16和17)。另外，TFEB过量表达能提高底物清除，并且拯救LSD中细胞空泡形成(45);因此，调节TFEB活性的磷酸化介导机制的鉴定提供了促进健康和疾病中细胞清除的新工具。
表1：响应TFEB过量表达或细胞饥饿5的基因表达变化(皮尔森相关0.42)
Figure BDA0000378525170000211
Figure BDA0000378525170000221
通过所示基因表达概况获得皮尔森积矩相关系数(PMCC)，即TFEB稳定过量表达对比饥饿HeLa细胞的基因表达概况。
表2：响应使用siRNA抑制TFEB的基因表达的变化
基因符号 倍数增加
AKT1 -2.1962
AMBRA1 1.1134
APP -1.1769
ARSA -2.858
ATG10 1.0389
ATG12 1.0461
ATG16L1 -1.6529
ATG16L2 -1.3333
ATG3 1.2702
ATG4A -1.3333
ATG4B -1.244
ATG4C -1.6077
ATG4D -1.1527
ATG5 -1.0607
ATG7 -1.6994
ATG9A -1.9793
ATG9B -4.4229
BAK1 1.4489
BAX -1.3803
BCL2 -2.3054
BECN1 -1.1769
BID 1.3241
BNIP3 -1.1212
CLN3 -1.4692
CXCR4 -1.5529
DRAM -1.1769
EIF2AK3 -1.3996
EIF4G1 -2.3702
ESR1 -1.676
GAA -1.3613
GABARAP 1.4093
GABARAPL1 -1.2016
GABARAPL2 1.3899
HGS -1.5594
HTT -1.3899
MAP1LC3A -1.0389
MAP1LC3B -1.4175
PIK3R4 -1.6189
PTEN -1.2702
RAB24 1.3333
SNCA 1.2269
SQSTM1 -1.4093
TP53 -1.279
ULK1 -3.668
UVRAG -1.3059
VPS11 -1.84
VPS18 -2.1
WIPI -1.94
使用siRNA介导的TFEB敲减后下调的基因。倍数变化表示4个独立实验的平均。红色显示显著下调的基因(p<0.05)。
表4：使用不同方法预测S142磷酸化
Figure BDA0000378525170000231
使用5种不同方法预测S142磷酸化的结果。第一栏显示方法。第二栏表明方法所述置信评分的截点值（可用时）。第三栏显示由相应方法所得预测的实际形式。后面四栏分别显示预测的激酶组、激酶家族、激酶亚族和激酶蛋白分类。
参考文献
1He,C.和Klionsky,D.J.，Regulation mechanisms and signaling pathways ofautophagy（自体吞噬的调节机制和信号转导通路）。Annu Rev Genet43,67-93(2009)。
2Sardiello,M.等，A gene network regulating lysosomal biogenesis and function（调节溶酶体生物发生和功能的基因网络）。Science325,473-477(2009)。
3Lum,J.J.等，Growth factor regulation of autophagy and cell survival in theabsence of apoptosis（没有凋亡情况下生长因子对自体吞噬和细胞存活的调节）.Cell120,237-248(2005)。
4Klionsky,D.J.、Elazar,Z.、Seglen,P.O.和Rubinsztein,D.C.，Does bafilomycinA1 block the fusion of autophagosomes with lysosomes?（巴伐洛霉素A1妨碍自噬体和溶酶体的融合吗？）Autophagy4,849-950(2008)。
5Xie,Z.和Klionsky,D.J.，Autophagosome formation:core machinery andadaptations（自噬体形成：核心机制和适应）Nat Cell Biol9,1102-1109(2007)。
6Rubinsztein,D.C.等，In search of an"autophagomometer"（寻找"自体吞噬计"）Autophagy5,585-589(2009)。
7Mizushima,N.、Yoshimori,T.和Levine,B.，Methods in mammalian autophagyresearch（哺乳动物自体吞噬研究中的方法）。Cell140,313-326(2010)。
8Klionsky,D.J.、Cuervo,A.M.和Seglen,P.O.，Methods for monitoring autophagyfrom yeast to human（从酵母到人，监测自体吞噬的方法）。Autophagy3,181-206(2007)。
9Kimura,S.、Noda,T.和Yoshimori,T.，Dissection of the autophagosomematuration process by a novel reporter protein,tandem fluorescent-tagged LC3（由新报导蛋白—串联荧光标签LC3的自噬体成熟过程的解析），Autophagy3,452-460(2007)。
10Bauvy,C.、Meijer,A.J.和Codogno,P.，Assaying of autophagic proteindegradation（分析自体吞噬蛋白降解）。Methods Enzymol452,47-61(2009)。
11Mizushima,N.、Yamamoto,A.、Matsui,M.、Yoshimori,T.和Ohsumi,Y.，In vivoanalysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing afluorescent autophagosome marker（使用表达荧光自噬体标记的转基因小鼠对响应营养饥饿的自噬体的体内分析）。Mol Biol Cell15,1101-1111(2004)。
12Mizushima,N.，Autophagy:process and function（自体吞噬：过程和功能）。Genes Dev21,2861-2873(2007)。
13Behrends,C.、Sowa,M.E.、Gygi,S.P.和Harper,J.W.，Network organization ofthe human autophagy system（人自体吞噬***的网络组织）。Nature466,68-76(2010)。
14Liang,C.等，Beclin1-binding UVRAG targets the class C Vps complex tocoordinate autophagosome maturation and endocytic trafficking（结合Beclin1的UVRAG靶向C型Vps复合物以协调自噬体成熟和胞吞运输），Nat Cell Biol10,776-787(2008)。
15Dang,T.H.、Van Leemput,K.、Verschoren,A.和Laukens,K.，Prediction ofkinase-specific phosphorylation sites using conditional random fields（使用条件随机场预测激酶特异性磷酸化位点）。Bioinformatics24,2857-2864(2008)。
16Xue,Y.等，GPS2.0,a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites inhierarchy（GPS2.0，层级预测激酶特异性磷酸化位点的工具）。Mol Cell Proteomics7,1598-1608(2008)。
17Amanchy,R.等，A curated compendium of phosphorylation motifs（磷酸化基序的已组织清单）。Nat Biotechnol25,285-286(2007)。
18Linding,R.等，Systematic discovery of in vivo phosphorylation networks（体内磷酸化网络的***发现）。Cell129,1415-1426(2007)。
19Gnad,F.等，PHOSIDA(phosphorylation site database):management,structuraland evolutionary investigation,and prediction of phosphosites（PHOSIDA(磷酸化位点数据库):管理、结构和进化研究、以及磷酸位点预测）。Genome Biol8,R250(2007)。
20Hemesath,T.J.、Price,E.R.、Takemoto,C.、Badalian,T.和Fisher,D.E.，MAPkinase links the transcription factor Microphthalmia to c-Kit signalling in melanocytes（MAP激酶在黑素细胞中将转录因子小眼畸形与c-Kit信号转导关联）。Nature391,298-301(1998)。
21Kolch,W.，Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors（通过支架和抑制剂协调ERK/MAPK信号转导）。Nat Rev Mol Cell Biol6,827-837(2005)。
22Corcelle,E.等.Disruption of autophagy at the maturation step by the carcinogenlindane is associated with the sustained mitogen-activated protein kinase/extracellularsignal-regulated kinase activity（由致癌物质六氯化苯造成在成熟步骤破坏自体吞噬与持续的丝裂原活化蛋白激酶/胞外信号调节激酶活性相关联）。Cancer Res66,6861-6870(2006)。
23Lipinski,M.M.等，A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions（全基因组的siRNA筛选揭示在正常营养条件下调节自体吞噬的多个mTORC1独立性信号转导通路）。Dev Cell18,1041-1052(2010)。
24Zhao,J.等，FoxO3coordinately activates protein degradation by theautophagic/lysosomal and proteasomal pathways in atrophying muscle cells（FoxO3协调性活化萎缩肌细胞中自体吞噬/溶酶体和蛋白酶体通路的蛋白降解）。Cell Metab6,472-483(2007)。
25Mammucari,C.等，FoxO3controls autophagy in skeletal muscle in vivo（FoxO3控制骨骼肌体内自体吞噬）。Cell Metab6,458-471(2007)。
26He,C.和Levine,B.，The Beclin 1 interactome（Beclin1相互作用组）。Curr OpinCell Biol22,140-149(2010)。
27Neufeld,T.P.，TOR-dependent control of autophagy:biting the hand that feeds（自体吞噬的TOR依赖性控制：恩将仇报）。Curr Opin Cell Biol22,157-168(2010)。
28Wong,E.和Cuervo,A.M.，Autophagy gone awry in neurodegenerative diseases（神经退行性疾病中的自体吞噬出错）。Nat Neurosci13,805-811(2010)。
29Levine,B.和Kroemer,G.，Autophagy in the pathogenesis of disease（疾病发病机理中的自体吞噬）。Cell132,27-42(2008)。
30Settembre,C.等，A block of autophagy in lysosomal storage disorders（溶酶体贮积症中自体吞噬的阻断）。Hum Mol Genet17,119-129(2008)。
31Hidvegi,T.等，An autophagy-enhancing drug promotes degradation of mutantalpha1-antitrypsin Z and reduces hepatic fibrosis（促自体吞噬药物增加突变α1-抗胰蛋白酶Z的降解，并降低肝纤维化）。Science329,229-232(2010)。
32Rubinsztein,D.C.、Gestwicki,J.E.、Murphy,L.O.和Klionsky,D.J.，Potentialtherapeutic applications of autophagy（自体吞噬的潜在治疗应用）。Nat Rev DrugDiscov6,304-312(2007)。
33Fraldi,A.、Hemsley,K.、Crawley,A.、Lombardi,A.、Lau,A.、Sutherland,L.、Auricchio,A.、Ballabio,A.和Hopwood,J.J.，Functional correction of CNS lesions in anMPS-IIIA mouse model by intracerebral AAV-mediated delivery of sulfamidase andSUMF1 genes（MPS-IIIA小鼠模型中通过脑内AAV介导递送硫酸胺酶和SUMF1基因对CNS损伤的功能校正）。Hum Mol Genet,16,2693-702(2007)。
34Ballabio A、Gieselmann V(2009)，Lysosomal disorders:from storage to cellulardamage（溶酶体疾病：从贮积到细胞损伤）。Biochim Biophys Acta1793:684-696
35Luzio JP、Pryor PR、Bright NA(2007)，Lysosomes:fusion and function（溶酶体：融合和功能）。Nat Rev Mol Cell Biol8:622-632
36Saftig P、Klumperman J(2009)，Lysosome biogenesis and lysosomal membraneproteins:trafficking meets function（溶酶体生物发生和溶酶体膜蛋白：运输遇到功能）。Nat Rev Mol Cell Biol10:623-635
37Palmieri M、Impey S、Kang H、di Ronza A、Pelz C、Sardiello M、Ballabio A(2011)，Characterization of the CLEAR network reveals an integrated control of cellularclearance pathways（CLEAR网络的定性揭示细胞清除通路的整体控制）。Hum MolGenet20:3852-3866
38Xie XS、Padron D、Liao X、Wang J、Roth MG、De Brabander JK(2004)，Salicylihalamide A inhibits the V0sector of the V-ATPase through a mechanism distinctfrom bafilomycin A1（水杨酰胺A通过与巴伐洛霉素A1不同的机制抑制V-ATP酶的V0部分）。J Biol Chem279:19755–19763
39Sancak Y、Bar-Peled L、Zoncu R、Markhard AL、Nada S、Sabatini DM(2010)，Ragulator-Rag complex targets mTORC1to the lysosomal surface and is necessary for itsactivation by amino acids（Ragulator-Rag复合物把mTORC1靶定到溶酶体表面，并且是其通过氨基酸活化所必需）。Cell141:290–303
40Zoncu R、Bar-Peled L、Efeyan A、Wang S、Sancak Y、Sabatini DM(2011a)，mTORC1 senses lysosomal amino acids through an inside-out mechanism that requires thevacuolar H-ATPase（mTORC1通过需要液泡H-ATP酶的从里到外机制来感知溶酶体氨基酸）。Science334:678-683
41Thoreen CC、Kang SA、Chang JW、Liu Q、Zhang J、Gao Y,、Reichling LJ、Sim T、Sabatini DM、Gray NS(2009)，An ATP-competitive mammalian target ofrapamycin inhibitor reveals rapamycin-resistant functions of mTORC1（雷帕霉素抑制剂的ATP竞争性哺乳动物靶标揭示mTORC1的雷帕霉素抗性功能）。J Biol Chem284:8023-8032
42Hsu PP、Kang SA、Rameseder J、Zhang Y、Ottina KA、Lim D、Peterson TR、Choi Y、Gray NS、Yaffe MB、Marto JA、Sabatini DM(2011)，The mTOR-regulatedphosphoproteome reveals a mechanism of mTORC1-mediated inhibition of growth factorsignaling（mTOR介导的磷酸蛋白质组揭示生长因子信号转导的mTORC1调节抑制机制）。Science332:1317–1322
43Peterson TR、Sengupta SS、Harris TE、Carmack AE、Kang SA、Balderas E、Guertin DA、Madden KL、Carpenter AE、Finck BN、Sabatini DM(2011)，mTOR complex1 regulates lipin1localization to control the SREBP pathway（mTOR复合物1调节脂素1定位以控制SREBP通路）。Cell146:408–420
44Yu Y、Yoon SO、Poulogiannis G、Yang Q、Ma XM、Villen J、Kubica N、HoffmanGR、Cantley LC、Gygi SP、Blenis J(2011)，Phosphoproteomic analysis identifies Grb10as an mTORC1substrate that negatively regulates insulin signaling（磷酸蛋白质组学分析鉴定Grb10是负调节胰岛素信号转导的mTORC1底物）。Science332:1322–1326
45Medina DL、Fraldi A、Bouche V、Annunziata F、Mansueto G、Spampanato C、Puri C、Pignata A、Martina JA、Sardiello M、Palmieri M、Polishchuk R、Puertollano R、Ballabio A(2011)，Transcriptional activation of lysosomal exocytosis promotes cellularclearance（溶酶体胞吐的转录活化提高细胞清除）。Dev Cell21:421-430
46Jacinto E、Facchinetti V、Liu D、Soto N、Wei S、Jung SY、Huang Q、Qin J、Su B(2006)SIN1/MIP1maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Aktphosphorylation and substrate specificity（SIN1/MIP1维持了rictor-mTOR复合物完整性，并且调节Akt磷酸化和底物特异性）。Cell127:125-137
47Feldman ME、Apsel B、Uotila A、Loewith R、Knight ZA、Ruggero D、ShokatKM(2009)Active-site inhibitors of mTOR target rapamycin-resistant outputs of mTORC1and mTORC2（mTOR的活性位点抑制剂靶定mTORC1和mTORC2的雷帕霉素抗性输出）。PLoS Biol7:e38
48Garcia-Martinez JM、Moran J、Clarke RG、Gray A、Cosulich SC、Chresta CM、Alessi DR(2009)Ku-0063794is a specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin(mTOR)（Ku-0063794是雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)的特异性抑制剂）。Biochem J421:29-42
49Frias MA、Thoreen CC、Jaffe JD、Schroder W、Sculley T、Carr SA、Sabatini DM(2006)mSin1 is necessary for Akt/PKB phosphorylation,and its isoforms define threedistinct mTORC2s（mSin1是Akt/PKB磷酸化所必需，并且其同种型定义三种不同的mTORC2）。Curr Biol16:1865-1870
50Yang Q、Inoki K、Ikenoue T、Guan KL(2006)Identification of Sin1as an essentialTORC2 component required for complex formation and kinase activity（鉴定Sin1是对复合物形成和激酶活性必需的重要TORC2组件）。Genes & development20:2820-2832
Figure IDA0000378525220000011
Figure IDA0000378525220000021
Figure IDA0000378525220000031
Figure IDA0000378525220000041
Figure IDA0000378525220000051
Figure IDA0000378525220000061
Figure IDA0000378525220000071

Claims (25)

1.一种组成型定位在真核细胞核内的TFEB变体蛋白。
2.如权利要求1所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述变体包含丝氨酸残基取代以使其对磷酸化不敏感。
3.如前述权利要求中任一项所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述变体蛋白由Seq.Id No.2所含氨基酸序列组成，并且其中所述丝氨酸残基取代是在Seq.Id.No.2的SER142和/或SER211。
4.如权利要求3所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述Seq.Id No.2中所含氨基酸序列是从氨基酸117到氨基酸166，并且所述丝氨酸残基取代是在Seq.Id No.2中的SER142，如Seq Id No.4所示。
5.如权利要求3或4所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述在Seq.Id.No.2中SER142和/或SER211的取代是ALA取代。
6.如上述权利要求中任一项所述的TFEB变体蛋白用于医学应用。
7.如权利要求6所述的TFEB变体蛋白用于治疗需要诱导细胞自体吞噬/溶酶体***的疾病中的应用。
8.如权利要求6所述的TFEB变体蛋白用于治疗下列病症中的应用：溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
9.如权利要求8所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述溶酶体贮积症包含：激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积病、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯（Farber）病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、高歇（Gaucher）病(包含I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积病(包含婴儿型、晚婴型/少年型、成年型/慢性)、I细胞疾病/黏脂沉积症II型、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(包含婴儿发病、迟发性)、异染性脑白质营养不良、假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积症IIIA型、MPS I型贺勒综合征、MPS I型施艾氏综合征、MPS I型贺勒氏-施艾氏综合征、MPS II型亨特综合征、A型沙费利波综合征/MPS IIIA型、B型沙费利波综合征/MPS IIIB型、A型莫奎欧氏症/MPS IVA型、B型莫奎欧氏症/MPS IVB型、MPS IX型透明质酸酶缺乏症、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积病(包含CLN6病、非典型晚婴型、迟发型变异、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏病/晚婴型CLN2/TPP1病、Kufs/成人发病型NCL/CLN4病、北方癫痫/异晚婴型CLN8和神经元蜡样脂褐质沉积症/婴儿型CLN1/PPT病)、β-甘露糖苷贮积病、庞培氏病/II型糖原贮积病、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病型/GM2神经节苷脂累积病、婴幼儿山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病、青少年山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、多发性硫酸酯酶缺乏症。
10.如权利要求8所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述肝病选自α1抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
11.如权利要求8所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述肌肉疾病选自自体吞噬液泡肌病和过度自噬X连锁肌病。
12.如权利要求8所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述代谢疾病选自高胆固醇血症和脂肪肝病。
13.如权利要求8所述的TFEB变体蛋白，其特征在于，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特-雅各布病和脊髓性小脑萎缩症。
14.一种核酸，所述核酸包含编码如权利要求1-5中任一项所述的TFEB变体蛋白的编码序列。
15.如权利要求14所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含Seq Id No.3的序列。
16.一种表达载体，所述表达载体在适当调节序列下包含如权利要求14或15所述核酸。
17.如权利要求16所述的表达载体用于基因治疗。
18.一种提高离体培养细胞中内源或重组溶酶体酶产量的方法，所述方法包含如下步骤：-将权利要求14或15所述的核酸或者权利要求16所述的表达载体导入所述细胞，和-使所编码的TFEB变体蛋白得以表达。
19.一种通过给予对象药学有效量的如权利要求1-5中任一项所述的TFEB变体蛋白来治疗疾病的方法，其特征在于，所述疾病通过诱导细胞自体吞噬/溶酶体***来缓解。
20.一种通过给予药学有效量的如权利要求1-5中任一项所述的TFEB变体蛋白来治疗疾病的方法，其特征在于，所述疾病选自：溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代谢疾病。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是代谢疾病，其中所述代谢疾病是高胆固醇血症或脂肪肝病。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是神经退行性疾病，并且所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特-雅各布病或脊髓性小脑萎缩症。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是溶酶体贮积症，并且所述溶酶体疾病是：激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积病、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯（Farber）病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、高歇（Gaucher）病(包含I型、II型和III型)、GM1神经节苷脂沉积病(包含婴儿型、晚婴型/少年型、成年型/慢性)、I细胞疾病/黏脂沉积症II型、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(包含婴儿发病、迟发性)、异染性脑白质营养不良、假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积症IIIA型、MPSI型贺勒综合征、MPS I型施艾氏综合征、MPS I型贺勒氏-施艾氏综合征、MPS II型亨特综合型、A型沙费利波综合征/MPS IIIA型、B型沙费利波综合征/MPS IIIB型、A型莫奎欧氏症/MPS IVA型、B型莫奎欧氏症/MPS IVB型、MPS IX型透明质酸酶缺乏症、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积病(包含CLN6病、非典型晚婴型、迟发型变异、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏病/晚婴型CLN2/TPP1病、Kufs/成人发病型NCL/CLN4病、北方癫痫/异晚婴型CLN8和神经元蜡样脂褐质沉积症/婴儿型CLN1/PPT病)、β-甘露糖苷贮积病、庞培氏病/II型糖原贮积病、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病型/GM2神经节苷脂累积病、婴幼儿山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病、青少年山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、多发性硫酸酯酶缺乏症。
24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是肝病，并且所述肝病是α1抗胰蛋白酶缺陷或脂肪肝病。
25.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是肌肉疾病，并且所述肌肉疾病是自体吞噬液泡肌病或过度自噬X连锁肌病。
CN201280012155.6A 2011-03-07 2012-03-07 Tfeb变体及其应用 Pending CN103619873A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161449751P 2011-03-07 2011-03-07
US61/449,751 2011-03-07
US201161579793P 2011-12-23 2011-12-23
US61/579,793 2011-12-23
US201261596485P 2012-02-08 2012-02-08
US61/596,485 2012-02-08
PCT/EP2012/053921 WO2012120044A1 (en) 2011-03-07 2012-03-07 Tfeb variants and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103619873A true CN103619873A (zh) 2014-03-05

Family

ID=45808969

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012800121912A Pending CN103458970A (zh) 2011-03-07 2012-03-07 Tfeb磷酸化抑制剂及其应用
CN201280012155.6A Pending CN103619873A (zh) 2011-03-07 2012-03-07 Tfeb变体及其应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012800121912A Pending CN103458970A (zh) 2011-03-07 2012-03-07 Tfeb磷酸化抑制剂及其应用

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20140038920A1 (zh)
EP (2) EP2683733B1 (zh)
JP (2) JP2014513925A (zh)
KR (2) KR20130131461A (zh)
CN (2) CN103458970A (zh)
AU (2) AU2012224584A1 (zh)
BR (2) BR112013022697A2 (zh)
CA (2) CA2826674A1 (zh)
WO (2) WO2012120048A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108431033A (zh) * 2015-09-28 2018-08-21 泰莱托恩基金会 骨生长病症的治疗
CN114828857A (zh) * 2019-09-09 2022-07-29 联邦高等教育***-匹兹堡大学 通过激活tfeb恢复视网膜色素上皮细胞的溶酶体功能的方法

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9464089B2 (en) 2012-01-13 2016-10-11 Acea Biosciences Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
CA2861010A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Xiao Xu Heterocyclic compounds and uses as anticancer agents
US9034885B2 (en) 2012-01-13 2015-05-19 Acea Biosciences Inc. EGFR modulators and uses thereof
US9586965B2 (en) 2012-01-13 2017-03-07 Acea Biosciences Inc. Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine compounds as inhibitors of protein kinases
JP2015533368A (ja) * 2012-10-17 2015-11-24 フォンダッツィオーネ・テレソン 糖原貯蔵症の遺伝子療法
US11241434B2 (en) 2013-06-13 2022-02-08 Yale Uninversity Compositions and methods for improving cognition in a subject
US10660957B2 (en) * 2013-06-13 2020-05-26 Yale University Compositions and methods for treating an Aβ-modulated disease or disorder or improving cognition in a subject
CN117486865A (zh) 2013-07-11 2024-02-02 艾森医药公司 嘧啶衍生物作为激酶抑制剂
BR112016001457A2 (pt) 2013-07-25 2017-08-29 Dana Farber Cancer Inst Inc Inibidores de fatores de transcrição e usos dos mesmos
MX2016009753A (es) 2014-01-28 2017-07-07 Buck Inst For Res On Aging Metodos y composiciones para exterminar celulas senescentes y para tratar enfermedades y trastornos asociados con la senectud.
US20170216286A1 (en) 2014-01-28 2017-08-03 Mayo Foundation For Medical Education And Research Killing senescent cells and treating senescence-associated conditions using a src inhibitor and a flavonoid
JP2017504653A (ja) * 2014-01-31 2017-02-09 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド ジアミノピリミジンベンゼンスルホン誘導体およびその使用
JP2017504651A (ja) 2014-01-31 2017-02-09 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド ジアゼパン誘導体の使用
WO2016022902A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Diazepane derivatives and uses thereof
ES2914099T3 (es) 2014-08-25 2022-06-07 Salk Inst For Biological Studi Inhibidores novedosos de ULK1 y métodos de uso de los mismos
CA2967066A1 (en) * 2014-11-19 2016-05-26 Rush University Medical Center Use of cinnamic acid or sodium benzoate for treating lysosomal disorders
EP3307728A4 (en) 2015-06-12 2019-07-17 Dana Farber Cancer Institute, Inc. ASSOCIATION THERAPY USING TRANSCRIPTION INHIBITORS AND KINASE INHIBITORS
WO2017040971A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of using inhibitors of pikfyve for the treatment of lysosomal storage disorders and neurodegenerative diseases
KR20180051576A (ko) 2015-09-11 2018-05-16 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 아세트아미드 티에노트리아졸로디아제핀 및 그의 용도
RU2750164C2 (ru) 2015-09-11 2021-06-22 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Цианотиенотриазолодиазепины и пути их применения
MX2018004332A (es) 2015-10-09 2019-01-10 Acea Therapeutics Inc Sales farmaceuticas, formas fisicas y composiciones de inhibidores de pirrolopirimidina cinasa, y metodos para fabricar las mismas.
WO2017091673A2 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bivalent bromodomain inhibtors and uses thereof
WO2018012769A1 (ko) * 2016-07-12 2018-01-18 연세대학교 산학협력단 자가포식 향상물질 및 그 용도
US11426406B2 (en) * 2017-02-09 2022-08-30 Georgetown University Compositions and methods for treating lysosomal storage disorders
JP2020515588A (ja) * 2017-03-30 2020-05-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ミトコンドリア遺伝子疾患の処置方法
BR112019020840A2 (pt) 2017-04-07 2020-04-28 Acea Therapeutics Inc sais farmacêuticos, formas físicas e composições de inibidores da pirrolopirimidina quinase e métodos de produção dos mesmos
US20210254056A1 (en) * 2017-05-05 2021-08-19 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks
CN109549953A (zh) * 2017-09-27 2019-04-02 中国科学技术大学 调控tfeb以减弱保护性自噬促进纳米银抗肿瘤治疗的方法
US10596165B2 (en) 2018-02-12 2020-03-24 resTORbio, Inc. Combination therapies
BR112021005914A2 (pt) * 2018-10-01 2021-06-29 Genzyme Corporation derivados de tieno[3,2-b]piridina como inibidores de udp glicosiltransferase e métodos de uso
WO2020210921A1 (es) * 2019-04-16 2020-10-22 Universidad Austral De Chile Mutantes tfeb y su uso en el tratamiento y/o prevención de desórdenes que necesitan de la inducción del sistema de autofagia/lisosómico celular
CN110724203B (zh) * 2019-11-08 2021-04-30 中国人民解放军第四军医大学 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用
JP2023538250A (ja) * 2020-08-03 2023-09-07 カスマ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔｆｅｂの活性化方法及びリソソームの生合成方法ならびにそれらのための組成物
CN112225723B (zh) * 2020-12-16 2021-03-30 北京华氏开元医药科技有限公司 一种吲哚类衍生物、制备方法及应用
CN112552287B (zh) * 2020-12-16 2021-11-30 北京华氏精恒医药科技有限公司 一种吲哚类衍生物药物制剂及其制备方法
WO2023012353A1 (en) * 2021-08-06 2023-02-09 Fondazione Telethon Compounds for use in the therapeutic treatment of batten disease
WO2024010925A2 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Nested Therapeutics, Inc. Mitogen-activated protein kinase (mek) inhibitors

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1777686A (zh) * 2003-03-28 2006-05-24 科根泰克股份有限公司 差别表达的基因的调节因子结合位点的统计分析
WO2010056754A2 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 The Board Regents Of The University Of Texas System Inhibition of mammalian target of rapamycin

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001060816A1 (en) * 2000-02-17 2001-08-23 Amgen Inc. Kinase inhibitors
US7067550B2 (en) * 2000-11-03 2006-06-27 Massachusetts Institute Of Technology Treatments for neurotoxicity in Alzheimer's Disease
US7803824B2 (en) * 2004-10-29 2010-09-28 Alcon, Inc. Use of inhibitors of Jun N-terminal kinases to treat glaucoma
WO2008064244A2 (en) * 2006-11-20 2008-05-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphoinositide modulation for the treatment of neurodegenerative diseases
US7816083B2 (en) * 2007-05-03 2010-10-19 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with neurodegenerative diseases, methods of detection and uses thereof
EP2170073A4 (en) * 2007-06-05 2011-07-27 Univ Emory SELECTIVE INHIBITORS FOR CYCLINE-RELATED KINASES
WO2010044885A2 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Soluble mtor complexes and modulators thereof
WO2010048273A2 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 President And Fellows Of Harvard College Methods and compounds for treatment of neurodegenerative disorders
EP2349275B1 (en) * 2008-10-31 2017-03-08 Novartis AG Combination of a phosphatidylinositol-3-kinase (pi3k) inhibitor and a mtor inhibitor.
PA8851101A1 (es) * 2008-12-16 2010-07-27 Lilly Co Eli Compuesto amino pirazol
EP2218458A1 (en) 2009-02-13 2010-08-18 Fondazione Telethon Molecules able to modulate the expression of at least a gene involved in degradative pathways and uses thereof
CN102406648A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 中国科学院生物物理研究所 甲磺酸伊马替尼在制备抗帕金森病药物中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1777686A (zh) * 2003-03-28 2006-05-24 科根泰克股份有限公司 差别表达的基因的调节因子结合位点的统计分析
WO2010056754A2 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 The Board Regents Of The University Of Texas System Inhibition of mammalian target of rapamycin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
欧阳为明: "转录因子对B细胞发育的调控作用", 《生命科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108431033A (zh) * 2015-09-28 2018-08-21 泰莱托恩基金会 骨生长病症的治疗
CN114828857A (zh) * 2019-09-09 2022-07-29 联邦高等教育***-匹兹堡大学 通过激活tfeb恢复视网膜色素上皮细胞的溶酶体功能的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012224584A1 (en) 2013-10-10
US9193755B1 (en) 2015-11-24
CA2826864A1 (en) 2012-09-13
JP2014511391A (ja) 2014-05-15
EP2683733B1 (en) 2017-08-30
EP2683733A1 (en) 2014-01-15
BR112013022697A2 (pt) 2019-09-24
WO2012120048A1 (en) 2012-09-13
CN103458970A (zh) 2013-12-18
EP2683444A1 (en) 2014-01-15
US9127074B2 (en) 2015-09-08
US20140038920A1 (en) 2014-02-06
CA2826674A1 (en) 2012-09-13
AU2012224653A1 (en) 2013-10-03
WO2012120044A1 (en) 2012-09-13
US20140038897A1 (en) 2014-02-06
JP2014513925A (ja) 2014-06-19
BR112013022728A2 (pt) 2016-11-22
KR20130141673A (ko) 2013-12-26
US20150322124A1 (en) 2015-11-12
KR20130131461A (ko) 2013-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103619873A (zh) Tfeb变体及其应用
Puertollano et al. The complex relationship between TFEB transcription factor phosphorylation and subcellular localization
Lisbona et al. BAX inhibitor-1 is a negative regulator of the ER stress sensor IRE1α
Chauhan et al. TRIMs and galectins globally cooperate and TRIM16 and galectin-3 co-direct autophagy in endomembrane damage homeostasis
Park et al. Hypoxia regulates glutamate receptor trafficking through an HIF‐independent mechanism
James et al. Notch4 reveals a novel mechanism regulating Notch signal transduction
Knuppertz et al. Identification of autophagy as a longevity-assurance mechanism in the aging model Podospora anserina
Haghayeghi et al. Pellino enhances innate immunity in Drosophila
Malzer et al. Coordinate regulation of eIF2α phosphorylation by PPP1R15 and GCN2 is required during Drosophila development
Galagovsky et al. The Drosophila insulin-degrading enzyme restricts growth by modulating the PI3K pathway in a cell-autonomous manner
LaRiviere et al. Novel therapeutic approaches to autosomal dominant polycystic kidney disease
Stefan et al. Activation of an essential calcium signaling pathway in Saccharomyces cerevisiae by Kch1 and Kch2, putative low-affinity potassium transporters
Jenull et al. The Candida albicans HIR histone chaperone regulates the yeast-to-hyphae transition by controlling the sensitivity to morphogenesis signals
Kovács et al. Role of the deubiquitylating enzyme DmUsp5 in coupling ubiquitin equilibrium to development and apoptosis in Drosophila melanogaster
Domínguez-Martín et al. IreA controls endoplasmic reticulum stress-induced autophagy and survival through homeostasis recovery
Yang et al. Functional characterization of fidgetin, an AAA-family protein mutated in fidget mice
Taricani et al. The fission yeast ES2 homologue, Bis1, interacts with the Ish1 stress-responsive nuclear envelope protein
Jin et al. Members of the Rusc protein family interact with Sufu and inhibit vertebrate Hedgehog signaling
Peng et al. Role of the anillin-like protein in growth of Cryptococcus neoformans at human host temperature
King et al. Mitophagy
Nagai et al. Depletion of Ric-8B leads to reduced mTORC2 activity
Vichas et al. The Ski2-family helicase Obelus regulates Crumbs alternative splicing and cell polarity
El-Bazzal et al. Imbalance of Neuregulin1-ErbB2/3 signaling underlies altered myelin homeostasis in models of Charcot-Marie-Tooth disease type 4H
Yang et al. The GATOR2 complex maintains lysosomal-autophagic function by inhibiting the protein degradation of MiT/TFEs
Nunez Spatial Control of Cell Polarity and Cell Growth by Conserved NDR Kinase Orb6

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140305