JP2023538250A - Ｔｆｅｂの活性化方法及びリソソームの生合成方法ならびにそれらのための組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法、細胞内膜表面におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体の局在化を亢進させることによるＴＦＥＢの活性化方法、ＴＦＥＢ活性化因子の特性評価方法、及びＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病の治療方法、ならびに上記方法で使用するための組成物に関する。ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜と、ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分とを含むシステムをＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させ、その結果、前記膜における前記ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルが上昇するステップを含む前記方法。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月３日願の米国仮出願第６３／０６０，６１１号、及び２０２１年２月１７日出願の米国仮出願第６３／１５０，５２０号の優先権を主張し、上記出願の全体が本明細書に援用される。

配列表
米国特許法施行規則第１．５２条第（ｅ）項（５）に従って、ＡＳＣＩＩテキストファイル形式の配列表（表題：「２０１３０７５－００４２＿ＳＬ．ｔｘｔ」、作成日：２０２１年７月２２日、サイズ：４，８２１バイト）の全体が本明細書に援用される。

イオン恒常性と酸性のｐＨとは、密接に連携したリソソームの分解能力の決定因子であり、これらの特性が変化することにより疾患が起こる可能性がある。リソソーム膜チャネルがイオンフラックスを制御することは公知であるが、如何にしてかかる変化がリソソームによって局所的に感知され、当該の細胞が如何にして応答するかは明確になっていない。

本開示により、とりわけ、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質（ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２）の脂質付加及びその後の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の膜局在化の刺激、安定化、局在化、及び／または他の方法による増加が、ｍＴＯＲＣ１活性に依存することなくＴＦＥＢを活性化する可能性がある、及び／または他の方法でオートファジーを増加させる可能性があると洞察される。

あるいはまたはそれに加えて、いくつかの実施形態において、本開示によって、ＴＲＰＭＬ１を刺激することにより、ＬＡＭＰ１陽性のサイトゾル表面（例えば、リソソーム膜表面）におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルを刺激する、安定化する、局在化させる、及び／または他の方法で上昇させる可能性があると洞察される。

本開示により、オートファジーを増加させる、ならびに／またはＴＲＰＭＬ１を刺激する、ならびに／またはＬＡＭＰ１陽性のサイトゾル表面（例えば、リソソーム膜表面）におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルを刺激する、安定化する、局在化させる、及び／もしくは他の方法で上昇させる因子を評価するための技術も提供され；その上さらに、本開示により、かかる因子が、ＧＡＢＡＲＡＰ膜局在化の原因となる結合機構（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）の欠陥に関連する可能性があるもの、及び／またはオートファジーの増加から利益を得る可能性があるものを含む、特定の疾患、障害、または疾病の治療に有用である可能性があると洞察される。

一態様において、本開示は、ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜と、ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分とを含むシステムをＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させ、その結果、上記膜における上記ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルが上昇するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜はコンパートメントを画成する。いくつかの実施形態において、コンパートメントはリソソームであるか、またはリソソームを含む。いくつかの実施形態において、膜はリソソーム膜であるか、またはリソソーム膜を含む。いくつかの実施形態において、リソソーム膜はインタクトなリソソームの一部である。いくつかの実施形態において、リソソームは細胞中に存在する。

別の態様において、本開示は、ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与するステップは、リソソーム膜と、ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分とを含むシステムを上記ＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させることを含む。

いくつかの実施形態において、システムは、結合機構タンパク質をコードする遺伝子（結合機構遺伝子）及び／またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分をコードする遺伝子中に多型または変異を有する。いくつかの実施形態において、結合機構遺伝子は、Ａｔｇ３、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、Ａｔｇ１２、Ａｔｇ１６Ｌ１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、結合経路遺伝子はＡｔｇ１６Ｌ１である。いくつかの実施形態において、多型はＴ３００Ａである。

いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、金属、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化学的分類のＴＲＰＭＬ１アゴニストである。

いくつかの実施形態において、投与するステップは、上記システムを上記ＴＲＰＭＬ１アゴニストに曝露することであって、上記システムにおいて、１種以上のＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現もしくは活性、及び／または検出可能なエキソサイトーシス活性、オートファジー、リソソーム貯蔵物質のクリアランス、及びリソソーム生合成の１種以上が、上記曝露の前のそれらと比較して亢進されることが観測されるのに十分な条件下且つ十分な時間上記曝露することを含む。いくつかの実施形態において、投与するステップは、上記システムを上記ＴＲＰＭＬ１アゴニストに曝露することであって、上記システムにおいて、表１から選択される１種以上の遺伝子の発現または活性が、上記曝露の前のそれと比較して亢進されることが観測されるのに十分な条件下且つ十分な時間上記曝露することを含む。

いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現に対する影響について評価された場合に、飢餓条件下で観測される影響よりも制限された影響を示すことを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、上記アゴニストの存在下でのＴＲＰＭＬ１のレベルもしくは活性が、同等の条件下で上記アゴニストの非存在下よりも高いことを特徴とする。

いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＴＲＰＭＬ１と相互作用するという点で直接型アゴニストである。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＴＲＰＭＬ１と直接相互作用しないという点で間接型アゴニストである。

別の態様において、本開示は、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病の治療方法であって、上記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、もしくは疾病に罹患している、または罹患しやすい対象にＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は炎症性疾病であるか、または炎症性疾病を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病はリソソーム蓄積障害であるか、またはリソソーム蓄積障害を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病はポリグルタミン障害であるか、またはポリグルタミン障害を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は神経変性タンパク質症であるか、または神経変性タンパク質症を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は感染症である。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は、クローン病、ポンペ病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、球脊髄性筋萎縮症、α－１－アンチトリプシン欠乏症、及びマルチプルスルファターゼ欠損症からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病はクローン病である。

別の態様において、本開示は、細胞内膜表面におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体の局在化を亢進させることによるＴＦＥＢの活性化方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞内膜表面は細胞内コンパートメントのサイトゾル表面である。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントはリソソームである。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントはミトコンドリアである。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントは小胞体である。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントは病原体液胞である。いくつかの実施形態において細胞内コンパートメントはエンドソーム構造である。

いくつかの実施形態において、方法はＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＦＥＢの活性化はｍＴＯＲＣ１活性に依存しない。

別の態様において、本開示は、ＴＦＥＢ活性化因子の特性評価方法であって、１つ以上の細胞内膜表面におけるＦＬＣＮ局在化及び／またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体のレベルに対する効果を評価することを含む上記方法を提供する。

別の態様において、本開示は、結合機構関連（「ＣＭＡ」）疾患、障害、もしくは疾病、またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体関連疾患、障害、もしくは疾病の治療方法であって、ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患、障害、または疾病はクローン病であるか、またはクローン病を含む。

別の態様において、本開示は、細胞アッセイを含む、ＴＦＥＢ、ＴＦＥ３、及び／またはＭＩＴＦの活性化因子の特性評価方法であって、上記細胞アッセイが、ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤の存在、ＡＴＧ８結合機構の遺伝子破壊、ＡＴＧ８結合機構の小分子阻害剤の存在、タンパク質のＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのメンバーの遺伝子破壊、ＦＮＩＰ１もしくはＦＮＩＰ２におけるＬＩＲドメインの変異、またはそれらの組み合わせを含む細胞を含む、上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤はバフィロマイシンＡ１である。いくつかの実施形態において、ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤はサリシリハラミドＡの類似体ではない。いくつかの実施形態において、ＡＴＧ８結合機構の遺伝子破壊は、遺伝子のノックアウト、遺伝子のノックイン、１種以上の変異誘発遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質のＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのメンバーの遺伝子破壊は、遺伝子のノックアウト、遺伝子のノックイン、１種以上の変異誘発遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはそれらの組み合わせを含む。

図面は例示のみを目的とし、限定を目的としない。

ＬＣ３の脂質付加に対する種々の処理の例示的な影響を示すウエスタンブロットである。 ＬＣ３の脂質付加に対する種々の処理の例示的な影響を示す細胞画像である。 ＬＣ３の脂質付加に対する種々の処理の例示的な影響を示すウエスタンブロットである。 ＬＣ３の脂質付加に対するＡＺＤ８０５５、ＥＢＳＳ飢餓、及びバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）の例示的な影響を示すウエスタンブロットである。 ＬＣ３の脂質付加に対するＴＲＰＭＬ１（ＭＣＯＬＮ１）のノックアウトの例示的な影響を示すウエスタンブロットである。 処理後のＬ３Ｃ脂質付加がリソソームのアルカリ化または膜損傷を伴わないことを示す細胞画像である。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストＣ８による処理後のＡＴＧ８（ＬＣ３ＢまたはＧＡＢＡＲＡＰＬ１）とリソソームマーカーＬＡＭＰ１との共局在を示す細胞画像である。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストＣ８による処理後のＡＴＧ８（ＬＣ３ＢまたはＧＡＢＡＲＡＰＬ１）とリソソームマーカーＬＡＭＰ１との共局在を示すグラフである。 ＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯ細胞中にＡＴＧ１６Ｌ１変異体Ｋ４９０Ａを導入したところ、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（例えば、Ｃ８）誘発性のＬＣ３顆粒形成が消失したことを示す細胞画像である。 Ｃ８またはＡＺＤ８０５５による処理後のリソソームに特徴的なＧＦＰ－ＬＣ３構造を示す超微細構造光電子相関顕微鏡法（ＣＬＥＭ）の画像である。 Ｃ８またはＡＺＤ８０５５による処理後のｖＡＴＰアーゼによるＡＴＧ１６Ｌ１リクルートのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳｏｐＦによる障害、及びＬＣ３－ＩＩ形成に対するＳｏｐＦ誘導の影響を示す図及びウエスタンブロットである。 野生型細胞もしくはＡＴＧ１６Ｌ１^{Ｋ４９０Ａ}細胞における、ＬＡＭＰ１と共局在するＬＣ３顆粒形成に対する、Ｃ８またはＭＬ－ＳＡ１による処理の影響を示す細胞画像である。 ＴＦＥＢの活性化へのＴＲＰＭＬ１アゴニストの影響に対する、カルシニューリンの関与を示すグラフである。 ＴＦＥＢの活性化へのＴＲＰＭＬ１アゴニストの影響に対する、カルシニューリンの関与を示すグラフである。 ＴＦＥＢの核蓄積に対する、ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した細胞におけるＳｏｐＦ発現の影響を示すグラフである。 ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（ＭＫ６－８３及びＣ８）によるＴＦＥＢの活性化に対する、ＢａｆＡ１及びＡＺＤ８０５５の影響を示すウエスタンブロットである。 ＴＦＥＢの活性化及びＬＣ３結合に対する、ＦＩＰ２００、ＡＴＧ９Ａ、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、またはＡＴＧ１６Ｌ１のノックアウトの影響を示すウエスタンブロットである。 ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（Ｃ８）によるＴＦＥＢの活性化に対する、ＡＴＧ１６Ｌ１のノックアウト、ＢａｆＡ１との同時処理、または栄養飢餓（ＥＢＳＳ）の影響を示すウエスタンブロットである。 ＴＦＥＢの活性化に対する、イオノフォア特性を示し、且つ一重膜ＡＴＧ８結合を制御する薬物の影響を示すグラフである。 ＴＦＥＢ発現に対する、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（Ｃ８）で処理したＡＴＧ１６Ｌ１ノックアウト細胞における、ＦＩＰ２００結合変異体（ΔＦＢＤ）及びＣ末端ドメイン切断（ΔＣＴＤ）を含む数種のＡＴＧ１６Ｌ１対立遺伝子の影響を示すウエスタンブロットである。 ＷＤ４０点変異体ＡＴＧ１６Ｌ１－Ｆ４６７Ａ（Ｆ４６７Ａ）及びＡＴＧ１６Ｌ１－Ｋ４９０Ａ（Ｋ４９０Ａ）で再構成したＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯのマクロファージが、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（例えば、Ｃ８及びＭＬ－ＳＡ１）の存在下でＴＦＥＢの活性化を示さなかったことを示す細胞画像である。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理後の対照細胞及びＡＴＧ１６Ｌ１ノックアウト細胞における標的遺伝子の発現を示すグラフである。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理後の野生型及びＡＴＧ１６Ｌ１ノックアウト細胞におけるトランスクリプトームの応答を示すヒートマップである。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理後の野生型及びＡＴＧ１６Ｌ１ノックアウト細胞におけるトランスクリプトームの応答を示すヒートマップである。 Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ陽性オルガネラの数及び強度に対する、ＴＲＰＭＬ１活性化の影響を示す、細胞画像（Ａ）ならびにグラフ（Ｂ及びＣ）である。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理時のＴＦＥＢの活性化における、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質の関与を示すウエスタンブロット及びグラフである。 ＧＡＢＡＲＡＰとＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体との共免疫沈降を示すウエスタンブロットである。 ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体のプルダウンに対する、ＧＡＢＡＲＡＰのＬＩＲドメインドッキング部位（ＬＤＳ）に変異を含むＧＡＢＡＲＡＰタンパク質の影響を示すウエスタンブロットである。 リソソームフラックス（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｆｌｕｘ）の変化に応答するＧＡＢＡＲＡＰのリソソーム膜への直接結合、及びＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体に対する影響を示す図である。 ＴＲＰＭＬ１活性化後の膜関連ＦＬＣＮ及びＦＮＩＰ１の増加を示すウエスタンブロットである。 ＦＬＣＮとリソソームタンパク質ＬＡＭＰ１との共局在に対する、ＴＲＰＭＬ１アゴニストの影響を示す細胞画像である。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理後のＦＬＣＮ及びＦＮＩＰ１のリクルートを示すウエスタンブロットである。 制御因子複合体成分ＬＡＭＴＯＲ１が欠損した細胞におけるＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理後のＦＬＣＮ及びＦＮＩＰ１を示すウエスタンブロットである。 野生型及びＮＰＲＬ２ ＫＯ細胞の両方における栄養豊富な条件下でのＴＦＥＢの核移行に対する、ＦＬＣＮのノックアウトの影響を示す細胞画像及びウエスタンブロットである。 ＴＲＰＭＬ１活性化後のＴＦＥＢに対する、活性状態に固定されたＲａｇＧＴＰアーゼの影響を示すウエスタンブロットである。 ＦＬＣＮのＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離に対する非ＴＲＰＭＬ１刺激の影響を示すウエスタンブロッである。 リソソームのイオン含有量の変化時のＴＦＥＢの活性化の細胞機序を示す図である。 サイジングカラムにおけるＧＡＢＡＲＡＰ及びＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ２複合体の同時精製を示すグラフである。 ＧＡＢＡＲＡＰとＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ２との間の結合部位を示すグラフ及びタンパク質構造モデルの図である。 ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１複合体との相互作用におけるＧＡＢＡＲＡＰ ＬＩＲドメインの関与を示すウエスタンブロットである。 ＦＮＩＰ１とＦＬＣＮとの間の相互作用に対する、ＦＮＩＰ１ ＬＩＲにおける変異の影響を示すウエスタンブロットである。 ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト細胞におけるＴＦＥＢ及びＴＦＥ３活性化を示すウエスタンブロット及び細胞画像である。 ＤＭＳＯ、飢餓、またはＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した、親細胞、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト細胞、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋野生型ＦＮＩＰ１細胞、及びＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋ＬＩＲ変異体－ＦＮＩＰ１細胞におけるＴＦＥＢの活性化を示す図である。 ＤＭＳＯ、飢餓、またはＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した、親細胞、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト細胞、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋野生型ＦＮＩＰ１細胞、及びＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋ＬＩＲ変異体－ＦＮＩＰ１細胞におけるＴＦＥＢの活性化を示すウエスタンブロットである。 ＤＭＳＯ、飢餓、またはＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した、親細胞、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト細胞、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋野生型ＦＮＩＰ１細胞、及びＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋ＬＩＲ変異体－ＦＮＩＰ１細胞におけるＴＦＥＢの活性化を示すグラフである。 ＤＭＳＯ、飢餓、またはＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した、ＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋野生型ＦＮＩＰ１細胞、及びＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト＋ＬＩＲ変異体－ＦＮＩＰ１細胞におけるＴＦＥＢの活性化を示すグラフである。 ＦＮＩＰ１－ＬＩＲドメインが、ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理時のＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体の膜局在化に関与することを示すウエスタンブロットである。 ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理時のタンパク質レベルにおけるＴＦＥＢ標的遺伝子ＧＰＮＭＢが、ｍＴＯＲ阻害剤ＡＺＤ８０５５と比較して上昇することを示すウエスタンブロットである。ＧＰＮＭＢの上方制御は、ＦＮＩＰ１－ＬＩＲドメインに依存する。 表示した化合物（ＤＭＳＯ、バリノマイシン、またはオリゴマイシン／アンチマイシン（Ｏ／Ａ））により４時間処理したＨｅＬａ．Ｃａｓ９細胞またはＨｅＬａ．Ｃａｓ９＋パーキン細胞におけるＴＦＥＢ強度を示すグラフである。 パーキンを発現するＨｅＬａ対照ノックアウト細胞、ＬＣ３三重ノックアウト細胞、またはＧＡＢＡＲＡＰ三重ノックアウト細胞に対するバリノマイシンの影響（マイトファジーのシミュレーション時に安定なＴＦＥＢの活性化にとって必要である）を示すウエスタンブロットである。 マイトファジー誘導剤（バリノマイシン及びＯＡ）または対照（ＤＭＳＯ）による２４時間の処理後の、ＬＩＲ変異体ＦＮＩＰ１を安定して発現するＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト細胞におけるＴＦＥＢの活性化を示すウエスタンブロットである。 近接度に基づく（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ－ｂａｓｅｄ）マイトファジー誘導モデルを示す図である。ミトコンドリアへのｐ６２のリクルートによって、ミトコンドリア機能の化学的破壊に依存しないマイトファジーが生じる。 ｍＫｅｉｍａ、ＦＲＢ－ｐ６２、及びＦＫＢＰ－ＦＩＳ１を発現するＵ２ＯＳ細胞におけるマイトファジー効率の定量化、ならびにＢａｆＡ１との同時処理がＫｅｉｍａシグナルをブロックしたことを示すグラフである。 二量化剤誘導マイトファジー時のＵ２ＯＳ細胞におけるＴＦＥ３及びＦＬＣＮの細胞内局在化を示す。表示した遺伝子型（対照ノックアウト、ＲＢ１ＣＣ１ノックアウト、及びＧＡＢＡＲＡＰ三重ノックアウト）の細胞を、２５ｎＭ ＡＰ２１９６７（二量化剤）で３時間刺激した。対照細胞及びＲＢ１ＣＣ１＿ＫＯ（オートファジー欠損）細胞ではＴＦＥ３核局在化及びＦＬＣＮ顆粒状構造が見られたが、ＧＡＢＡＲＡＰ＿ＴＫＯ細胞では見られなかった。 野生型（ＷＴ）またはΔｓｏｐＦ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの負荷時のＴＦＥＢ移動度シフトを示すウエスタンブロットである。表示した株にＨｅＬａ細胞を３０分間感染させ、表示した感染後の時点で溶解液を採取した。 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染時の核ＴＦＥＢ蓄積の免疫蛍光分析を示す。細胞を野生型（ＷＴ）またはΔｓｏｐＦ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに感染させ、２時間感染後（ｈ．ｐ．ｉ）で分析した。 野生型（ＷＴ）またはΔｓｏｐＦ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに感染した細胞における定量化したＴＦＥＢ核局在化を示すグラフである。条件当り最低１００個の細胞について定量化を行った。 ΔｓｏｐＦ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに感染させ、２時間感染後（ｈ．ｐ．ｉ）で分析した対照ノックアウト細胞、ＬＣ３三重ノックアウト細胞、またはＧＡＢＡＲＡＰ三重ノックアウト細胞におけるＴＦＥＢ発現の免疫蛍光分析を示す。 野生型細胞、ＬＣ３三重ノックアウト細胞、及びＧＡＢＡＲＡＰ三重ノックアウト細胞における定量化したＴＦＥＢ核局在化を示すグラフである。 野生型（対照）またはΔｓｏｐＦサルモネラによる１０時間感染後（ｈ．ｐ．ｉ）での表示した遺伝子型（野生型、ＬＣ３三重ノックアウト、及びＧＡＢＡＲＡＰ三重ノックアウト）の細胞におけるＴＦＥＢ転写活性を示すグラフである。ＧＰＮＭＢ及びＲＲＡＧＤはコアＴＦＥＢ標的遺伝子として使用された。 Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに感染した対照ノックアウト細胞、ＬＣ３三重ノックアウト細胞、及びＧＡＢＡＲＡＰ三重ノックアウト細胞におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ液胞へのＦＬＣＮリクルートの免疫蛍光分析を示す。ＬＣ３ファミリーメンバーの欠失（ＬＣ３＿ＴＫＯ）ではなくＧＡＢＡＲＡＰタンパク質の欠失（ＲＡＰ＿ＴＫＯ）により、ＦＬＣＮの再局在化が遮断された。 栄養飢餓とは異なるＴＦＥＢ活性化パラダイムとしてのＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体のＧＡＢＡＲＡＰ依存性膜隔離を示す図である。

用語の定義
本発明をより容易に理解するために、まず特定の用語を以下に定義する。以下の用語及びその他の用語のさらなる定義は、本明細書を通して記載されている。本発明の背景技術を説明し、本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において引用される刊行物及びその他の参考資料は、本記述をもって援用される。

本出願では、文脈から別段であることが明確でない限り、（ｉ）用語「ａ」は「少なくとも１つ」を意味すると解釈される場合があり、（ｉｉ）用語「または」は、「及び／または」を意味すると解釈される場合があり、（ｉｉｉ）用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、それ単独で、または１つ以上のさらなる要素もしくはステップと共に記載されるかに拘わらず、項目毎に記載された要素またはステップを包含すると解釈される場合があり、（ｉｖ）用語「約」及び「概略」は、当業者によって理解されるであろう通り、標準偏差を許容するものと解釈される場合があり、（ｖ）範囲が記載されている場合は端点が含まれる。

アゴニスト：当業者によって理解されるであろう通り、用語「アゴニスト」とは、一般に、因子であって、上記因子の存在またはレベルが、標的のレベルもしくは活性が上記因子が存在しない場合（もしくは異なるレベルの上記因子が存在する場合）に観測される標的のレベルまたは活性と比較して上昇することと相関する、上記因子をいう。いくつかの実施形態において、アゴニストは、アゴニストであって、上記アゴニストの存在またはレベルが、特定の基準レベルもしくは基準活性（例えば、既知のアゴニスト、例えば陽性対照、の存在などの、適宜の基準条件下で観測される基準レベルもしくは基準活性）と同等またはそれを超える標的レベルまたは標的活性と相関する上記アゴニストである。いくつかの実施形態において、アゴニストは、当該アゴニストが標的にその影響を直接及ぼす（例えば、標的に直接相互作用する）という点で直接型アゴニストであってもよく；いくつかの実施形態において、アゴニストは、当該アゴニストが、その影響を間接的に及ぼす（例えば、標的の制御因子または何らかの他の成分もしくはエンティティに作用する、例えば、それと相互作用することによって）という点で間接アゴニストであってもよい。

アンタゴニスト：当業者によって理解されるであろう通り、用語「アンタゴニスト」とは、一般に、因子であって、上記因子の存在またはレベルが、標的のレベルもしくは活性が上記因子が存在しない場合（もしくは異なるレベルの上記因子が存在する場合）に観測される標的のレベルまたは活性と比較して低下することと相関する、上記因子をいう。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、上記アンタゴニストの存在またはレベルが、特定の基準レベルもしくは基準活性（例えば、既知のアンタゴニスト、例えば陽性対照、の存在などの、適宜の基準条件下で観測される基準レベルもしくは基準活性）と同等またはそれ未満の標的レベルまたは標的活性と相関する上記アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、当該アンタゴニストが標的にその影響を直接及ぼす（例えば、標的に直接相互作用する）という点で直接型アンタゴニストであってもよく；いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、当該アンタゴニストが、その影響を間接的に及ぼす（例えば、標的の制御因子または何らかの他の成分もしくはエンティティに作用する、例えば、それと相互作用することによって）という点で間接アンタゴニストであってもよい。

関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）：本明細書において用いられる場合、２つの事象またはエンティティは、それらの一方の存在、レベル、及び／または形態が、他方の存在、レベル、及び／または形態と相関している場合に、互いに「関連している」。例えば、特定のエンティティ（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベル、及び／または形態が、（例えば、関連する集団全体にわたって）疾患、障害、もしくは疾病の発生及び／またはそれに対する感受性と相関する場合に、上記疾患、障害、または疾病と関連していると考えられる。いくつかの実施形態において、２種以上のエンティティは、直接または間接的に相互作用し、その結果、互いに物理的に近接している及び／または近接したままである場合に、互いに物理的に「関連している」。いくつかの実施形態において、互いに物理的に関連している２種以上のエンティティは互いに共有結合しており；いくつかの実施形態において、互いに物理的に関連している２種以上のエンティティは、互いに共有結合はしていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって非共有結合している。

生体試料：本明細書では、用語「生体試料」は、一般的には、本明細書に記載の対象となる生物学的供給源（例えば、組織もしくは生物もしくは細胞培養物）から得られるまたはそれに由来する試料をいう。いくつかの実施形態において、対象となる供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、生体組織もしくは生体液であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、骨髄；血液；血球；腹水；組織もしくは細針生検試料；細胞含有体液；浮動性核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液；腹腔液；胸水；糞便；リンパ液；婦人科の体液；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；管ラバージュもしくは気管支肺胞ラバージュなどの洗浄液もしくはラバージュ；吸引液；掻き取り物；骨髄標本；組織生検標本；摘出標本；糞便、その他の体液、分泌物、及び／もしくは***物；ならびに／または上記由来の細胞などであってもよく、あるいはそれらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、生体試料は、個体から得られた細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、得られた細胞は、当該試料を得た個体由来の細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、試料は、任意且つ適宜の手段によって対象となる供給源から直接得られる「一次試料」である。例えば、いくつかの実施形態において、一次生体試料は、生検（例えば、細針吸引または組織生検）、手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の採取からなる群より選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態において、文脈から明らかになるように、用語「試料」とは、一次試料を（例えば、一次試料の１種以上の成分を除去することによって、及び／または一次試料に１種以上の因子を添加することによって）処理することによって得られる調製物をいう。例えば、半透膜を使用したろ過。かかる「処理試料」は、例えば、試料から抽出された、または一次試料を、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、特定の成分の単離及び／もしくは精製などの技法に供することによって得られた核酸あるいはタンパク質を含んでいてもよい。

併用療法：本明細書では、用語「併用療法」とは、対象が同時に２つ以上の治療レジメン（例えば、２種以上の治療薬または治療法）を受ける状況をいう。いくつかの実施形態において、上記２つ以上のレジメンは同時に実施されてもよく、いくつかの実施形態において、かかるレジメンは逐次的に実施されてもよく（例えば、第１のレジメンのすべての「用量」は、第２のレジメンの任意の用量の投与の前に投与される）、いくつかの実施形態において、かかる薬剤は、重複する投薬レジメンで投与される。いくつかの実施形態において、併用療法の「実施」は、組み合わせで他の薬剤または治療法を投与されている／受けている対象への１種以上の薬剤または治療法の投与／実施を含んでいてもよい。明確にするために記載するが、併用療法は、個々の薬剤が単一の組成物中で一緒に投与されること（または必ずしも同時に投与されることすら）要求しない。但し、いくつかの実施形態において、２種以上の薬剤またはそれらの活性部分が、複合組成物中で、さらには複合化合物中で（例えば、単一の化学的複合体もしく共有結合体の一部として）一緒に投与されてもよい。

組成物：当業者であれば、用語「組成物」が、１種以上の特定された構成要素を含む別個の物理的エンティティを指すために使用されてもよいことを理解しよう。一般に、別段の指定がない限り、組成物は、例えば気体、ゲル、液体、固体などの任意の形態の組成物であってよい。

投薬レジメンまたは治療レジメン：当業者であれば、用語「投薬レジメン」及び「治療レジメン」とは、（一般的には複数の）通常は時間で区切られて対象に個別に投与される、一連の単位投与分を指すために使用されてもよいことを理解しよう。いくつかの実施形態において、所与の治療薬には推奨投薬レジメンがあり、その推奨投薬レジメンは１回以上の投与分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、投薬レジメンは、それぞれが時間で他の投与と隔てられている複数の投与分を含んでいる。いくつかの実施形態において、個々の投与分は、同一の長さの期間により互いに隔てられており；いくつかの実施形態において、投薬レジメンは、複数の投与分と、個々の投薬を隔てる少なくとも２つの異なる時間とを含む。いくつかの実施形態において、投薬レジメン内のすべての投与分は同一の単位用量の投与分である。いくつかの実施形態において、投薬レジメン内の異なる投与分は異なる量の投与分である。いくつかの実施形態において、投薬レジメンは、第１の用量の第１の投与分と、第１の用量とは異なる第２の用量の、その後の１回以上のさらなる投与分とを含む。いくつかの実施形態において、投薬レジメンは、第１の用量の第１の投与分と、第１の用量と同一の第２の用量の、その後の１回以上のさらなる投与分とを含む。いくつかの実施形態において、投薬レジメンは、関連集団全体にわたって投与された場合に、所望のまたは有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投薬レジメンである）。

患者または対象：本明細書では、用語「患者」または「対象」とは、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、美容目的、及び／または治療目的のために、提供される組成物が投与される、または該組成物を投与することができる任意の生物をいう。一般的な患者または対象は動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、及び／またはヒトなどの哺乳動物）を含む。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。いくつかの実施形態において、患者または対象は、１種以上の障害または疾病に罹患しているか、またはそれに罹患しやすい。いくつかの実施形態において、患者または対象は、障害または疾病の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者または対象は、１種以上の障害または疾病と診断されている。いくつかの実施形態において、患者または対象は、疾患、障害、または疾病の診断を受ける及び／またはそれを治療するために特定の療法を受けているかまたは受けたことがある。

基準：本明細書では、それに対して比較が行われる基準または対照をいう。例えば、いくつかの実施形態において、対象となる薬剤、動物、個体、集団、試料、配列、または値は、基準もしくは対照である薬剤、動物、個体、集団、試料、配列、または値と比較される。いくつかの実施形態において、基準または対照は、対象となる試験もしくは測定と実質的に同時に試験及び／または測定される。いくつかの実施形態において、基準または対照は、任意選択で確実な媒体中に具体的に記載された、過去に実績のある基準または対照である。一般的には、当業者によって理解されるであろう通り、基準または対照は、評価中の条件もしくは環境と同等の条件または環境下で測定あるいは特性評価される。当業者であれば、特定の基準または対照の候補を信頼すること及び／または上記基準または対照の候補と比較することが妥当であるとするのに十分な類似性が存在するのはどのような場合かを理解しよう。

試料：本明細書では、用語「試料」とは、一般的に、対象となるある供給源から得られるかまたは該供給源に由来する物質のアリコートをいう。いくつかの実施形態において、対象となる供給源は生物学的または環境的供給源である。いくつかの実施形態において、対象となる供給源は、微生物、植物、または動物（例えば、ヒト）などの細胞もしくは生物であってもよく、またはそれを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、対象となる供給源は、生体組織もしくは体液であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、生体組織または体液は、羊水、房水、腹水、胆汁、骨髄、血液、母乳、脳脊髄液、耳垢、乳び、消化粥（ｃｈｉｍｅ）、***液、内リンパ液、滲出液、糞便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液、心膜液、外リンパ液、腹水、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂、***、血清、恥垢、喀痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、硝子体液、嘔吐物、及び／もしくはそれらの組み合わせまたはそれらの成分（複数可）であってもよく、あるいはそれらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、生体液は、細胞内液、細胞外液、血管内液（血漿）、間質液、リンパ液、及び／もしくは細胞透過液であってもよく、またはそれらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、生体液は、植物滲出液であってもよく、またはそれを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、生体組織または生体試料は、例えば、吸引、生検（例えば、細針または組織生検）、スワブ（例えば、口腔スワブ、鼻腔スワブ、皮膚スワブ、または膣スワブ）、掻き取り、手術、洗浄またはラバージュ（例えば、気管支肺胞、管、鼻、眼、口腔、子宮、膣、またはその他の洗浄またはラバージュ）によって得ることができる。いくつかの実施形態において、生体試料は、個体から得られた細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、試料は、任意且つ適宜の手段によって対象となる供給源から直接得られた「一次試料」である。いくつかの実施形態において、文脈から明らかになるように、用語「試料」とは、一次試料を（例えば、一次試料の１種以上の成分を除去することによって、及び／または一次試料に１種以上の因子を添加することによって）処理することによって得られる調製物をいう。例えば、半透膜を使用したろ過。かかる「処理試料」は、例えば、試料から抽出された、または一次試料を、核酸の増幅もしくは逆転写、特定の成分の単離及び／もしくは精製などの１種以上の技法に供することによって得られた核酸あるいはタンパク質を含んでいてもよい。

治療する：本明細書では、用語「治療する」、「治療」、または「治療すること」とは、部分的にもしくは完全に、疾患、障害、及び／もしくは疾病の１つ以上の症状または特徴の発症を緩和する、改善する、軽減する、阻害する、予防する、遅延させる；上記症状または特徴の重症度を低減する；ならびに／あるいは上記症状または特徴の発生率を低減するために使用される任意の方法をいう。治療は、疾患、障害、及び／または疾病の徴候を示さない対象に実施されてもよい。いくつかの実施形態において、治療は、上記疾患、障害、及び／または疾病の初期徴候のみを示す対象に、例えば、上記疾患、障害、及び／または疾病に関連する病状を発症するリスクを低減する目的で実施されてもよい。

特定の実施形態の詳細な説明
本開示により、ＡＴＧ８タンパク質のリソソーム表面に対する直接の、迅速且つ強固な結合を、リソソームイオンチャネルＴＲＰＭＬ１の小分子アゴニストが促進する機序が洞察される。詳細には、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質の結合により、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体のその基質であるＲａｇＣ／ＲａｇＤからの膜隔離（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）が生じる。これにより、ＲａｇＣ／ＲａｇＤの「ＧＴＰ結合」型が維持され、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３／ＭＩＴＦ転写因子への結合が損なわれる。「ＧＤＰ結合」型のＲａｇＣ／ＲａｇＤは細胞質保持を促進することから、「ＧＴＰ結合」ＲａｇＣ／ＲａｇＤの増加により、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３／ＭＩＴＦ核局在化が促進される。

オートファジー、リソソーム、及びＴＦＥＢ
オートファジーは進化的に保存された細胞過程であり、これにより「カーゴ」と呼ばれる細胞質成分の分解及び再利用が可能になる。このカーゴは、単一のタンパク質からタンパク質の凝集体まで、オルガネラから侵入病原体までに及ぶ。この過程は、カーゴを二重膜オートファゴソーム中にカプセル化し、最終的にはリソソームと融合することを含む（１）。リソソームは、カーゴを個々のアミノ酸に分解する酸性加水分解酵素及びペプチダーゼを含む一重膜オルガネラである。リソソームは、その重要な分解機能に加えて、細胞内の主要なシグナル伝達プラットフォームである。アミノ酸、脂質、及び糖を含む、但しこれらに限定されない多種の栄養素に関する情報を、種々のリソソームに常在するタンパク質及びシグナル伝達複合体を介して伝達することができる（３３）。

リソソームの形成と、多数のリソソーム酵素、膜タンパク質、及びオートファジー成分の転写制御は、マスター転写因子ＴＦＥ３及びＴＦＥＢの制御下にある。栄養ストレスまたはオートファジーフラックスの増加の条件下では、これらの転写因子は核に局在化し、リソソーム生合成を駆動する転写プログラムを組織化する（１５）。

ＴＦＥ３及びＴＦＥＢ核局在化の主要な制御因子はｍＴＯＲＣ１複合体である。このシグナル伝達複合体はリソソーム表面上に存在し、細胞の栄養状態を感知する。ｍＴＯＲＣ１の構成要素であるｍＴＯＲは栄養素に応答してＴＦＥ３及びＴＦＥＢをリン酸化し、細胞質保持を促進する。栄養素が少ないとｍＴＯＲＣ１が不活性化され、ＴＦＥ３及びＴＦＥＢの核局在化の抑制が緩和される（３４）。

ｍＴＯＲＣ１リン酸化とは独立に、ＴＦＥ３及びＴＦＥＢ転写因子はリソソームイオン含有量の変化によって活性化される場合がある。このことは、一過性受容体電位ＭＬ１（ＴＲＰＭＬ１）イオンチャネルの小分子アゴニストによって実証されている。アゴニストの結合は、リソソーム内腔からサイトゾルへのカチオンの非選択的放出をトリガーする。既報の研究において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストによるＴＦＥ３及びＴＦＥＢの活性化には、リソソームカルシウムの放出が必要であることが明らかになっている（１４）。

おそらく、ＴＦＥ３及びＴＦＥＢ核局在化の最も支配的な制御因子は、低分子量ＧＴＰアーゼであるＲａｇＣ／ＲａｇＤのヌクレオチド型である（２４）。これらの低分子量ＧＴＰアーゼが「ＧＴＰ結合」型である場合には、ＴＦＥ３及びＴＦＥＢに結合することができず、核蓄積が生じる。ＲａｇＧＴＰアーゼは、細胞中のアミノ酸レベルのセンサーであることが文書で十分に立証されており、アミノ酸の欠乏（飢餓）によりＲａｇＣ／ＲａｇＤの「ＧＴＰ結合型」が促進される。アミノ酸による刺激を受けると、腫瘍抑制因子ＦＬＣＮとその結合パートナーであるＦＮＩＰ１またはＦＮＰＩ２からなる複合体がＧＡＰ（ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）として作用し、ＲａｇＣ／ＲａｇＤによるＧＴＰの加水分解をトリガーし、「ＧＤＰ結合型」になる。この「ＧＤＰ結合型」によってＲａｇＣ／ＲａｇＤとＴＦＥ３及びＴＦＥＢとの直接的な相互作用が可能になり、これらの転写因子のサイトゾル保持が促進される。この制御の裏付けとして、構成的に「ＧＴＰに結合した」形態のＲａｇＣの発現により、栄養素の存在下で、ＴＦＥ３及びＴＦＥＢが構成的に核局在化することが可能になると同時に、ｍＴＯＲＣ１が同化成長（ａｎａｂｏｌｉｃ ｇｒｏｗｔｈ）過程に関与する他の基質に適切にアクセスすることが可能になる。逆に、「ＧＤＰに結合した」ＲａｇＣの発現により、飢餓条件におけるＴＦＥ３及びＴＦＥＢの核蓄積を抑制することが可能になる（３５）。

本開示では、ＴＦＥＢ及びＴＦＥ３転写活性の制御の新規な機序を重点とする。リソソームイオンチャネルＴＲＰＭＬ１の小分子アゴニストを使用することで、一重膜ＡＴＧ８結合（ＳＭＡＣ）の新規な経路が明らかになった。リソソームのイオンバランスの変化が液胞ＡＴＰアーゼ（ｖＡＴＰアーゼ）からの代償性反応をトリガーし、これにより、ＡＴＧ５－ＡＴＧ１２－ＡＴＧ１６Ｌ１複合体が直接リソソーム膜にリクルートされ、該複合体がＬＣ３のＡＴＧ８ホモログ及びＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーをリソソームのサイトゾル表面に結合させる。詳細には、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質のリソソーム膜への結合により、ＧＡＢＡＲＡＰ結合ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体が隔離される。ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体は、リソソーム膜、及びいくつかの実施形態において他の膜に安定して局在化する場合に、その基質であるＲａｇＣ／ＲａｇＤに対する作用が制限される。このＦＬＣＮ－ＦＮＩＰによるＲａｇＣ／ＲａｇＤの制御は通常、既報で提案されたように、リソソーム膜とは対照的にサイトゾル中で生じる。ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰによって提供されるＧＡＰ活性がなければ、ＲａｇＣ／ＲａｇＤはＧＴＰ結合型を維持し、ＴＦＥＢ及びＴＦＥ３の核蓄積を促進する。この過程はｍＴＯＲＣ１活性の制御から独立しており、且つ既報で提案されたカルシニューリン（ＣａＮ）媒介性のＴＦＥＢ及びＴＦＥ３の脱リン酸化の機序からも独立している。いくつかの実施形態において、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体のＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離は、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト以外の刺激でも生じる場合がある。いくつかの実施形態において、オートファゴソーム、ミトコンドリア、病原体含有液胞、小胞体、原形質膜、エンドソーム、及び多胞体を含む、但しこれらに限定されない細胞内膜へのＧＡＢＡＲＡＰの結合により、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体のＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離を介してＴＦＥＢ／ＴＦＥ３を活性化することができる。

活性薬剤
いくつかの実施形態において、本開示は、オートファジーを増加させる、及び／またはＴＲＰＭＬ１を刺激する、及び／または膜表面（例えば、リソソーム表面、サイトゾル表面、もしくはＬＡＭＰ１に関連する表面）におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルを刺激する、安定化させる、局在化させる、及び／もしくは他の方法で増加させる薬剤、ならびに／あるいは、上記薬剤の製造方法、特性評価方法、及び／または使用方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の薬剤は、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、金属、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるモジュレーターであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の薬剤は、リソソーム向性及びイオノフォア／プロトノフォア様特性を示す薬剤であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼの阻害剤である。いくつかの実施形態において、薬剤はシトクロムＣレダクターゼの阻害剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、モネンシン、ニゲリシン、サリノマイシン、バリノマイシン、オリゴマイシン、アンチマイシン、クロロキン、及びＣＣＣＰからなる群より選択される。

いくつかの実施形態において、本開示は、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、金属、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される化学的分類のＴＲＰＭＬ１モジュレーターであるか、またはそれを含む薬剤を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１モジュレーターは小分子化合物である。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１制御因子は、ＭＬ－ＳＡ１、ＭＬ－ＳＡ３、ＭＬ－ＳＡ５、ＭＫ６－８３、Ｃ８（ＷＯ２０１８／００５７１３を参照のこと）、またはＣ２（ＷＯ２０１８／００５７１３を参照のこと）を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１モジュレーターは、本明細書に記載の１種以上のアッセイにおいて活性を示すことができる。いくつかの実施形態において、小分子化合物は、野生型及びＴＲＰＭＬ１ノックアウトＨｅＬａ細胞を上記小分子化合物で処理した後にＴＦＥＢ移行を測定するＴＦＥＢアッセイにおいて活性を示すことによって、ＴＲＰＭＬ１モジュレーターであると判定される。いくつかの実施形態において、小分子化合物は、上記小分子化合物で処理された野生型及びＴＲＰＭＬ１ノックアウトＨｅＬａ細胞に対して実施される蛍光撮像プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）技術を含むアッセイにおいて内因性リソソームカルシウムフラックス活性を示すことによって、ＴＲＰＭＬ１モジュレーターであると判定される。いくつかの実施形態において、小分子化合物は、細胞株であって、該細胞の表面上にテトラサイクリン誘導性ＴＲＰＭＬ１を発現し、且つ上記低分子化合物で処理された上記細胞株に対して実施される蛍光撮像プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を含むアッセイにおいて外因性カルシウムフラックス活性を示すことによって、ＴＲＰＭＬ１モジュレーターであると判定される。

いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１モジュレーターはＴＲＰＭＬ１アゴニストである。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現に対する影響を評価した場合に、飢餓条件下で観測される影響よりも制限された影響を示すことを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、同等の条件下で、当該ＴＲＰＭＬ１アゴニストが存在する場合のＴＲＰＭＬ１のレベルまたは活性が、当該ＴＲＰＭＬ１アゴニストが存在しない場合よりも高いことを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＴＲＰＭＬ１と相互作用するという点で直接型アゴニストである。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＴＲＰＭＬ１と直接相互作用しないという点で間接型アゴニストである。

組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の活性薬剤を含む及び／または送達する組成物を提供する。

使用
いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、ｍＴＯＲＣ１に依存することなくＴＦＥＢを活性化するために；１種以上の膜表面（例えば、ＬＡＭＰ１と関連する、例えば、リソソームの、サイトゾル表面など）におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルを刺激する、安定化させる、局在化させる、及び／または他の方法で増加させるために；リソソーム生合成の増加及び／またはリソソーム酵素活性の増加及び／またはミトコンドリア生合成の増加を利する疾患を治療するために、記載の薬剤を使用するための技術を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜と、ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分とを含むシステムをＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させ、その結果、上記膜における前記ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルが上昇するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜はコンパートメントを画成する。いくつかの実施形態において、コンパートメントはリソソームであるか、またはリソソームを含む。いくつかの実施形態において、コンパートメントは後期エンドソームであるか、または後期エンドソームを含む。いくつかの実施形態において、コンパートメントは多胞体であるか、または多胞体を含む。いくつかの実施形態において、膜はリソソーム膜であるか、またはリソソーム膜を含む。いくつかの実施形態において、膜はエンドソーム膜であるか、またはエンドソーム膜を含む。いくつかの実施形態において、膜は多胞体膜であるか、または多胞体膜を含む。いくつかの実施形態において、リソソーム膜はインタクトなリソソームの一部である。いくつかの実施形態において、エンドソーム膜はインタクトなエンドソームの一部である。いくつかの実施形態において、多胞体膜はインタクトな多胞体の一部である。いくつかの実施形態において、リソソームは細胞中に存在する。いくつかの実施形態において、エンドソームは細胞内に存在する。いくつかの実施形態において、多胞体は細胞内に存在する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記投与するステップは、リソソーム膜と、ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分とを含むシステムを上記ＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、システムは、結合機構タンパク質をコードする遺伝子（結合機構遺伝子）及び／またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分をコードする遺伝子中に多型または変異を有する。いくつかの実施形態において、結合機構遺伝子は、Ａｔｇ３、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、Ａｔｇ１２、Ａｔｇ１６Ｌ１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、結合経路遺伝子はＡｔｇ１６Ｌ１である。いくつかの実施形態において、多型はＴ３００Ａである。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、金属、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化学的分類のＴＲＰＭＬ１アゴニストである。

いくつかの実施形態において、上記投与するステップは、システムをＴＲＰＭＬ１アゴニストに曝露することであって、上記システムにおいて、１種以上のＣｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＣＬＥＡＲ）ネットワーク遺伝子の発現もしくは活性、及び／または検出可能なエキソサイトーシス活性、オートファジー、リソソーム貯蔵物質のクリアランス、及びリソソーム生合成の１種以上が、上記曝露の前のそれらと比較して亢進されることが観測されるのに十分な条件下且つ十分な時間上記曝露することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子は、ＴＦＥＢによって標的化及び／または制御される。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子は、タンパク質、グリコサミノグリカン、スフィンゴ脂質、及びグリコーゲンの分解を制御するリソソーム酵素の発現、取り込み、及び活性の制御に関与する。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子は、オートファジー、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、食作用、及び免疫応答を含む、さらなるリソソーム関連過程の制御に関与する。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子は、ヘモグロビン及びキチンなどの必須タンパク質の分解に関与する非リソソーム酵素をコードする遺伝子を含む。

いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現に対する影響について評価された場合に、飢餓条件下で観測される影響よりも制限された影響を示すことを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現に対する影響について評価された場合に、飢餓条件下で観測される影響よりも制限された影響を示さないことを特徴とする。

いくつかの実施形態において、投与するステップは、システムをＴＲＰＭＬ１アゴニストに曝露することであって、上記システムにおいて、表１から選択される１種以上の遺伝子の発現または活性が、上記曝露の前のそれと比較して亢進されることが観測されるのに十分な条件下且つ十分な時間で曝露することを含む。

いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、上記アゴニストの存在下でのＴＲＰＭＬ１のレベルもしくは活性が、同等の条件下で上記アゴニストの非存在下よりも高いことを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＴＲＰＭＬ１と相互作用するという点で直接型アゴニストである。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１アゴニストは、ＴＲＰＭＬ１と直接相互作用しないという点で間接型アゴニストである。

別の態様において、本開示は、細胞内膜表面におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体の局在化を亢進させることによるＴＦＥＢの活性化方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞内膜表面は細胞内コンパートメントのサイトゾル表面である。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントはリソソームである。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントはミトコンドリアである。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントは小胞体である。いくつかの実施形態において、細胞内コンパートメントは病原体液胞である。いくつかの実施形態において細胞内コンパートメントはエンドソーム構造である。いくつかの実施形態において、上記方法はＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＦＥＢの活性化はｍＴＯＲＣ１活性に依存しない。

いくつかの実施形態において、本開示は、他の活性薬剤の識別または特性評価のための基準または対照としての使用のための活性薬剤を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＴＦＥＢ活性化因子の特性評価方法であって、１つ以上の細胞内膜表面におけるＦＬＣＮ局在化及び／またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体のレベルに対する効果を評価することを含む上記方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、細胞アッセイを含む、ＴＦＥＢ、ＴＦＥ３、及び／またはＭＩＴＦの活性化因子の特性評価方法であって、上記細胞アッセイが、ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤の存在、ＡＴＧ８結合機構の遺伝子破壊、ＡＴＧ８結合機構の小分子阻害剤の存在、タンパク質のＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのメンバーの遺伝子破壊、ＦＮＩＰ１もしくはＦＮＩＰ２におけるＬＩＲドメインの変異、またはそれらの組み合わせを含む細胞を含む、上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤はバフィロマイシンＡ１である。いくつかの実施形態において、ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤はサリシリハラミドＡの類似体ではない。いくつかの実施形態において、ＡＴＧ８結合機構の遺伝子破壊は、遺伝子のノックアウト、遺伝子のノックイン、１種以上の変異誘発遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質のＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのメンバーの遺伝子破壊は、遺伝子のノックアウト、遺伝子のノックイン、１種以上の変異誘発遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはそれらの組み合わせを含む。

疾患、障害、または疾病
いくつかの実施形態において、本開示は、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病の治療方法であって、上記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、もしくは疾病に罹患している、または罹患しやすい対象にＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は炎症性疾病であるか、または炎症性疾病を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病はリソソーム蓄積障害であるか、またはリソソーム蓄積障害を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病はポリグルタミン障害であるか、またはポリグルタミン障害を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は神経変性タンパク質症であるか、または神経変性タンパク質症を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は感染症であるか、または感染症を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病は、クローン病、ポンペ病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、球脊髄性筋萎縮症、α－１－アンチトリプシン欠乏症、及びマルチプルスルファターゼ欠損症からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病はクローン病である。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の活性薬剤が、１種以上の結合機構関連（「ＣＭＡ」）疾患、障害、または疾病の治療に特に有用であることができることを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合機構関連（「ＣＭＡ」）疾患、障害、もしくは疾病、またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体関連疾患、障害、もしくは疾病の治療方法であって、ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患、障害、または疾病はクローン病であるか、またはクローン病を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＭＡ疾患、障害、または疾病は、結合機構遺伝子における変異または結合機構遺伝子の対立遺伝子に関連することが確立されているＣＭＡ疾患、障害、または疾病である。例えば、ＡＴＧ１６Ｌ１におけるＴ３００Ａ多型は、クローン病の発生率の増加と関連している。この多型により、アミノ酸３００から伸びるＣ末端領域を除去するＡＴＧ１６Ｌ１のタンパク質分解処理の可能性が高まる。上記ＡＴＧ１６Ｌ１のＣ末端領域は、ＡＴＧ８ファミリーメンバーの一重膜への結合に重要であり、宿主－病原体応答にとって重要であることが知られている。腸においては、ＡＴＧ１６Ｌ１のＣ末端機能の低下が、ＡＴＧ１６Ｌ１－ＣＴＤドメイン依存性のＴＦＥＢの活性化の欠如を介して、クローン病の炎症誘発性に寄与している可能性がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のインタクトな完全長ＡＴＧ１６Ｌ１の受容体活性化作用を介して完全なＴＦＥＢ活性を回復するために、本明細書に記載の活性薬剤（例えば、ＴＲＰＭＬ１アゴニストまたは他の薬剤）によってこの疾病を治療することは、有益である可能性がある。

患者が腎腫瘍に罹患しやすくなる、希少な疾患であるバート・ホッグ・デュベ症候群におけるＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体機能喪失表現型及びＴＦＥＢ依存性の根底には、ＦＬＣＮの生殖細胞変異がある（３５、４４）。さらに、Ｒａｓによって駆動される膵臓腺癌細胞は、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３の構成的な核局在化及びＬＣ３とＬＡＭＰ２陽性リソソームとの顕著な共局在を示す（４５、４６）。ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体膜隔離の関与、及び発がんシグナルがこの機序を利用してＴＦＥＢ依存性腫瘍増殖を駆動するかどうかを理解することによって、リソソーム依存性腫瘍に対する新たな治療機会が提供される可能性がある。リソソーム活性または膜透過性の上昇（４６）がこの経路をトリガーする可能性があり、これが、栄養、ｍＴＯＲ活性状態が完全であるにもかかわらずＴＦＥＢが核局在化することの説明になる可能性がある（４５）。構成的な核ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３／ＭＩＴＦを伴うがんにおいて、ＧＡＢＡＲＡＰ－ＦＮＩＰ相互作用の特異的破壊により、特定の腫瘍におけるＴＦＥＢ／ＴＦＥ３／ＭＩＴＦ活性の阻害が可能になり、腫瘍の進行が低下する可能性がある。

いくつかの実施形態において、結合機構関連（「ＣＭＡ」）疾患、障害、もしくは疾病、またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体関連疾患、障害、もしくは疾病は、がんであるかまたはがん含む。いくつかの実施形態において、がんは、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３転写因子が核局在化していることを特徴とする。いくつかの実施形態において、がんは、エンドソーム構造またはリソソーム構造の損傷の存在を特徴とする。いくつかの実施形態において、がんは、細胞内膜（例えば、エンドソーム、リソソーム、オートファゴソーム、またはミトコンドリア）に結合したＡＴＧ８ホモログの存在を特徴とする。

以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物の製造のしかたならびに方法及び組成物の使用のしかたを当業者に説明するために提示したものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。

材料及び方法
抗体
本検討に使用した、ＡＴＧ１６Ｌ１（８０８９、ヒト）抗体、ホスホ－ＡＴＧ１４ Ｓ２９（９２３４０）抗体、ＡＴＧ１４（９６７５２）抗体、ホスホ－Ｂｅｃｌｉｎ Ｓ３０（５４１０１）抗体、ＦＩＰ２００（１２４３６）抗体、ＦＬＣＮ（３６９７）抗体、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１（２６６３２）抗体、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２（１４２５６）抗体、ＧＡＰＤＨ（５１７４、ウェスタンブロット（ＷＢ）の場合は１：１００００）抗体、ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ（１４７９３）抗体、ＨＡタグ（３７２４）抗体、ｍｙｃタグ（２２７８）抗体、ＬＣ３Ａ／Ｂ（１２７４１）抗体、ＬＣ３Ｂ（３８６８）抗体、ＬＡＭＴＯＲ１（８９７５）抗体、ＬＡＭＰ１（１５６６５、免疫蛍光分析（ＩＦ）の場合は１：１０００）抗体、ＮＦＡＴ１（５８６１、ＩＦの場合は１：２５０）抗体、ＮＰＲＬ２（３７３４４）抗体、ホスホ－Ｓ６Ｋ（９２３４）抗体、Ｓ６Ｋ（２７０８）抗体、ホスホ－Ｓ６ Ｓ２３５／２３６（４８５８、ＷＢの場合は１：３０００）抗体、Ｓ６（２２１７、ＷＢの場合は１：５０００）抗体、ＴＡＸ１ＢＰ１（５１０５）抗体、ＴＦＥＢ（４２４０）抗体、ＴＦＥＢ（３７７８５、ＩＦの場合は１：２００）抗体、及びホスホ－ＵＬＫ Ｓ７５７（１４２０２）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製であった。ＦＮＩＰ１抗体（ａｂ１３４９６９）はＡｂｃａｍ製であった。ＴＦＥ３抗体（ＨＰＡ０２３８８１）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ製であった。ｐ６２抗体（ＧＰ６２－Ｃ）はＰｒｏｇｅｎ製であった。ガレクチン－３抗体（ｓｃ－２３９３８）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であった。ＴＦＥＢ抗体（Ａ３０３－６７３Ａ、マウス細胞におけるＩＦの場合は１：２００）はＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製であった。別段の注記がない限り、すべての抗体は、ウエスタンブロット法の場合１：１０００希釈で使用した。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるノックアウト細胞株の生成
レンチウイルスによる形質導入（ベクター：カタログ番号ＳＶＣ９－ＰＳ－Ｈｙｇｒｏ，Ｃｅｌｌｅｃｔａ）により、Ｃａｓ９を安定して発現するＨｅＬａまたはＵ２ＯＳ細胞を作製した。その後のレンチウイルスによる以下に表示するｇＲＮＡ配列の導入（ベクター：カタログ番号ＳＶＣＲＵ６ＵＰ－Ｌ， Ｃｅｌｌｅｃｔａ）後に、プールされた集団としてノックアウト細胞株が生成した。プールされた集団を、ピューロマイシン（２ｕｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３日間選別し、ｇＲＮＡの導入の７～９日後に実験に使用した。再構成実験に使用するＡＴＧ１６Ｌ１＿ＫＯのクローンを単離した。ｇＲＮＡ配列（５’→３’）を表２に示す。

ｃＤＮＡ発現構築物
野生型及びＫ４９０Ａ変異マウスＡＴＧ１６Ｌ１を、既報に記載のとおり（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ２０１８）、ｐＢａｂｅ－Ｐｕｒｏ－Ｆｌａｇ－Ｓ－ｔａｇプラスミドにクローニングした。ｐＢａｂｅ－Ｂｌａｓｔ－ＧＦＰ－ＬＣ３Ａは既報である（Ｆｌｏｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢ ２０１１）。表３に一覧を掲載した構築物は、本検討に使用するために生成させた。

表示したエピトープタグを有するｃＤＮＡ構築物を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）、エントリークローンとして提供した。Ｇａｔｅｗａｙ組換えを使用して、カセットをｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはレンチウイルスベクターにシャトルし、Ｔｅｔ－Ｌｅｎｔｉ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＵＳＡによって合成）と呼ばれるテトラサイクリン誘導性の発現を可能にした。

細胞培養
以下に説明する検討では、Ｕ２ＯＳ、ＨｅＬａ、及びＲＡＷ２６４．７細胞株を使用し、これらの細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。細胞株は、慣用の試験によりマイコプラズマを含まないことを検証した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターで培養した。別段の明記がない限り、細胞培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＲＡＷ２６４．７野生型及びＡＴＧ１６Ｌ１＿ＫＯ細胞はＡｎｎｅ Ｓｉｍｏｎｓｅｎ（Ｌｙｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢ）から提供され、ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。

試薬
バフィロマイシンＡ１、ＰＩＫ－ＩＩＩ、及びＡＺＤ８０５５はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入した。ＭＬ－ＳＡ１及びＭＫ６－８３はＴｏｃｒｉｓから購入した。モネンシン、ニゲリシン、サリノマイシン、バリノマイシン、及びＬＬｏＭｅはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｃ８はＣｈｅｍｓｈｕｔｔｌｅ（カタログ番号１８７４１７）を通じて購入可能である。

ウイルスの産生及び形質導入
ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡまたはＣａｓ９ウイルス及びｃＤＮＡ過剰発現ウイルスのレンチウイルス産生のために、８×１０^５ ２９３ＦＴ細胞を６ウェルプレートに播種した。翌日、リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、細胞を、１．５μｇのレンチウイルスバックボーンと共に、レンチウイルスパッケージングミックス（１μｇ ｐｓＰＡＸ２及び０．２５μｇ ＶＳＶ－Ｇ）でトランスフェクトした。４８時間後に２９３ＦＴ細胞から上清を除去し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してシリンジろ過した。次いで、ポリブレンを８μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、標的細胞を終夜感染させた。次に、細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４時間回復させた後に、１ｍｇ／ｍＬ ネオマイシン（Ｇ４１８：Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２μｇ／ｍＬ ピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、または５００μｇ／ｍＬ ハイグロマイシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて７２時間選別を行った。

レトロウイルス感染は、既報に記載のとおり（Ｇａｍｍｏｈ，ｅｔ ａｌ．，ＮＳＭＢ ２０１３）、遠心分離を使用して実施した。安定集団は、ピューロマイシン（２ｍｇ／ｍＬ）またはブラストサイジン（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いて３～５日間選別を行った。

細胞溶解及びウエスタンブロット法
全細胞溶解液の調製のために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を最終濃度１％まで添加したＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号９８０６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びプロテアーゼ阻害剤錠剤（ＥＤＴＡを完全に含まず、Ｒｏｃｈｅ）で細胞を溶解した。Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を逐次的に通過させることによって溶解液を均一化し、Ｌｏｗｒｙ ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によってタンパク質レベルを定量した。タンパク質を６×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳローディングバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）中、１００℃で５分間変性させた。

膜画分を調製するために、前日に１．５×１０^６細胞を６ｃｍの組織培養ディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。製造元のプロトコルに従って、ＭＥＭ－ＰＥＲキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞画分を調製した。Ｌｏｗｒｙ ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によってタンパク質レベルを定量化し、６×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳローディングバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）中で変性させた。

ウエスタンブロット法のために、Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ＴＧｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で等量の総タンパク質を分離した。標準的な方法を使用してタンパク質をニトロセルロースに移し、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を含むＴＢＳ中の５％脱脂粉乳（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で膜をブロックした。一次抗体を、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＴＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で希釈し、膜と共に４℃で終夜インキュベートした。ＨＲＰ結合二次抗体をブロッキング溶液（１：２０，０００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で希釈し、膜と共に室温で１時間インキュベートした。ウエスタンブロットを、Ｗｅｓｔ ＰｉｃｏＰＬＵＳ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＣＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）及びフィルム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して展開した。

免疫沈降
細胞をＩＰ ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液：プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ）及びカリキュリンＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した、０．３％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ β－グリセロールリン酸、１０ｍＭピロリン酸、４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２中で溶解した。溶解液を遠心分離によって清澄化し、上述のように平衡化した。ＦＬＡＧ ＩＰの場合、溶解液を抗Ｍ２ ＦＬＡＧ結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、１ｍｇのタンパク質当たりのベッド容積１０μＬで、穏やかに揺動させながら４℃で１時間インキュベートした。ＭＹＣ ＩＰについては、溶解液を、抗ｍｙｃ ９Ｅ１０結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の１ｍｇのタンパク質当たりのベッド容積１０μＬでインキュベートした。次いでビーズを遠心分離し、溶解緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降物を、１００℃で５分間、６×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳローディングバッファーを添加することによって溶離させた。

免疫蛍光分析及びハイコンテントイメージング解析
表示した処理の後、ＧＦＰ－ＬＣ３ ＬＡＭＰ１－ＲＦＰ発現細胞を、氷冷メタノールを用い、－２０℃で３分間固定化した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｎソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ）を使用する、４０倍、開口数（ＮＡ）１．４０の油浸対物レンズを備えた共焦点Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ）を使用して画像取得を行った。

定量化のために、ＧＦＰ－ＬＣ３顆粒の数を、複数の視野にわたる２０個を超える細胞についてカウントした。共局在定量化のために、ＬＡＭＰ１－ＲＦＰに関してＧＦＰ－ＬＣ３顆粒を評価した。

初代ＢＭＤＭにおけるＬＣ３及びＬＡＭＰ１染色のために、細胞を１８ｍｍカバーガラス上に播種した。翌日、細胞を表示したように処理し、細胞を上述のように氷冷メタノールで固定化した。次いで、細胞をＰＢＳ＋５％ＢＳＡ中で１時間ブロックした後に、一次抗体（抗ＬＣ３Ａ／Ｂ、ＣＳＴカタログ番号４１０８、１：１００；抗ＬＡＭＰ１、ＢＤ＃５５５７９８、１：１００）を添加し、４℃で終夜、ブロッキングバッファーで希釈した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光二次抗体を含むブロッキングバッファー溶液と共に、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＤＡＰＩと共にインキュベートし、Ｐｒｏｌｏｎｇ抗退色試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してスライドガラス上に載置した。

マウスマクロファージの内因性ＴＦＥＢ染色のために、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定化し、ＰＢＳ中で洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）／ＰＢＳ中で５分間透過処理した。次いで細胞を、一次抗体（抗ＴＦＥＢ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ３０３－６７３Ａ、１：２００）及び二次抗体について上記のように処理した。Ｚｅｎソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ）を使用する、４０倍、開口数（ＮＡ）１．４０の油浸対物レンズを備えた共焦点Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ）を使用して画像取得を行った。解析はＩｍａｇｅ Ｊを使用して実施した。核サイトゾル定量化のために、２つの独立した実験で３０細胞のＤＡＰＩマスク対サイトゾル中のＴＦＥＢの蛍光強度の比を測定した。

ハイコンテントイメージ取得のために、細胞を９６ウェル、ガラス底、黒色壁のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５８９２）または３８４ウェル、ポリスチレン製、黒色壁のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８１０９１）に播種し、７０％のコンフルエンシーまで終夜培養した。表示したとおりに処理を行った。細胞を－２０℃のメタノール中または４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のいずれかで１０分間固定化した。１：１のＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬｉＣｏｒ）／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）及び１％正常ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液中、室温で１時間、細胞をブロックし且つ透過処理した。上記のブロッキングバッファー中、４℃で終夜、一次抗体を添加した。プレートを、ＥＬ－４０６プレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用してＰＢＳで洗浄した後に、二次Ａｌｅｘａ結合抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をブロッキング溶液中で１：１，０００に希釈し、室温で１時間加えた。次いで、細胞を上述のようにＰＢＳ中で再度洗浄し、ＩＮＣＥＬＬ ６５００ハイコンテントイメージャー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して撮像した。ＧＥ ＩｎＣａｒｔａソフトウェアを使用して画像を解析した。

相関ＦＩＢ－ＳＥＭ
細胞を３５ｍｍガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ、カタログ番号Ｐ３５Ｇ－２－１４－ＣＧＲＤ）に播種した。これらを、４％ホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ Ｆ０１７、１６％ｗ／ｖ溶液、ホルムアルデヒド－メタノールを含まず）の０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４（ＰＢ）の溶液により、４℃で３０分間固定化した。これらをＰＢ中で洗浄し、倒立共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０）で、４０倍／ＮＡ１．４の対物レンズを用いて撮像した。さらなる固定化を、２％ホルムアルデヒド及び２．５％グルタルアルデヒド（ＴＡＡＢ Ｇ０１１／２、２５％溶液のグルタルアルデヒド）のＰＢ溶液を用いて２時間実施し、その後さらなる処理を行った。

既報に記載のプロトコル（３８、３９）を使用して試料を包埋した。上記細胞をＰＢ中で５回洗浄し、１％四酸化オスミウム（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒ１０２３，４％溶液の四酸化オスミウム）及び１．５％フェロシアン化カリウム（ｖ／ｖ）（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｐ３２８９－１００Ｇ、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム三水和物）中、氷上で１時間、後固定化を行った。次いで、試料を脱水し、Ｈａｒｄ－Ｐｌｕｓ Ｒｅｓｉｎ８１２（ＥＭＳ、カタログ番号１４１１５）中に包埋した。これらの試料を６０℃で７２時間重合させた。ブロックを液体窒素中に浸漬することにより、樹脂からカバーガラスを取り外した。グリッドの痕跡を使用してブロック表面上の対象となる領域（ＲＯＩ）の位置決めを行った後、弓のこを使用してアルミニウムスタブに収まるようにブロックを切断し、かみそりの刃で形を整えた。次いで上記ブロック／スタブを、Ｓａｆｅｍａｔｉｃ ＣＣＵ－０１０スパッタコーター（Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して２０ｎｍのＰｔでコーティングして、導電性表面を形成した。

上記ブロック／スタブをＺｅｉｓｓ ５５０ ＣｒｏｓｓＢｅａｍ ＦＩＢ ＳＥＭのチャンバ内に載置し、１０ｋＶの電子ビームを使用して表面を撮像して、グリッド及び下にある細胞の位置を特定した。ＲＯＩが特定されたところで、Ａｔｌａｓソフトウェア（Ｆｉｂｉｃｓ）を使用してシステムを作動させた。樹脂に溝を切削して標的細胞を露出させ、１．５ｋＶの電子ビームを使用し、７ｎｍの等方性解像度で連続的なＳＥＭ画像を取得した。３Ｄ画像解析については、Ａｔｌａｓソフトウェアを使用して画像スタックを処理し、ＩｍａｇｅＪを使用して表示した。

ＲＮＡの単離及びＲＮＡｓｅｑ分析
ＲＮＡの単離
Ｔｒｉｚｏｌ抽出及びＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＭＳＯまたは２μＭ Ｃ８で２４時間処理した細胞から全ＲＮＡを調製した。合計２μｇのＲＩＮスコアが９．８を超えるＲＮＡをＲＮＡｓｅｑ分析に供した。

ライブラリ調製、ＨｉＳｅｑ配列決定及び解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用い、製造元（ＮＥＢ，ＭＡ）の説明書を使用して、ＲＮＡ配列決定ライブラリを調製した。ｍＲＮＡをＯｌｉｇｏｄ（Ｔ）ビーズで濃縮し、濃縮したｍＲＮＡを９４℃で１５分間フラグメント化した。これに続いて、第１のストランド及び第２のストランドのｃＤＮＡ合成を実施した。ｃＤＮＡフラグメントを末端修復し、３’末端のアデニル化を行った。ついで、ｃＤＮＡフラグメントにユニバーサルアダプターを連結し、続いてサイクル数を制限したＰＣＲにより、インデックスの付加及びライブラリの濃縮を行った。ＲＮＡｓｅｑ用の配列決定ライブラリ及びＲＮＡ試料を、Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光硬度計（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用してＲＮＡの完全性を確認した。

上記配列決定ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００システム上のフローセルの単一のレーン上に、製造元の説明書に従ってクラスター化した。試料を、２×１５０ｂｐのＰａｉｒｅｄ Ｅｎｄ（ＰＥ）配置を使用して配列決定した。画像解析及びベースコールをＨｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＨＣＳ）によって実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑで作成された生の配列データ（．ｂｃｌファイル）をｆａｓｔｑファイルに変換し、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ２．１７ソフトウェアを使用して逆多重化した。インデックス配列の特定には、１つのミスマッチを許容した。配列の読み取りデータを、ＳＴＡＲアライナーｖ．２．５．２ｂを使用して、ＥＮＳＥＭＢＬで利用可能なホモサピエンス参照ゲノムバージョンＧＲＣｈ３８にマッピングした。ユニークな遺伝子のヒット数を、Ｓｕｂｒｅａｄパッケージｖ．１．５．２のカウント機能を使用して計算した。エクソン領域内にあるユニークな読み取りデータのみをカウントした。

カウントデータをｔｒｉｍｍｅｄ ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ－ｖａｌｕｅｓ正規化（ＴＭＭ）法によって正規化し、続いて分散を推定し、一般化線形モデル（ＧＬＭ）を適用し、デジタル遺伝子発現の経験的解析（４０）由来の関数を利用して、既報（４１、４２）に記載のように、示差的に発現する遺伝子を識別した。これらの線形モデルを各因子の組み合わせの係数でフィッティングし、次いで２つの実験の次元（Ｃ８刺激及び遺伝子型の状態：ＡＴＧ１６Ｌ１ＫＯ及び野生型）におけるそれぞれの「微分の微分」解析のコントラストを同時に抽出することにより、要因分析を分析に組み込んだ。関連するｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）法を使用して、複数のテストにおいて偽陽性率を制御するために調整した（ＢＨ調整済みｐ＜０．０５）。

経路及び生物学的過程のエンリッチメント解析は既報に記載のように行った（４２、４３）。簡単に言えば、データをＫＥＧＧ経路及びジーンオントロジーの生物学的プロセスから調査した。各モジュールまたはカテゴリを、ゲノム中の遺伝子のグローバルセットでの表現と比較して、差次的に発現する遺伝子間の統計的エンリッチメントまたは過剰表現について評価した。Ｐ値は超幾何検定を使用して計算した。

Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ染色
対照ｇＲＮＡを発現するＵ２ＯＳ．Ｃａｓ９細胞またはＡＴＧ１６Ｌ１をノックアウトしたＵ２ＯＳ．Ｃａｓ９細胞を、２μＭ Ｃ８で２４時間処理した。次に、細胞を洗浄し、加温したイメージングバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、及び５％ｖ／ｖ ＦＢＳ）中で希釈した２５ｎＭ Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｗｅｒ）及びＨｏｅｃｓｈｔ ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｗｅｒ）で２０分間、生存状態でインキュベートした。染色液を除去し、細胞をイメージングバッファー中でさらに３０分間インキュベートした後に、ＩＮＣＥＬＬ ６５００で画像を取得した。ＧＥ ＩｎＣａｒｔａソフトウェアを使用して画像を解析した。

ＡＴＧ１６Ｌ１ Ｋ４９０Ａノックインマウスモデルの生成
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬の直接接合子注入を介して、Ｋ４９０Ａ点変異を導入した。簡単に言えば、一本鎖ガイド配列を設計し、Ｄｈａｍａｃｏｎ製ｔｒａｃｒＲＮＡと共に合成した。修復ドナー一本鎖ＤＮＡ配列を、Ｋ４９０Ａ点変異を導入し、ＰＡＭ配列を変異させて、既に編集されたＤＮＡへのＣａｓ９複合体の再ターゲティングを阻止するように設計した。これらの試薬を組換えＣａｓ９と共にマウス接合子に注入した。これらの注入から生まれた子供の遺伝子型をＴｒａｎｓｎｅｔｙｘによって特定し、ヘテロ接合体の初代を野生型マウスと交配させ、純粋なヘテロ接合体の動物を得た。さらに交配することにより、Ｋ４９０Ａ変異に対するホモ接合体のマウスが得られた。マウスをＢａｂｒａｈａｍ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｕｎｉｔにおいて、特定の無菌条件下で飼育した。
Ｋ４９０Ａガイド配列：
ＧＵＵＡＧＧＧＧＣＣＡＵＣＡＣＧＧＣＵＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１９）
修復ドナーｓｓＤＮＡ：

骨髄由来マクロファージの単離
Ｃ５７／ＢＬ６野生型及びＡＴＧ１６Ｌ１ Ｋ４９０Ａマウス（１３～１５週齢）を使用して、骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）を得た。脛骨及び大腿骨をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗い流すことによって骨髄細胞を単離した。細胞をペレット化し、１ｍＬの赤血球溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に室温で２分間再懸濁した。細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２２４０９－０３１）、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ カタログ番号ＡＦ－３１５－０２）を添加した５０μＭ ２－メルカプトエタノール、及び５０ｎｇ／ｍＬ Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（アムホテリシンＢ）（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１５２９００１８）中に再懸濁した。３日目及び６日目に培地を新しいものと交換し、８日目に細胞を播種してアッセイを行った。

ＨＥＫ２９３ ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂ ＡＴＧ１３／ＡＴＧ１６Ｌ１＿ＤＫＯ細胞
ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した、ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂを安定して発現するＡＴＧ１３＿ＫＯ ＨＥＫ２９３細胞を既報に記載のとおり（Ｊａｃｑｕｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ２０１７）使用した。ＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯを生成させるために、ＢｐｉＩ部位を含有させるためのオーバーハングを有するｇＲＮＡ配列（ＧＴＧＧＡＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣ（配列番号２１））をアニーリングし、ＢｐｉＩ制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＥＲ１０１１）を用いて消化したｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ，４８１３８；Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ博士によって寄託）にクローニングした。上記組換えプラスミドを、マウスＡＴＧ１６Ｌ１変異体を発現するｐＢａｂｅ－ｐｕｒｏ構築物（Ａｄｄｇｅｎｅ，１７６４；Ｈａｒｔｍｕｔ Ｌａｎｄ博士によって寄託）と共に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介してＨＥＫ２９３ ＡＴＧ１３＿ＫＯ ＧＦＰ－ＬＣ３Ｂ細胞にトランスフェクトした。細胞を２．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｐ８８３３，Ｓｉｇｍａ）を用いて４８時間選別し、限界希釈により単個細胞クローンを得た。クローン増殖後、ウエスタンブロットによって検出されるＡＴＧ１６Ｌ１タンパク質が存在しないことに基づいて、ＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯクローンを選別した。

ライブイメージングタイムラプス共焦点顕微鏡法
ＨＥＫ２９３細胞を３５ｍｍガラス底ディッシュ（Ｍａｔｔｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に播種した。Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｅスタンド、Ｎｉｋｏｎ ６０倍、ＮＡ１．４５の油浸レンズ、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ－Ｘスキャンヘッド、Ａｎｄｏｒ ｉＸｏｎ ８９７ ＥＭ－ＣＣＤカメラ、及びＡｎｄｏｒレーザーコンバイナーを備えた回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して、２分毎に画像を取得した。生細胞を用いたすべての撮像は、３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーションチャンバ内で実施した。画像の取得及び解析は、Ａｎｄｏｒ ｉＱ３（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＫ）及びＩｍａｇｅＪを使用して実施した。

内因性カルシウムの撮像
Ｈｅｌａ野生型及びＨｅｌａ ＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯ細胞をトリプシン処理し、ＰＤＬコーティングしたＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏプレートに、ウェル当り２００００個で２時間播種した。細胞に１０μＬのカルシウム６色素溶液を室温で１．５時間ロードした。インキュベーション後に、上記色素をプレートから除去し、１０μＬの、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、１ｍＭ ＥＧＴＡ、及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むｐＨ７．４の低Ｃａ^２＋溶液に交換した。１ｍＭ ＥＧＴＡを用いると、Ｍａｘｃｈｅｌａｔｏｒソフトウェアに基づいて、遊離Ｃａ^２＋濃度は１０ｎＭ未満と推定される。低カルシウム溶液を用いて化合物プレートを調製した。細胞及び化合物プレートをＦＬＩＰＲ上に載置し、１５分間のプロトコルを実行した。４７０ｎｍにおける蛍光強度をモニターした。最初の１０秒間のベースライン読み取りの後、化合物を細胞に添加した。１５分間撮像して、Ｃａ^２＋蛍光に対する影響をモニターした。データを最大－最小相対蛍光単位（ＲＦＵ）としてエクスポートした。

組換えタンパク質の発現
ＦＬＣＮ／ＦＩＮＰ２及びＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰの精製
完全長のヒトＦＮＩＰ２及びＦＬＣＮを、（２１）に記載のようにサブクローニングし、且つ精製した。最終的な精製複合体を、バッファーＡ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＥＧＴＡ、及び０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）中で、液体窒素により瞬間凍結させた。完全長のヒトＧＡＢＡＲＡＰ（１－１１７）を、ｐＥＴ２１ｂ中のＧＳＳＧＳＳリンカーによって分離されたＣ末端ＭＢＰタグ（ＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰ）でサブクローニングし、ＬＢ中、１６℃で１６時間誘導した後に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、及び１５μｇ／ｍＬベンズアミジン中で溶解し；超音波処理し；遠心分離によって清澄化した。ＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰを、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）中で平衡化させたアミロース樹脂を使用して精製し、洗浄緩衝液＋３０ｍＭマルトースで溶離させた。上記タンパク質を、バッファーＡ中で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製し、液体窒素中で瞬間凍結した。

ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２／ＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰ複合体の精製
精製したＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰをＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２と１：０．８の比率で混合し、４℃で２時間穏やかに混合した。この試料をバッファーＡ中で予備平衡化させたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ）カラム（１ＣＶ＝２４ｍＬ）上に注入した。ピーク画分の保持時間をＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２及びＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰ単独と比較し、続いて１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した評価を行った。

インビトロＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ－ＧＡＢＡＲＡＰ複合体の分析
精製したＧＡＢＡＲＡＰ＿ＭＢＰをＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２と１：０．８の比率で複合体化し、４℃で２時間穏やかに混合した。次いでこの試料を、バッファーＡ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．４）で予備平衡化させたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ）カラム（１ＣＶ＝２４ｍＬ）上に注入した。画分（０．５ｍＬ）を採取し、これらの試料を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。

ＧＥＥケミカルフットプリンティング
ＧＥＥ標識化学及び質量分析技法を使用したＧＡＢＡＲＡＰ－ＭＢＰのＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２との相互作用の調査。上記ＧＡＢＡＲＡＰ－ＭＢＰ及びＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２タンパク質試料を、１×ＰＢＳ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰの緩衝液、ｐＨ７．８に緩衝液交換した。ＧＡＢＡＲＡＰ－ＭＢＰ：ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２タンパク質複合体を形成するために、７．５μＭのＧＡＢＡＲＡＰ－ＭＢＰと１．２５μＭのＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２を混合して、ＧＡＢＡＲＡＰ－ＭＢＰとＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２のモル比を６：１に維持した。遊離ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２のタンパク質濃度を１．２５μＭに調整した。すべての試料を、０、２．５、５、及び６．５分間ＧＥＥにより標識し、続いて１０％ＴＣＡ／アセトンで沈殿させて、タンパク質を浄化した。次いで、試料を１０ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＭ）及び２５ｍＭ ＤＴＴで、それぞれ還元ならびにアルキル化し、トリプシンにより３７℃で終夜消化し、その後Ａｓｐ－Ｎにより３７℃で８時間消化した。トリプシンとＡｓｐ－Ｎの両方を、１：１０（ｗ：ｗ）の酵素：タンパク質比でタンパク質試料に添加した。次に、消化された試料を、連結した液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏ－ＡＣＱＵＩＴＹ）と高分解能質量分析（Ｅｃｌｉｐｓｅ）によって分析した。ＭＳデータをＭａｓｓ Ｍａｔｒｉｘソフトウェア及び手動で解析し、各ペプチドについて用量応答プロットを得た。遊離ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２の結果をＧＡＢＡＲＡＰ－ＭＢＰ－ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ２複合体と比較した。これらの検討に対する標準的なアプローチは、当該ペプチドレベルにおける、複合体形成時の標識（保護）の全体的な減少を評価することであり、全体的に有意に保護されたペプチドについては、その個々の保護についてこれらのペプチド内の各残基の修飾を調べることである。

イオン恒常性と酸性のｐＨとは、密接に連携したリソソームの分解能力の決定因子であり、これらの特性が変化することにより疾患が起こる可能性がある。リソソーム膜チャネルがイオンフラックスを制御することは公知であるが、如何にしてかかる変化がリソソームによって局所的に感知され、当該の細胞が如何にして応答するかは明確になっていない。本実施例は、リソソームのイオンバランスの特定の薬理学的変化により、ＡＴＧ５－ＡＴＧ１２－ＡＴＧ１６Ｌ１オートファジー結合機構が、ｖＡＴＰアーゼ依存的にリソソーム表面へとリクルートされることを示している。ＡＴＧ１６Ｌ１のＣ末端ＷＤ４０ドメインのＡＴＰアーゼ非依存性リクルートにより、ＡＴＧ８ホモログがオートファジー非依存性の形態でリソソーム膜に直接結合が可能になる。結合した、ＬＣ３タンパク質ではなくＧＡＢＡＲＡＰが、ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ腫瘍抑制因子複合体をリソソームに隔離することは重要である。ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ隔離によりＲａｇＣ／Ｄのヌクレオチド型の制御が抑止され、それによりｍＴＯＲ非依存性の形態での転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）の核蓄積が生じる。この新規なＡＴＧ１６Ｌ１－ＧＡＢＡＲＡＰ－ＦＬＣＮ－ＴＦＥＢ軸は、リソソームネットワーク内のイオンバランスの崩壊に応答して、リソソームの生合成を促進する。

例１
本例は、リソソームイオンチャネルＴＲＰＭＬ１の活性化によって、オートファジーに依存することなく、ＡＴＧ８がリソソーム膜に結合することを示す。ＡＴＧ８ホモログ（ＬＣ３及びＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのＡＴＧ８ホモログ）は、オートファゴソームのマーカーとして広く使用されており、オートファゴソームは、サイトゾルの内容物を、分解及びリサイクルするためにリソソームへ送達することを媒介する、二重膜が結合した構造である（１）。但し、ＡＴＧ８タンパク質はエンドサイトーシス系内の一重膜オルガネラにも結合することができるが、この修飾の機能的な結果は十分には解明されていない（２～６）。一重膜ＡＴＧ８結合（ＳＭＡＣ）は、リソソーム向性及びイオノフォア／プロトノフォア様特性を示すが分子標的をもたない薬物によって誘導することができる（７、８）。エンドリソソームイオン勾配の変化がＡＴＧ８結合のトリガーとして機能するかどうかを調べるために、リソソーム一過性受容体電位ムコリピンチャネル１（ＴＲＰＭＬ１）の薬理学的アゴニストを使用して、内腔イオン濃度を急激に変化させた。その過程で、オルガネラの恒常性の維持を担う新規な機序が見出された。

ＴＲＰＭＬ１アゴニストＭＫ６－８３（９）、ＭＬ－ＳＡ１（１０）、または最近発表されたより強力なチャネルアゴニスト（化合物８「Ｃ８」と命名）（１１）による処理により、野生型（ＷＴ）細胞とオートファジー欠損細胞の両方において、ＬＣ３が、その細胞質の「Ｉ」型から脂質付加された顆粒状の「ＩＩ」型へと急速に転化した。対照的に、オートファゴソーム生合成を誘導する十分に確立された薬剤であるｍＴＯＲ阻害剤ＡＺＤ８０５５は、ＷＴにおいてはＬＣ３脂質付加を制御することができたが、オートファジー欠失細胞においては制御することができなかった（１２）（図１、２、及び３）。ＡＺＤ８０５５またはＥＢＳＳ飢餓は、ＶＰＳ３４阻害に敏感な形態でＬＣ３の転化を誘導し、ｖＡＴＰアーゼ阻害剤バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）では増強された（図４）。Ｃ８による処理により、ｍＴＯＲ活性に影響を与えることなくＢａｆＡによって阻害されたＶＰＳ３４非依存性のＬＣ３の脂質付加が安定して誘導された（図４）ことは興味深い。この急速な脂質付加はＴＲＰＭＬ１に依存し（図５）、リソソームのアルカリ化及び膜損傷を伴うことはなかった（図６）。まとめると、これらの特徴はＳＭＡＣの特徴であり、ＳＭＡＣにおいてはＡＴＧ８がエンドリソソーム膜に結合している（７）。これと整合して、ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる処理により、ＡＴＧ８（ＬＣ３ＢまたはＧＡＢＡＲＡＰＬ１）のリソソームマーカーＬＡＭＰ１との強力な共局在も誘導された（図７及び８）。最近の発見は、非オートファゴソーム膜へのＡＴＧ８の結合には、ＡＴＧ１６Ｌ１のＣ末端ＷＤリピート内のＫ４９０などの別個の残基が必要であることを示しているが、これはオートファゴソーム形成には不要である（１３）。オートファジー欠失（ＡＴＧ１３ ＫＯ）細胞を操作して、このＡＴＧ１６Ｌ１ドメインの機能を単離し、ＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯ細胞にＡＴＧ１６Ｌ１変異体Ｋ４９０Ａを導入すると、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（Ｃ８など）によって誘導されるＬＣ３顆粒形成が消失することがわかった（図９）。さらに超微細構造光電子相関顕微鏡法（ＣＬＥＭ）により、リソソームに特徴的なＧＦＰ－ＬＣ３構造が明らかになった（図１０）。ＡＴＧ１６Ｌ１のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ含有液胞膜へのリクルートには、ｖＡＴＰアーゼＶ０ＣサブユニットとＡＴＧ１６Ｌ１との間の相互作用が必要であることが最近報告され（８）、このリクルートは、細菌のエフェクタータンパク質ＳｏｐＦによってブロックされた。図１１は、ｖＡＴＰアーゼによるＡＴＧ１６Ｌ１リクルートのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳｏｐＦ障害の図を示す。ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（Ｃ８）で処理すると、ＳｏｐＦの誘導がＬＣ３－ＩＩ形成を十分にブロックしたが、標準的なオートファジー誘導剤（且つｍＴＯＲ阻害剤）ＡＺＤ８０５５で処理してもブロックされなかった（図１１）。次に、図１２に示すように、一重膜ＡＴＧ８結合を特異的に破壊する、ＡＴＧ１６Ｌ１ Ｋ４９０Ａ変異のノックインマウスモデルを生成させた。マウスは生存可能で明白な表現型を示さず、ＡＴＧ１６Ｌ１のＣ末端ドメイン全体が欠失するマウスの特性評価と一致した（１６）。初代骨髄由来マクロファージはこれらの動物から単離し、図１２に示すように、ＴＲＰＭＬ１アゴニストＣ８及びＭＬ－ＳＡ１のいずれかでの処理後の野生型細胞においてＬＡＭＰ１と共局在したＬＣ３顆粒形成は、ＡＴＧ１６Ｌ１^{Ｋ４９０Ａ}細胞では発生しなかった。ＡＴＧ１６Ｌ１^{Ｋ４９０Ａ}変異に対するこの感受性は、ｍＴＯＲ阻害剤ＡＺＤ８０５５で処理した細胞においては観測されなかった。まとめると、これらのデータは、ＴＲＰＭＬ１活性化によって、オートファゴソーム生合成とは異なるが、ｖＡＴＰアーゼに依存する過程でＡＴＧ８ホモログ（ＬＣ３など）の脂質付加及びリソソームへの共局在が誘導されることを示唆している。これは、エンドリソソームＡＴＧ８結合の誘導因子として使用することができる、規定された分子標的を有する小分子の最初の例であることを表している。

例２
本例は、ＡＴＧ１６Ｌ１依存性のＡＴＧ８の一重膜への結合が、リソソームイオンフラックスの変化時のＴＦＥＢの活性化及びリソソーム生合成にとって重要であることを示している。イオンチャネルＴＲＰＭＬ１を介したリソソームカルシウムの放出によって、転写因子ＴＦＥＢ及びＴＦＥ３の核移行が生じることが知られており、これはおそらく、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３を脱リン酸化するホスファターゼカルシニューリン（ＣａＮ）の局所的な活性化に起因する（１４）。ＣａＮの薬理学的阻害剤及びＣＲＩＳＰＲを介した必須制御サブユニットＰＰＰ３Ｒ１の欠失を使用すると、イオノマイシン処理時に標準的なＣａＮ標的ＮＦＡＴ１の移行が強力に阻害されたが、ＴＲＰＭＬ１アゴニストによるＴＦＥＢの活性化におけるＣａＮの役割は観測されなかった（図１３及び図１４）。ＴＲＰＭＬ１アゴニスト誘導性のＡＴＧ８結合がＴＦＥＢの活性化に関与しているかどうかを判定するために、ｖＡＴＰアーゼへのＡＴＧ１６Ｌ１のリクルートをブロックする細菌エフェクターであるＳｏｐＦの発現が、ＴＲＰＭＬ１活性化に応答してＴＦＥＢの核蓄積をブロックできるかどうかを測定した。ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した細胞におけるＳｏｐＦの発現は、ＳｏｐＦ陰性対照と比較してＴＦＥＢ核蓄積を阻害したが、ＳｏｐＦ発現は、ＡＺＤ８０５５での処理時にＴＦＥＢの活性化に影響を及ぼさなかった（図１５）。さらに、ｖＡＴＰアーゼ活性及びリソソームＡＴＧ８結合を阻害するＢａｆＡ１との同時処理は、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（ＭＫ６－８３及びＣ８）がＴＦＥＢを活性化することを妨げたが、ＢａｆＡ１とｍＴＯＲ阻害剤ＡＺＤ８０５５による細胞の共処理はＴＦＥＢの活性化を妨げなかった（図１６）。これらの結果は、内腔イオンフラックスの変化に続くリソソーム膜へのＡＴＧ８タンパク質の結合におけるｖＡＴＰアーゼの役割と一致している。

ＢａｆＡ１による処理によりリソソームＣａ^２＋貯蔵の枯渇も生じる可能性があることから、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ５、またはＡＴＧ７（オートファジーＡＴＧ８（例えば、ＬＣ３）結合機構の構成要素）のＣＲＩＳＰＲ媒介性欠失を介してＡＴＧ８脂質付加事象を消失させた。ＴＦＥＢの活性化は、ＡＴＧ８結合が欠失している細胞（ＡＴＧ５ ＫＯ、ＡＴＧ７ ＫＯ、及びＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯ）においては完全にブロックされたが、ＦＩＰ２００、ＡＴＧ９Ａ、またはＶＰＳ３４のノックアウトによってオートファジーが欠失している細胞においてはブロックされなかった（図１７）ことが見出されたことは、驚くべきことである。ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（Ｃ８）によるＴＦＥＢの活性化は、ＡＴＧ１６Ｌ１のノックアウトまたはＢａｆＡ１との同時処理に対して感受性であったが、栄養飢餓（ＥＢＳＳ）時のＴＦＥＢの活性化は、ＢａｆＡ１処理またはＡＴＧ１６Ｌ１のノックアウトに対して非感受性であった（図１８）ことは重要であり、このことは、リソソームイオンフラックスの変化に続くＴＦＥＢ制御の機序が多様且つ特異的であることを示唆している。これらの結果は、管腔イオンフラックスの変化に続くリソソーム膜へのＡＴＧ８タンパク質の結合におけるｖＡＴＰアーゼの役割と一致する。イオノフォア特性を示し、一重膜ＡＴＧ８結合を制御する他の薬物（７）も、ＡＴＧ１６Ｌ１依存性またはＢａｆＡ１感受性の形態でＴＦＥＢを活性化することが明らかになっている（図１９）ことは興味深く、このことは、リソソームのイオンバランスの崩壊が、ＴＦＥＢを活性化するための共通のトリガーとしての役割を果たしている可能性があることを示唆している。

一重膜ＡＴＧ８結合の役割をさらに分離するために、ＡＴＧ１６Ｌ１ノックアウト細胞を、ＦＩＰ２００結合変異体（ΔＦＢＤ）及びＣ末端ドメイン切断（ΔＣＴＤ）（それぞれ、オートファゴソームまたは一重膜結合が欠失する）（１３）を含む数種のＡＴＧ１６Ｌ１対立遺伝子で再構成した。図２０に示すように、野生型ＡＴＧ１６Ｌ１（ＷＴ）及びＡＴＧ１６Ｌ１－ΔＦＢＤ（ΔＦＢＤ）を有する細胞においてはＴＦＥＢの活性化が生じたが、ＴＲＰＭＬ１アゴニストＣ８で処理した後のＡＴＧ１６Ｌ１－ΔＣＴＤ（ΔＣＴＤ）細胞においては生じなかった。さらに、ＷＤ４０点変異ＡＴＧ１６Ｌ１－Ｆ４６７Ａ（Ｆ４６７Ａ）及びＡＴＧ１６Ｌ１－Ｋ４９０Ａ（Ｋ４９０Ａ）で再構成された不死化ＡＴＧ１６Ｌ１ ＫＯマウスマクロファージは、ＴＲＰＭＬ１アゴニスト（例えば、Ｃ８及びＭＬ－ＳＡ１）の存在下でＴＦＥＢの活性化を示さなかった（図２１）。ｍＴＯＲ阻害剤ＡＺＤ８０５５が、ＡＴＧ１６Ｌ１の状態にかかわりなくＴＦＥＢを活性化したことは重要である。これらの観測結果は、ＡＴＧ１６Ｌ１ ＷＤ４０ドメインがリソソーム膜へのＡＴＧ８結合を制御すること、及びこれがＴＲＰＭＬ１アゴニストによるＴＦＥＢの活性化に重要であることを示している。機能的なＴＦＥＢ転写活性化を確認するために、本発明者らは、確立された標的遺伝子（例えば、ＦＬＣＮ及びＳＱＳＴＭ１）（１５）の発現をモニターし、且つＡＴＧ１６Ｌ１依存性、ＢａｆＡ１感受性の形態でのＴＲＰＭＬ１活性化時の上方制御を観測した。カルシニューリン阻害剤ＦＫ５０６との同時処理は、ＡＺＤ８０５５またはＣ８による処理後の遺伝子発現に影響を与えなかった（図２２）。

核局在化時に、ＴＦＥＢはリソソームの生合成を担う主要な転写因子として機能する（１５）。ＴＲＰＭＬ１依存性トランスクリプトーム応答は、ＡＴＧ１６Ｌ１に大きく依存し、リソソーム機能に関与する多数のＴＦＥＢ標的遺伝子を含んでいた（図２３及び図２４）ことは注目に値する。このプロファイルと一致して、ＴＲＰＭＬ１活性化によって、ＡＴＧ１６Ｌ１依存性の形態でＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ陽性オルガネラの数及び強度の両方が増加することが判明した（図２５）。まとめると、これらの観測結果は、リソソームイオンバランスの変化に続いて、ＡＴＧ１６Ｌ１のＷＤ４０ドメインがリソソームＳＭＡＣを制御すること、及びこのことがＴＦＥＢの活性化及びリソソーム生合成に必要であることを示している。

例３
本例は、ＧＡＢＡＲＡＰがＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１複合体をリソソーム表面に隔離して、ＲａｇＧＴＰアーゼによるＴＦＥＢサイトゾル保持を妨げることを実証する。ＴＦＥＢの活性化におけるＡＴＧ８結合機構（例えば、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ７、及びＡＴＧ３）の上記の新規な役割を仮定し、その原因となる分子機序を検討した。哺乳動物ＡＴＧ８ホモログには、ＭＡＰ１ＬＣ３ファミリーの３つのメンバー（ＬＣ３Ａ／Ｂ／Ｃ）及びＧＡＢＡ Ａ型受容体関連タンパク質ファミリーの３つのメンバー（ＧＡＢＡＲＡＰ／Ｌ１／Ｌ２）が含まれる（１７）。コンビナトリアルＣＲＩＳＰＲノックアウトアプローチを使用して、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質が、ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した際のＴＦＥＢの活性化に特異的に関与していることが判明した（図２６）。公開された相互作用のデータベースを通じて報告された結合パートナーの分析は、ＬＣ３タンパク質ではなくＧＡＢＡＲＡＰの、ＴＦＥＢ制御因子ＦＬＣＮ及びＦＮＩＰ１／２との相互作用は特有であることを示唆した（１８、１９）。共免疫沈降分析により、ＧＡＢＡＲＡＰがＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体と相互作用することが可能であるが、ＬＩＲ依存性相互作用に必要なＧＡＢＡＲＡＰのＬＩＲドメインドッキング部位（ＬＤＳ）に変異を含むＧＡＢＡＲＡＰタンパク質は、上記ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体をプルダウンできないことが明らかになった（図２７及び図２８）。

リソソームイオンフラックスの変化に応答して、ＧＡＢＡＲＡＰがリソソーム膜に直接結合することにより、ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のサイトゾルからリソソーム膜への再分布が可能になるという仮説を立てた（図２９）。実際に、ＴＲＰＭＬ１活性化に続いて、膜結合性ＦＬＣＮ及びＦＮＩＰ１の急速且つ安定した増加が観測され、この増加はＧＡＢＡＲＡＰタンパク質の発現に依存していた（図３０）。さらに、図３１に示すように、ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した細胞は、対照と比較して、リソソームタンパク質ＬＡＭＰ１とのＦＬＣＮの共局在の亢進を示した。リソソーム膜への特異的なリクルートを確認するために、リソソームを迅速に精製するための手段として使用することができるリソソーム特異的マーカーである３ＸＨＡ－ＴＭＥＭ１９２タンパク質を発現するように、細胞を操作した（３６）。リソソームの精製により、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質が関与するＴＲＰＭＬ１アゴニスト処理の１５分以内に、ＦＬＣＮ及びＦＮＩＰ１が安定してリクルートされることが明らかになった（図３２）。ＦＬＣＮのリソソーム局在化は栄養飢餓時にも発生し、該局在化において、ＦＬＣＮはＲａｇＡ^ＧＤＰに特異的に結合し、抑制性リソソームフォリクリン複合体（ＬＦＣ）を形成する（２１、２２）。しかしながら、ＬＦＣの一部であるＲａｇｕｌａｔｏｒ複合体構成成分ＬＡＭＴＯＲ１が欠失した細胞では、ＴＲＰＭＬ１活性化が依然としてＦＬＣＮ膜リクルートを誘導し、このことは、ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ１のＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離がＬＦＣ形成とは異なるプロセスであることを示している（図３３）。

ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰのＧＡＰ活性に対するＬＦＣ形成の阻害的役割（２１、２２）と同様に、リソソームへのＧＡＢＡＲＡＰ依存性のＦＬＣＮのリクルートも、ＲａｇＣ／ＲａｇＤに対するＧＡＰ活性を阻害するであろうとの仮説を立てた。これは、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１がそのＧＡＰ機能をリソソーム表面から離れたＲａｇＣ／Ｄに向けて発揮し、ＲａｇＣ／Ｄ^ＧＤＰ結合状態とその後のＲａｇＣ／Ｄ結合依存性ＴＦＥＢサイトゾルの保持を促進することを示唆するであろう（２３、２４）。実際に、ＲａｇＧＴＰアーゼ二量体は、摂食条件下でリソソームと動的に相互作用することが明らかになっている（２５）。これを試験するために、ＮＰＲＬ２ ＫＯ細胞を使用し、上記細胞は、飢餓時に構成的なＲａｇＡ／Ｂ^ＧＴＰ及びＦＬＣＮの不完全なリソソーム局在化を有する（２６）。ＦＬＣＮのノックアウトにより、栄養豊富な条件下、野生型及びＮＰＲＬ２ ＫＯ細胞の両方において、ＴＦＥＢが完全に核移行し、このことは、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１が、リソソーム表面から離れたＲａｇＣ／Ｄに対してＧＡＰとして作用して、ＴＦＥＢを制御するというモデルを支持する（図３４）。さらに、ＮＰＲＬ２ ＫＯ細胞では、ＬＦＣが形成されないことに起因して飢餓時にＴＦＥＢを活性化することができない一方、ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した細胞はＴＦＥＢを活性化する能力を保持しており、ＲａｇＧＴＰアーゼに対するＦＬＣＮの継続的なＧＡＰ活性の阻害と一致する（図３４）。しかし、活性状態でロックされたＲａｇＧＴＰアーゼ（ＲａｇＢ^Ｑ９９Ｌ／ＲａｇＤ^Ｓ７７Ｌ）の発現は、もはやＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１によって制御されず、ＴＲＰＭＬ１活性化後のＴＦＥＢ及びそのホモログＴＦＥ３の移動度シフトを抑制したが、ＡＺＤ８０５５では抑制しなかった（図３５）。ＦＬＣＮのＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離は、ＴＲＰＭＬ１に依存することなく生じる場合もあり（図３６）、このことは、ＴＦＥＢ制御のこの機序が、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質のリソソーム以外の膜コンパートメントに対する結合を生じさせる他の刺激と広く連動している可能性があることを示唆している。まとめると、リソソームイオン含有量の変化時のＴＦＥＢの活性化は、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１複合体がＲａｇＣ／Ｄに対してＧＡＰ活性を発揮することができないリソソーム表面への、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１複合体のＧＡＢＡＲＡＰ依存性の繋ぎ止め（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に依拠しているように思われる。これにより、ＲａｇＣ／Ｄ^ＧＴＰ型が安定化し、且つこの複合体からＴＦＥＢが解放され、ＴＦＥＢの核への移行及びＴＦＥＢ依存性リソソーム生合成が可能になる（図３７）。

例４
この例では、ＦＮＩＰタンパク質上の新規なＧＡＢＡＲＡＰの結合部位を解明し、ＬＩＲドメインに対するＡＴＧ８ファミリータンパク質の選択性に関与する重要なアミノ酸残基を特定する。ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体内のＧＡＢＡＲＡＰの結合部位をマッピングするために、各タンパク質を組換えにより作製し、標準的な技法を使用して精製した。ＧＡＢＡＲＡＰをインビトロでＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体に結合させ、サイジングカラム上で同時精製することができた（図３８）。

ＧＥＥ標識技法を使用して、ケミカルフットプリンティングアプローチに取り組んだ（３７）。この方法では、共有結合性プローブを対象となるタンパク質と共にインキュベートする。上記プローブはアスパラギン酸及びグルタミン酸残基に結合することとなり、このパターンをタンパク質消化及び質量分析計へのロード時に分析することができる。本実験に関しては、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ２複合体の標識パターンを確立した。次に、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ２複合体をＧＡＢＡＲＡＰと共にインキュベートし、ＧＥＥ標識を再度実施し、何れの残基が結合から保護され、したがって何れの残基がＧＡＢＡＲＡＰとＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ２の間の結合部位を構成するかを判定した。図３９に示すように、複合体試料（ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ＋ＧＡＢＡＲＡＰ）に対して遊離試料（ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ単独）において標識が増加していることによって証明されるとおり、ＦＮＩＰ２における特定の領域が保護されていると考えられた。各残基についてＫ遊離／Ｋ複合体の比率を計算し、１．６を超える比率を保護に関して有意であるとみなした。上記特定の保護領域は、ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の構造表示内で赤色で強調表示されている。この特定の配列には、ＦＮＩＰ１及びＦＮＩＰ２の両方で保存されている、既報のないＬＩＲドメイン（ＹＶＶＩ）が含まれていた。

上記特定されたＦＮＩＰの領域が、ＧＡＢＡＲＡＰとＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体との相互作用を媒介することを確認するために、ＦＮＩＰ１のＬＩＲドメイン中に点変異を生成させた（ＹＶＬＶ＞ＡＶＬＡ）。共免疫沈降実験により、ＧＡＢＡＲＡＰがＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ１複合体と相互作用するためには、ＬＩＲドメインＹＶＬＶを必要とすることが確認された（図４０）。ＦＮＩＰ１ ＬＩＲ中の変異は、ＦＮＩＰ１とＦＬＣＮの間の相互作用に影響を与えなかった（図４１）。

次に、ＨｅＬａバックグラウンドにおけるＦＮＩＰ１／ＦＮＩＰ２二重ノックアウト細胞を創生した。ＦＮＩＰ１／２ ＤＫＯでは、持続的な核局在化及びＴＦＥＢ転写標的ＧＰＮＭＢの発現の増加によって証明されるとおり、ＦＬＣＮ ＧＡＰ活性が完全に喪失し、且つＴＦＥＢ及びＴＦＥ３転写因子が構成的に活性化された（図４２）。次いで、これらの細胞を、ＷＴ－ＦＮＩＰ１またはＬＩＲ変異－ＦＮＩＰ１のいずれかで再構成した。プールされたＦＮＩＰ１を発現するＤＫＯ細胞の集団は、構成的なＴＦＥＢ／ＴＦＥ３核局在化の一部が回復したことを示した。これらの細胞が栄養不足に陥ると、発現されるＦＮＩＰ１変異体にかかわりなく、ＴＦＥＢ及びＴＦＥ３が正常に活性化された。しかしながら、ＴＲＰＭＬ１アゴニストで処理した場合には、ＴＦＥＢの核局在化は、ＷＴ－ＦＮＩＰ１を発現する細胞でのみ観測され、ＬＩＲ変異体ＦＮＩＰ１変異体を有する細胞では観測されなかった（図４３Ａ及び図４４Ａ～Ｂ）。図４３Ｂに示すように、ＦＮＩＰ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）細胞のＷＴまたはＬＩＲ（ＬＩＲ変異体Ｙ５８３Ａ／Ｖ５８６Ａ）ＦＮＩＰ１による再構成によって、ＴＲＰＭＬ１アゴニストに対するＧＡＢＡＲＡＰの相互作用の機能的要件が明らかになったが、ＥＢＳＳではなく、ＴＦＥＢの活性化であった。ＴＲＰＭＬ１アゴニストによる長期の処理時に、機能的なＴＦＥＢ転写応答が標的遺伝子ＧＰＮＭＢのタンパク質レベルによって測定された。ＦＮＩＰ１－ＬＩＲ変異細胞においてＧＰＮＭＢ発現が完全にブロックされた（図４４Ｄ）。ＡＺＤ８０５５処理時には、ＴＦＥＢが安定して活性化されたにもかかわらず、ＧＰＮＭＢタンパク質レベルも大幅に低下した。このことが、タンパク質の翻訳の同時阻害が、ＴＦＥＢ転写の活性化の有効範囲を如何に縮小させる可能性があるかを際立たせている（図４４Ｄ）。ＦＮＩＰ１の調整によってＡＴＧ８結合は変化しなかった（図４３Ｂ）。これらの知見により、ＦＮＩＰタンパク質との直接的な相互作用を介した、ＧＡＢＡＲＡＰ依存性のＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体の再局在化が、リソソームイオンフラックスの変化時のＴＦＥＢの活性化にとって重要であることが確認される。

例５
この例では、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質が細胞内膜に結合している如何なる場合にも、ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰの高親和性隔離を介してＴＦＥＢが活性化される可能性があるという概念を検討する。したがって、選択的なオートファジー、マイトファジー、及びゼノファジーの異なる形態を調査した。パーキン依存性マイトファジーの間にＴＦＥＢの活性化が起こることが明らかになっており（４７）、図４５及び４６に示すように、この活性化にはＧＡＢＡＲＡＰタンパク質が関与していた。さらに、ＬＩＲ変異体ＦＮＩＰ１を安定して発現する細胞ではＴＦＥＢの活性化に欠陥があり、このことにより、ＦＬＣＮのミトコンドリアへのＧＡＢＡＲＡＰ依存性再局在化が機構的にＴＦＥＢの活性化をマイトファジーに結びつけることが確認された（図４７）。過去の研究において、ＦＬＣＮ及びＦＮＩＰが脱分極時にミトコンドリアに局在化する可能性があることが観測されており（４８）、本明細書で明らかになったＴＦＥＢ活性化の機序が上記との関連性を示していることは興味深い。Ｋｅｉｍａ蛍光シフトアッセイを用いてマイトファジーを測定する近接制御マイトファジーシステムを使用して（４９）（図４８及び４９）、ミトコンドリア脱共役剤に依存しないＴＦＥ３移行及びＦＬＣＮ再分布のＧＡＢＡＲＡＰ依存性が確認された（図５０）ことは重要である。

最後に、ゼノファジーのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染モデルを使用して、ＴＦＥＢの活性化がＧＡＢＡＲＡＰ媒介性ＦＬＣＮ隔離によって制御されているかどうかを判定した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の一部がオートファジー機構によって迅速に標的化にされ、ＡＴＧ８ホモログで装飾された状態になる（５０）。Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが、細菌エフェクターＳｏｐＦを介してＡＴＧ８応答に拮抗することが最近見出された（８）。ＡＴＧ８タンパク質がＴＦＥＢの活性化に関与しているとすると、ΔｓｏｐＦ Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、ＡＴＧ８結合の増加に起因して、ＷＴよりも大きなＴＦＥＢの活性化を示すことになるという仮説を立てた。実際に、ΔｓｏｐＦ Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにより、感染後のより長い期間、より高い割合の細胞において、安定してＴＦＥＢが活性化された（図５１～５３）。ＴＦＥＢの活性化は、ＧＡＢＡＲＡＰファミリーメンバーの欠失（ＲＡＰ＿ＴＫＯ）によって鈍化したが、ＬＣ３アイソフォームのノックアウト（ＬＣ３＿ＴＫＯ）による影響は受けなかった（図５４～５６）ことは重要である。ＦＬＣＮの局在化も調査し、ＦＬＣＮの顕著な再局在化によってＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ含有液胞膜が覆われることが判明した（図５７）。この再局在化にはＧＡＢＡＲＡＰタンパク質が関与しており、このことは、ＦＬＣＮのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ液胞へのＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離によって、感染時にＴＦＥＢが活性化されることを示している（図５７）。まとめると、選択的なオートファジーのこれらのマイトファジー及びゼノファジーの例が、ＦＬＣＮの異なる細胞膜へのＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離が、ＴＦＥ３／ＴＦＥＢ転写因子の活性化を選択的オートファジーの開始に結び付ける、普遍的な機序としての役割を果たす可能性があることを際立たせている。

図５８に示すように、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ ＧＡＰ複合体は、ＲａｇＣ／ＤのＧＤＰ結合型を促進することにより、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３転写因子のｍＴＯＲ依存性リン酸化及びサイトゾル保持を決定的に制御する。上述のように、ＧＤＰ結合型ＲａｇＣ／ＤはＴＦＥＢ／ＴＦＥ３に直接結合し、且つＴＦＥＢ／ＴＦＥ３をｍＴＯＲの基質として提示する（中央の挿入図）。栄養飢餓時（区画Ａ）には、リソソーム膜へのＦＬＣＮ－ＦＮＩＰのリクルートが、ＲａｇＣ／Ｄに対するＧＡＰ活性が低下したリソソームフォリクリン複合体（ＬＦＣ）の形成を支援する。これはｍＴＯＲＣ１阻害と同時に起こる。ＬＦＣ形成とは独立に、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質はＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体に直接結合し、多様な細胞内膜においてＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体を隔離する（区画Ｂ）。この膜リクルートは、エンドリソソームイオンの破壊及び選択的オートファジーの形態（ゼノファジー及びマイトファジー）に応答したＴＦＥＢの活性化に必要である。このことは、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰがサイトゾルＲａｇＣ－ＧＴＰを制御し、且つＦＬＣＮ－ＦＮＩＰの細胞内膜上への隔離によってこの基質へのアクセスが低下し、Ｒａｇ結合の障害に起因するＴＦＥＢ／ＴＦＥ３の核内保持が可能になることを示唆する。ＦＬＣＮの栄養制御とは異なり、この新規なＴＦＥＢ活性化経路はｍＴＯＲＣ１の活性に寛容である。ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ複合体の一重膜及び二重膜の両方への細胞内再分布は、エンドリソソームネットワーク内の恒常性及び摂動を伴うリソソームの能力を広範に調整する役割を果たす。

要約すると、本明細書では、リソソーム一重膜ＡＴＧ８結合（ＳＭＡＣ）の上に組織化された、これまで認識されていない分子機序が記載される。リソソームイオンレベルの変化により、栄養状態には依存しないがＡＴＧ５－ＡＴＧ１２－ＡＴＧ１６Ｌ１結合機構を含む、ＴＦＥＢ核局在化への新規な調節入力（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｐｕｔ）の存在が明らかになった。ＳＭＡＣにより、おそらく宿主－病原体応答の一部として、エンドリソソーム経路内の機能不全を高感度で検出することが可能である。ＡＴＧ８ホモログのエンドリソソーム膜への結合は、病原体病原性因子、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＳｏｐＦ（８）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＣｐｓＡ（２７）、及びＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＲａｖＺ（２８）によって頻繁に阻害される。最近、ファゴソームイオン勾配の破壊がΔＳｏｐＦ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ含有液胞のＡＴＧ８修飾をトリガーし、これが液胞の破裂及びゼノファジーに先行することが提案された（８）。本明細書に記載のリソソームＳＭＡＣ－ＴＦＥＢ活性化の機序は、一重膜ＡＴＧ８結合の作用に帰する初めての機序である。実際に、ＳＭＡＣの誘導は、細胞保護／抗菌遺伝子のＴＦＥＢ依存性転写（２９）とリソソーム生合成を結び付けて、病原体感染を制限する役割を果たす可能性がある。さらに、ＳＭＡＣの誘導因子はオートファゴソーム生合成のマーカーを喚起することができ（３０）、後者は最近ＴＲＰＭＬ１活性化因子を用いて明らかになった（３１）。最後に、これらのデータにより、ＴＦＥＢ／ＴＦＥ３活性の主要な制御因子としての、ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ腫瘍抑制因子複合体の新規な制御機序が明らかになっている（１９、３２）。ＦＬＣＮのＧＡＢＡＲＡＰ依存性隔離はＴＲＰＭＬ１に依存することなく生じる可能性もあり（図３６）、このことは、このＴＦＥＢ制御の機序が、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質のリソソーム以外の膜コンパートメントへの結合を生じさせる他の刺激と広範に結びつく可能性があることを示唆している。シグナル伝達モジュレーターとしてのＧＡＢＡＲＡＰの機能は、基質分解及び小胞融合以外のＡＴＧ８タンパク質の新規な役割を意味する。このユビキチン様恒常性応答が病的条件下で如何に調節されるかをさらに理解することは、エンドリソソーム系に影響を与える治療法の新たな機会を提供する可能性がある。

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５． Ｈｅｃｋｍａｎｎ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＬＣ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ β－ａｍｙｌｏｉｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ．１７８，５３６－５１（２０１９）．
６． Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄ．Ｒ．，Ｇｒｅｅｎ，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｃｅｌｌ．１７７，１６８２－９９（２０１９）．
７． Ｆｌｏｒｅｙ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖ－ＡＴＰａｓｅ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ ＬＣ３ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１１，８８－９９（２０１５）．
８． Ｘｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ｖ－ＡＴＰａｓｅ－ＡＴＧ１６Ｌ１ ａｘｉｓ ｔｈａｔ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｘｅｎｏｐｈａｇｙ．Ｃｅｌｌ．１７８，１－１５（２０１９）．
９． Ｃｈｅｎ，Ｃ－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ＴＲＰＭＬ１ ｍｕｔａｎｔ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＶ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．，５，１－１０（２０１４）．
１０． Ｓｈｅｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｂｌｏｃｋ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａ ＴＲＰ ｃｈａｎｎｅｌ ａｎｄ ｌｙｏｓｏｍａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．３，１－１１（２０１２）．
１１． Ｌｉａｎｇ．，Ｃ．，Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｔｒｐｍｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．ＷＯ２０１８／００５７１３Ａ１．Ｊａｎ ４（２０１８）．
１２． Ｃｈｒｅｓｔａ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＺＤ８０５５ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ ｏｒａｌｌｙ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ ＡＴＰ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０，２８８－９８（２０１０）．
１３． Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＷＤ４０ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＡＴＧ１６Ｌ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＣ３ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．３７，ｅ９７８４０（２０１８）．
１４． Ｍｅｄｉｎａ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ａｎｄ ＴＦＥＢ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７，２８８－９９（２０１５）．
１５． Ｓａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２５，４７３－７（２００９）．
１６． Ｒａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＡＴＧ５－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＡＴＧ１６Ｌ１ ｍａｉｎｔａｉｎ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＷＤ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＬＣ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１５，５９９－６１２（２０１９）．
１７． Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔ．，Ｌａｍａｒｋ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ＡＴＧ８ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＬＩＲ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｃａｒｇｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４３２，８０－１０３（２０２０）．
１８． Ｄｕｎｌｏｐ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．ＦＬＣＮ，ａ ｎｏｖｅｌ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＧＡＢＡＲＡＰ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＵＬＫ１ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１０，１７４９－１７６０（２０１４）．
１９． Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＦＬＣＮ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＴＦＥ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｉｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．５，ｅ１５７９３（２０１０）．
２０． Ｐｅｔｉｔ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｎ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０２，１１０７－１１２２（２０１３）．
２１． Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｙ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６６，９７１－９７７（２０１９）．
２２． Ｓｈｅｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ２－Ｒａｇ－Ｒａｇｕｌａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ．１７９，１３１９－１３２９（２０１９）．
２３． Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ｔｏ－ｎｕｃｌｅｕｓ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｓｅｎｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｖｉａ ｍＴＯＲ ａｎｄ ＴＦＥＢ．ＥＭＢＯ Ｊ．３１，１０９５－１１０８（２０１２）．
２４． Ｍａｒｔｉｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｒ．，Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ．Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＴＦＥＢ ａｎｄ ＭＩＴＦ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００，４７５－９１（２０１３）．
２５． Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｕｔｒｉｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍＴＯＲＣ１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｔｓ Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅ－Ｒａｇｕｌａｔｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０，１０５２－１０６３（２０１８）．
２６． Ｍｅｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓ．Ｍ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ．ＧＡＴＯＲ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＦＬＣＮ－ＦＮＩＰ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１７，２７６５－２７７６（２０１８）．
２７． Ｋｏｓｔｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ＬＣ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ＬＣＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｐｓＡ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１４，Ｅ８７１１－Ｅ８７２０（２０１７）．
２８． Ｃｈｏｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＲａｖＺ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｏｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ａｔｇ８ ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３８，１０７２－６（２０１２）．
２９． Ｖｉｓｖｉｋｉｓ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎａｔｅ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＴＦＥＢ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４０，８９６－９０９（２０１４）．
３０． Ｊａｃｑｕｉｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ａ ｐａｒａｌｌｅｌ ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｄｒｉｖｉｎｇ ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＬＣ３ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．１３，８５４－８６７（２０１７）．
３１． Ｓｃｏｔｔｏ Ｒｏｓａｔｏ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＴＲＰＭＬ１ ｌｉｎｋｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｔｏ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣａＭＫＫβ／ＶＰＳ３４ ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１０，５６３０（２０１９）．
３２． Ｗａｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＦＬＣＮ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３０，２５５１－２５６４（２０１６）．
３３． Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｅ，ａｎｄ Ｒ．Ｚｏｎｃｕ，Ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ａｓ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１，１３３－１４２（２０１９）．
３４． Ｌｉｕ，Ｇ．Ｙ．，ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，ｍＴＯＲ ａｔ ｔｈｅ ｎｅｘｕｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｇｒｏｗｔｈ，ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１，１８３－２０３（２０２０）．
３５． Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＴＯＲＣ１ ｐａｔｈｗａｙ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ Ｂｉｒｔ－Ｈｏｇｇ－Ｄｕｂｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ（２０２０）．
３６． Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｖＡＴＰａｓｅ ａｎｄ ｍＴＯＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｆｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５８，８０７－８１３（２０１７）．
３７． Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｅｔｈｏｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３１２，７８－８６（２０１２）．
３８． Ｋｉｓｈｉ－Ｉｔａｋｕｒａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２７，４０８９－４１０２（２０１４）．
３９． Ｋｉｓｈｉ－Ｉｔａｋｕｒａ，Ｃ．，ａｎｄ Ｆ．，Ｂｕｓｓ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＣＬＥＭ） ｔｏ ｓｔｕｄｙ ＰＩＮＫ１／Ｐａｒｋｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７５９，２９－３９（２０１８）．
４０． ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４０，４２８８－９７（２０１２）．
４１． Ｂｏｕｚｉａｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５６，４４－５０（２０１７）．
４２． Ｂｏｕｚｉａｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｒｉｎｅ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＴＨ１ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．２４，６７７－６８８（２０１８）．
４３． ＤｅＪｅｓｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｒ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｕｆｍｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２．ｅＬｉｆｅ．５，ｅ１７２９０（２０１６）．
４４． Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｌ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗ．Ｍ．Ｌｉｎｅｈａｎ．ＦＬＣＮ：Ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｂｉｒｔ－Ｈｏｇｇ－Ｄｕｂｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｇｅｎｅ．６４０，２８－４２（２０１８）．
４５． Ｐｅｒｅｒａ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｔｏｙｋｏｖａ，Ｓ．，Ｎｉｃｏｌａｙ，Ｂ．Ｎ．，Ｒｏｓｓ，Ｋ．Ｎ．，Ｆｉｔａｍｅｎｔ，Ｊ．，Ｂｏｕｋｈａｌｉ，Ｍ．，Ｌｅｎｇｒａｎｄ，Ｊ．，Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｖ．，Ｓｅｌｉｇ，Ｍ．Ｋ．，Ｆｅｒｒｏｎｅ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｒｉｖｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ．５２４，３６１－５（２０１５）．
４６． Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，Ｙａｎｏ，Ｊ．，Ｈｔｗｅ，Ｈ．Ｈ．，Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｒ．，Ｃａｋｉｒ，Ｚ．，Ｉｔｕａｒｔｅ，Ｔ．，Ｗｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｇ．Ｅ．，Ｚｏｎｃｕ，Ｒ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｐｅｒｅｒａ．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｏｆｅｒｌｉｎ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏ ｅｎａｂｌｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ．ｂｉｏＲｘｉｖ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０１．０４．４２５１０６（２０２１）．
４７． Ｎｅｚｉｃｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｆｏｇｅｌ，Ａ．Ｉ．，ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｙｏｕｌｅ．ＭｉＴ／ＴＦＥ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｒｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎ ａｎｄ ＡＴＧ５．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１０，４３５－５０（２０１５）．
４８． Ｈｅｏ，Ｊ－Ｍ．，Ｏｒｄｕｒｅａｕ，Ａ．，Ｓｗａｒｕｐ，Ｓ．，Ｐａｕｌｏ，Ｊ．Ａ．，Ｓｈｅｎ，Ｋ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｈａｒｐｅｒ．ＲＡＢ７Ａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＴＢＫ１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ ｖｉａ ｔｈｅ ＰＩＮＫ－ＰＡＲＫＩＮ ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．４，ｅａａｖ０４４３（２０１８）．
４９． Ｌａｚａｒｏｕ，Ｍ．，Ｓｌｉｔｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｋａｎｅ，Ｌ．Ａ．，Ｓａｒｒａｆ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｂｕｒｍａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｉｄｅｒｉｓ，Ｄ．Ｐ．，Ｆｏｇｅｌ，Ａ．Ｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｙｏｕｌｅ．Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＩＮＫ１ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ．５２４，３０９－３１４（２０１５）．
５０． Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｃ．，Ｂａｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｂｒｕｍｅｌｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖａｃｕｏｌｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１，１１３７４－１１３８３（２００６）．

等価物
当業者であれば、本明細書に記載の発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または通常の実験のみを使用して確認することができよう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されているとおりである。

Claims (42)

1. ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、
   ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜と、
   ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分と
   を含むシステムをＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させ、その結果、前記膜における前記ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体のレベルが上昇するステップを含む前記方法。
2. 前記ＬＡＭＰ－１、ｖＡＴＰアーゼ、またはＧＡＢＡＲＡＰを含む膜がコンパートメントを画成する、請求項１に記載の方法。
3. 前記コンパートメントがリソソームであるか、またはリソソームを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記膜がリソソーム膜であるか、またはリソソーム膜を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記リソソーム膜がインタクトなリソソームの一部である、請求項５に記載の方法。
6. 前記リソソームが細胞中に存在する、請求項３または請求項６に記載の方法。
7. ｍＴＯＲＣ１活性に依存しないＴＦＥＢの活性化方法であって、ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む前記方法。
8. 前記投与するステップが、
   リソソーム膜と、
   ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分と
   を含むシステムを前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストと接触させることを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記システムが、
   結合機構タンパク質をコードする遺伝子（結合機構遺伝子）及び／または
   ＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＬＣＮ／ＦＮＩＰ複合体の成分をコードする遺伝子
   中に多型または変異を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記結合機構遺伝子が、Ａｔｇ３、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、Ａｔｇ１２、Ａｔｇ１６Ｌ１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記結合経路遺伝子がＡｔｇ１６Ｌ１である、請求項１０記載の方法。
12. 前記多型がＴ３００Ａである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストが、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、金属、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化学的分類のＴＲＰＭＬ１アゴニストである、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
14. 前記投与するステップが、前記システムを前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストに曝露することであって、前記システムにおいて、１種以上のＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現もしくは活性、及び／または検出可能なエキソサイトーシス活性、オートファジー、リソソーム貯蔵物質のクリアランス、及びリソソーム生合成の１種以上が、前記曝露の前のそれらと比較して亢進されることが観測されるのに十分な条件下且つ十分な時間で上記曝露することを含む、請求項８に記載の方法。
15. 前記投与するステップが、前記システムを前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストに曝露することであって、前記システムにおいて、表１から選択される１種以上の遺伝子の発現または活性が、前記曝露の前のそれと比較して亢進されることが観測されるのに十分な条件下且つ十分な時間で上記曝露することを含む、請求項８に記載の方法。
16. 前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストが、ＣＬＥＡＲネットワーク遺伝子の発現に対する影響について評価された場合に、飢餓条件下で観測される影響よりも制限された影響を示すことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
17. 前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストが、前記アゴニストの存在下でのＴＲＰＭＬ１のレベルもしくは活性が、同等の条件下で前記アゴニストの非存在下よりも高いことを特徴とする、請求項１または請求項７に記載の方法。
18. 前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストが、ＴＲＰＭＬ１と相互作用するという点で直接型アゴニストである、請求項１または請求項７に記載の方法。
19. 前記ＴＲＰＭＬ１アゴニストが、ＴＲＰＭＬ１と直接相互作用しないという点で間接型アゴニストである、請求項１または請求項７に記載の方法。
20. ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病の治療方法であって、前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、もしくは疾病に罹患している、または罹患しやすい対象にＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与するステップを含む前記方法。
21. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病が炎症性疾病であるか、または炎症性疾病を含む、請求項２０記載の方法。
22. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病がリソソーム蓄積障害であるか、またはリソソーム蓄積障害を含む、請求項２０に記載の方法。
23. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病がポリグルタミン障害であるか、またはポリグルタミン障害を含む、請求項２０記載の方法。
24. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病が神経変性タンパク質症であるか、または神経変性タンパク質症を含む、請求項２０記載の方法。
25. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病が感染症である、請求項２０記載の方法。
26. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病が、クローン病、ポンペ病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、球脊髄性筋萎縮症、α－１－アンチトリプシン欠乏症、及びマルチプルスルファターゼ欠損症からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
27. 前記ＴＲＰＭＬ１関連疾患、障害、または疾病がクローン病である、請求項２０記載の方法。
28. 細胞内膜表面におけるＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体の局在化を亢進させることによるＴＦＥＢの活性化方法。
29. 前記細胞内膜表面が細胞内コンパートメントのサイトゾル表面である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記細胞内コンパートメントがリソソームである、請求項２９に記載の方法。
31. 前記細胞内コンパートメントがミトコンドリアである、請求項２９に記載の方法。
32. 前記細胞内コンパートメントが小胞体である、請求項２９に記載の方法。
33. ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与することを含む、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. ＴＦＥＢの活性化がｍＴＯＲＣ１活性に依存しない、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の方法。
35. ＴＦＥＢ活性化因子の特性評価方法であって、１つ以上の細胞内膜表面におけるＦＬＣＮ局在化及び／またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体のレベルに対する効果を評価することを含む前記方法。
36. 結合機構関連（「ＣＭＡ」）疾患、障害、もしくは疾病、またはＧＡＢＡＲＡＰ／ＦＮＩＰ／ＦＬＣＮ複合体関連疾患、障害、もしくは疾病の治療方法であって、
    ＴＲＰＭＬ１アゴニストを投与する
    ステップを含む前記方法。
37. 前記疾患、障害、または疾病がクローン病であるか、またはクローン病を含む、請求項２７記載の方法。
38. 細胞アッセイを含む、ＴＦＥＢ、ＴＦＥ３、及び／またはＭＩＴＦの活性化因子の特性評価方法であって、前記細胞アッセイが、
    （ａ）ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤の存在、
    （ｂ）ＡＴＧ８結合機構の遺伝子破壊、
    （ｃ）ＡＴＧ８結合機構の小分子阻害剤の存在、
    （ｄ）タンパク質のＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのメンバーの遺伝子破壊、
    （ｅ）ＦＮＩＰ１もしくはＦＮＩＰ２におけるＬＩＲドメインの変異、または
    それらの組み合わせ
    を含む細胞を含む前記方法。
39. 前記ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤がバフィロマイシンＡ１である、請求項３８に記載の方法。
40. 前記ｖＡＴＰアーゼ小分子阻害剤がサリシリハラミドＡの類似体ではない、請求項３８記載の方法。
41. 前記ＡＴＧ８結合機構の遺伝子破壊が、遺伝子のノックアウト、遺伝子のノックイン、１種以上の変異誘発遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の方法。
42. 前記タンパク質のＧＡＢＡＲＡＰサブファミリーのメンバーの遺伝子破壊が、遺伝子のノックアウト、遺伝子のノックイン、１種以上の変異誘発遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の方法。

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