CN103588872B - 一种维生素d合成抗原、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种维生素D合成抗原及其制备方法，所述维生素D合成抗原为维生素D与蛋白载体的偶联物，所述维生素D为25-羟基维生素D3或1,25-二羟维生素D3，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种。本发明还提供所述维生素D合成抗原在维生素D免疫学检测中的应用。本发明进一步提供维生素D检测试剂盒，其集成了现有临床维生素D检测方法的优点，可适用于所有酶标仪、化学发光仪和时间分辨分析仪，检测时间大大缩短，且灵敏度、准确度、精密度均可满足检测要求。采用本发明的通用性强的免疫吸附检测试剂盒，可实现血清（或血浆）中维生素D的批量、快速检测。

Description

一种维生素D合成抗原、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种维生素D合成抗原、其制备方法及应用。
背景技术
维生素D是体内一类非常重要的维生素，在体内的主要作用是调节钙磷的代谢，同时和机体的健康状态也有很大的关系。
维生素D的主要循环形式是25-羟基维生素D（包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3），它是最重要的维生素D新陈代谢产物，应用广泛。当体内缺乏维生素D时会引起一系列疾病。其中，1,25-二羟基维生素D3的生物学活性最大，1,25-二羟基维生素D3可以促进钙的吸收，并具有其它重要的生物学功能。
由于维生素D的重要性，因此对于体内维生素D的含量检测也越来越受到人们的关注。
由于维生素D的特殊分子结构，长时间以来都没有太好的检测方法，一般来说维生素D的检测花费时间较长，需要特殊的设备等，随着分子生物学技术的发展，目前用于测定25-羟基维生素D3的方法主要有放射竞争性蛋白结合法（CPB），放射免疫法（RIA），高效液相色谱法（HPLC），罗氏的电化学发光法和英国IDS的酶联免疫法等。分别简述如下：
（1）放射竞争性蛋白结合法
WeiS,TanakaH,KuboT等，AmultipleassayforvitaminDmetabolteswithouthigh-performanceliquidchromatography.AnalBiochem,1994,222(2):359-365文献中公开了一种无需HPLC纯化，仅0.5ml血清即可测定血清25（OH）D3含量的方法。主要步骤包括用乙腈提取血清，在C-18/OH柱和硅胶Sep-Pak柱上分离和纯化，最后用维生素D结合蛋白法定量测定25（OH）D3，该方法有简便快速，样本用量少、重复性好、可同时对维生素D的三种主要代谢产物进行定量等优点，但回收率较低。
（2）放射免疫法
《中华妇产科杂志》1993年第3期中报道了用放射免疫法测定血清中的25-（OH）D3，该方法应用放射性元素标记示踪物，检测结果与放射性受体测定法高度相关，具有方法简便，灵敏度高，特异性好等优点，但其缺点在于标记的同位素不稳定，操作时对实验室要求很高，且产生的辐射对操作人员健康有不利影响。
（3）高效液相色谱法
即国标和药典中对维生素D的检测方法。色谱分析法由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合临床大量样本筛查。
（4）电化学发光法
目前罗氏公司采用的是电化学发光法测定血清中的25-（OH）D3，其原理是用电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体，通过抗原-抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测定的抗原或抗体进行定量或定性。但其技术通用性差，需要用专用的设备，且设备成本较高。
（5）酶联免疫检测法
应用ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中的25（OH）D3含量。基本原理是应用竞争酶联免疫分析法测定标本中25（OH）D3水平。用多克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被多抗的微孔中依次加入25（OH）D3（样品）、生物素化的人25（OH）D3抗原、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的25（OH）D3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。此类试剂盒的缺点是用生物素标记25-羟基维生素D3，用HRP标记亲和素，且固相抗体选用多克隆抗体检测，特异性不强，且检测时间过长。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的维生素D合成抗原、其制备方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种维生素D合成抗原，其为维生素D与蛋白载体的偶联物，所述维生素D为25-羟基维生素D3或1,25-二羟维生素D3，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种。其中，所述维生素D与蛋白载体的重量比为1:16~20。
本发明还提供制备上述维生素D合成抗原的方法，包括以下步骤：1）将载体蛋白溶于pH8.5的缓冲液中，得溶液A；2）将维生素D溶于乙醇、二甲基亚砜或吡啶等试剂中，得溶液B；3）分别向溶液A和B中加入活化剂，得到活化的蛋白载体和维生素D；4）以N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二环己基碳二亚胺等为偶联剂，将上述活化的蛋白载体和维生素D进行偶联；5）透析、干燥，即得维生素D合成抗原。
其中，步骤1）中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
步骤3）中所述活化剂为含乙二胺和乙二胺二盐酸盐的磷酸氢二钠溶液、4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液、戊二醛或甲醛等。活化剂优选为含乙二胺和乙二胺二盐酸盐的0.05M磷酸氢二钠溶液pH10.4，其中乙二胺浓度为10%（v/v），乙二胺二盐酸盐浓度为20mg/ml。更优选活化剂为质量比21:80的4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液。
本发明还提供上述维生素D合成抗原在维生素D免疫学检测中的应用，其是将所述维生素D合成抗原与标记物结合作为竞争性抗原，通过与样品中的维生素D竞争结合维生素D单克隆抗体，从而检测样品中的维生素D含量。
其中，所述标记物为:
a）辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
b）吖啶酯类化合物；或
c）螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸（BCPDA）等双功能螯合剂。
所述维生素D单克隆抗体购自英国Abcam公司。
本发明进一步提供维生素D免疫学检测试剂盒，其包括包被维生素D单克隆抗体的酶标板、上述维生素D合成抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原。
其中，所述维生素D单克隆抗体购自英国Abcam公司。
所述标记物为：
a）辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
b）吖啶酯类化合物；或
c）螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸（BCPDA）等双功能螯合剂。
优选前述检测试剂盒中还包括洗涤液、维生素D标准品、底物显色液、反应终止液等中的一种或多种。
本发明首次提供维生素D合成抗原及其制备方法，将小分子的维生素D直接连接于载体蛋白上，并通过在蛋白载体上连接免疫检验用的示踪物，例如辣根过氧化物酶（或碱性磷酸酶）、荧光素（如镧系元素螯合物）、化学发光剂（鲁米诺或吖啶酯）等，因此，可适用于大多数免疫学检测方法。
本发明提供的维生素D检测试剂盒，其集成了现有临床维生素D检测方法的优点，可适用于所有酶标仪、化学发光仪和时间分辨分析仪，实现了一步检测法，与两步法相比，检测时间大大缩短，且灵敏度、准确度、精密度均可满足检测要求。采用本发明的通用性强的免疫吸附检测试剂盒，可实现血清（或血浆）中维生素D的批量、快速检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例125-羟基维生素D3抗原的合成及酶联免疫试剂盒的制备
1.125-羟基维生素D3抗原的合成
A、将100mg牛血清白蛋白（BSA）溶于10mlpH8.50.05M的磷酸盐缓冲液中；
B、将5mg25-羟基维生素D3溶于0.5ml乙醇中，再加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯108mg（预先溶于400μl二甲基甲酰胺中），室温下将所述混合物避光搅拌过夜（一般为16~22h）；
C、向溶解的牛血清白蛋白液中加入2ml含乙二胺和乙二胺二盐酸盐的0.05MpH10.4的磷酸氢二钠溶液（磷酸氢二钠缓冲液中乙二胺浓度为10v/v%，乙二胺二盐酸盐浓度为20mg/ml）,在室温下反应3~4小时；
D、反应完成后向C所得溶液中加入37%甲醛溶液1ml，室温下避光搅拌均匀；
E、将B所得溶液滴加至D的溶液中，室温下避光搅拌过夜；
F、将终产物用0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液透析16小时，每4小时更换一次透析液。
1.2用辣根过氧化物酶(HRP)标记合成抗原
G、称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中；
H、向上述溶液中加入0.2ml新配制的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；
I、将上述溶液装入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
J、向透析后的溶液中加入20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使上述醛化HRP的pH值升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg25-羟基维生素D3合成抗原（预先溶于1ml0.01M碳酸盐缓冲液中），室温避光轻轻搅拌2小时；
K、向其中加入0.1ml新配制的4mg/mlNaBH4溶液，混匀，4℃放置2小时；
L、将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS液透析，4℃过夜；
M、将透析后的溶液转移至合适的容器内，搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置1小时；
N、3000rpm离心30分钟，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵溶液洗二次，最后将沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS液中；
O、将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的磷酸盐缓冲液透析，去除铵离子后，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，-20℃冰冻保存。
1.325-羟基维生素D3的酶联免疫试剂盒的制备
在96孔板上包被25-羟基维生素D3的单克隆抗体（购自英国Abcam公司），以上述得到的标记抗原作为竞争性抗原，配制酶工作液，制备定标血清中值质控血清和高值质控血清（新生牛血清含适量25-羟基维生素D3），配制底物液A（含0.1%过氧化氢、0.1M醋酸钠和10mM柠檬酸）、底物液B（含0.05%四甲基联苯胺、0.2%柠檬酸和10%丙三醇）、样本稀释液（10mmol/L磷酸盐缓冲液）、终止液（2M硫酸）和浓缩洗涤液（含5%Tween20和0.2M磷酸盐缓冲液），即得25-羟基维生素D3检测试剂盒（竞争法酶联免疫试剂盒）。
实施例225-羟基维生素D3抗原的合成及化学发光免疫试剂盒的制备
1.125-羟基维生素D3抗原的合成
A、将100mg卵清蛋白溶于8mlpH8.50.05M的硼酸盐缓冲液中；
B、将25-羟基维生素D35mg溶于0.5ml无水吡啶中；
C、向溶解的卵清蛋白溶液中加入200μl4-二甲氨基吡啶（42mg）和丙酮（200μl）混合液，室温下避光搅拌过夜；
D、向B的溶液中加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯108mg（预先溶于400μl二甲基甲酰胺），室温下将所述混合物避光搅拌过夜；
E、将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10mg溶于1mlpH8.50.05M的硼酸盐缓冲液中，然后滴加至D和C的混合液中，室温下避光搅拌过夜；
F、将终产物用0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液透析16小时，每4小时更换一次透析液。
1.2用吖啶酯标记合成抗原
G、取25-羟基维生素D3合成抗原1mg溶于800μl磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH8.0）中；
H、取吖啶酯20μl溶于180μlDMF中；
I、取吖啶酯溶液160μl分4次加入抗原溶液中，每次加入后摇匀，室温避光反应20min；
J、反应结束后加入赖氨酸（50mg/ml）400μl，放置15min以终止反应；
K、用磷酸盐缓冲液（10mmol/L，pH6.3）4℃避光透析24小时，期间换液6次；
L、取葡聚糖凝胶G-25作为层析柱填料纯化，柱（0.8cm×34cm）预先用PBS（10mmol/L，pH6.3）平衡，上样后用同一缓冲液洗脱，分布收集，测量收集管发光强度，高峰管合并4℃保存备用。
1.325-羟基维生素D3的化学发光免疫试剂盒的制备
在96孔板上包被25-羟基维生素D3的单克隆抗体（购自英国Abcam公司），以上述得到的标记抗原作为竞争性抗原制备标记物溶液，配制样本稀释液（10mmol/L磷酸盐缓冲液）、底物液A（含0.1M硝酸和0.1M过氧化氢）、底物液B（含0.2M氢氧化钠和2%TritonX-100）、浓缩洗液（含5%Tween20和0.2M磷酸盐缓冲液），、定标血清、中值质控血清和高值质控血清（新生牛血清含适量25-羟基维生素D3），即得25-羟基维生素D3检测试剂盒（竞争法化学发光免疫试剂盒）。
实施例31,25-二羟基维生素D3抗原的合成及时间分辨免疫试剂盒的制备
1.11,25-二羟基维生素D3抗原的合成
A、将80mg血蓝蛋白溶于5mlpH8.50.05M的Tris-盐酸缓冲液中;
B、将1,25-二羟基维生素D35mg溶于0.6ml二甲基亚砜中溶解；将3.5mg赖氨酸及3mg1-羟基苯并三氮唑溶于0.25ml二甲基乙酰胺中，加入16μlN,N'-二环己基碳二亚胺，室温下摇床反应1小时，再加入1.5mg4-二甲氨基吡啶，将混合液加入1,25-二羟基维生素D3的二甲基亚砜溶液中，室温避光搅拌反应5小时，产物真空干燥；
C、向溶解的血蓝蛋白溶液中逐滴加入2ml戊二醛，充分混匀；
D、将B中得到的产物溶于0.5ml二甲基亚砜，并向其中滴加血蓝蛋白溶液，37℃恒温摇床反应2h；
E、将终产物用0.015MpH7.4磷酸盐缓冲液4℃透析24小时，每4小时更换一次透析液。
1.2用螯合有稀土离子的双功能螯合剂标记1,25-二羟基维生素D3合成抗原
F、用Tris-HCl缓冲液（0.05M，pH7.8）溶解EuCl3（或任一种稀土离子化合物，如Sm3+、Tb3+、Dy3+），使其浓度为10-6mol/L;
G、用上述溶液稀释螯合剂二乙烯三胺五乙酸（DTPA），使稀土离子和螯合剂的摩尔比为2:1;
H、将上述溶液置于37℃恒温水浴中加热反应2小时，制备双功能螯合标记试剂;
I、冷冻干燥上述螯合产物;
J、将上述冷冻干燥螯合物1mg溶于50μl二甲基甲酰胺（DMF）;
K、将1,25-二羟基维生素D3合成抗原1mg溶于500μlpH9.10.05M的碳酸盐缓冲液中;
L、将溶解的螯合物分成4份，每2分钟1份加入溶解的抗原溶液中，室温避光搅拌反应30分钟;
M、取葡聚糖凝胶G-50作为层析填料，装柱后用水进行压柱流速控制在2~3ml/min，柱子压好后，用0.1mmol/LNaOH对柱子进行处理，流速控制在2~3ml/min，2个柱体积即可。然后用水洗平，用柱平衡液对纯化柱进行平衡，大约1h，柱平衡液为0.1%高纯度BSA水溶液，用pH8.0的0.05MNH4HCO3为洗脱液，洗脱液也可以是pH7.8的0.05MTris-HCl（含0.9%NaCl），洗脱流速为1ml/min，分离终产物。收集蛋白浓度较高的几管合并，加入等倍甘油-20℃冻存。
1.31,25-二羟基维生素D3时间分辨免疫试剂盒的制备
在96孔板上包被1,25-二羟基维生素D3的单克隆抗体（购自英国Abcam公司），以上述得到的标记抗原作为竞争性抗原制备标记物溶液，制备定标血清、中值质控血清和高值质控血清（新生牛血清含适量1,25-二羟基维生素D3），配制实验缓冲液（含1%牛血清白蛋白、含0.02%乙二胺四乙酸二钠的Tris-HCl缓冲液）、增强液（含2%TritonX-100、6%冰醋酸和0.005%β-NTA）和浓缩洗液（含5%Tween20和0.2MTris-HCl缓冲液），即得1,25-二羟基维生素D3检测试剂盒（竞争法时间分辨免疫试剂盒）。
实施例425-羟基维生素D3检测试剂盒的应用
操作步骤如下：
A、取实施例1中制备的25-羟基维生素D3检测试剂盒，向相应的酶标板微孔中加入50μL稀释的定标血清、质控血清或样本，再加入50μL的酶工作液。贴上封口胶，于37℃条件下孵育1小时。
B、用工作洗涤液洗板5次；向每孔加入300μL工作洗涤液，在进行下一步操作前，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以除去残留的工作洗涤液。
C、向每孔加入50μL的底物液A和50μL的底物液B，贴上封口胶，于37℃下孵育，恒温培养箱或恒温鼓风干燥箱中反应15分钟。
D、向每孔加入50μL终止液。在加入终止液后立即于450nm、630nm波长处读取吸光度。
E、绘制标准曲线：以OD值为纵坐标，25-OH-D3浓度为横坐标，进行指数曲线拟合。根据标准曲线和每个样本检测的OD值，在标准曲线上找到对应的25-OH-D3浓度值（μg/L或nmol/L）。
试剂盒性能分析：
（1）25-羟基维生素D3检测试剂盒与高效液相色谱法测定结果的比较
选择代表较大25-羟基维生素D3范围（0-100μg/L）的10个样品，分别采用上述两种方法进行检测，在比较数据的基础上进行相关分析：相关系数（r）≥0.90，偏差≤15%。
（2）灵敏度检测
对样本进行浓度梯度稀释，以稀释液作为检测样本，平行测定10次，检测结果的平均吸光度减去两倍标准偏差SD值所对应的浓度，结果不高于5μg/L。
（3）批内精密度检测
用中值质控血清，平行测定10次，CV值≤10%。
（4）线性范围
在试剂盒分析范围（5-100μg/L）内，线性相关系数（r）≥0.990。
（5）特异性分析
样品中维生素D3浓度≤100μg/L时，对检测结果没有影响，即与未加入维生素D3的同一份样本检测结果相比，其结果偏差≤10%。
实施例525-羟基维生素D3检测试剂盒的应用
操作步骤如下：
A、取实施例2中制备的25-羟基维生素D3检测试剂盒，向相应的包被板微孔中加入50μL已稀释好的定标血清、质控血清或样本，再加入50μL的标记物工作液。贴上封口胶，于37℃条件下孵育1小时。
B、用工作洗涤液洗板5次；向每孔加入300μL工作洗涤液，在进行下一步操作前，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以除去残留的工作洗涤液。
C、向每孔加入50μL的底物液A和50μL的底物液B。
D、加入底物液后立即于化学发光免疫分析仪上读取结果。
E、绘制标准曲线：以光强度值为纵坐标，25-OH-D3浓度为横坐标，进行指数曲线拟合。根据标准曲线和每个样本检测的光强度值，在标准曲线上找到对应的25-OH-D3浓度值（μg/L或nmol/L）。试剂盒性能分析：
（1）25-羟基维生素D3检测试剂盒与高效液相色谱法的测定结果的比较
选择代表较大25-羟基维生素D3范围（0-100μg/L）的10个样品，分别采用上述两种方法进行检测，在比较数据的基础上进行相关分析：相关系数（r）≥0.90，偏差≤15%。
（2）灵敏度检测
对样本进行浓度梯度稀释，以稀释液作为检测样本，平行测定10次，检测结果的平均吸光度减去两倍标准偏差SD值所对应的浓度，结果不高于5μg/L。
（3）批内精密度检测
用中值质控血清，平行测定10次，CV值≤10%。
（4）线性范围
在试剂盒分析范围（5-100μg/L）内，线性相关系数（r）≥0.990。
（5）特异性分析
样品中维生素D3浓度≤100μg/L时，对检测结果没有影响，即与未加入维生素D3的同一份样本检测结果相比，其结果偏差≤10%。
实施例61,25-羟基维生素D3检测试剂盒的应用
操作步骤如下：
A、取实施例3中制备的1,25-羟基维生素D3检测试剂盒，向相应的包被板微孔中加入50μL已稀释好的定标血清、质控血清或样本，再加入50μL的铕标记物工作液。贴上封口胶，振荡器缓慢震荡5分钟，于37℃条件下孵育1小时。
B、用工作洗涤液洗板5次；向每孔加入300μL工作洗涤液，在进行下一步操作前，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以除去残留的工作洗涤液。
C、向每孔加入100μL的增强液，于振荡器上缓慢震荡5分钟。
D、用时间分辨免疫荧光分析仪检测。
E、绘制标准曲线：以荧光值为纵坐标，1,25-（OH）2-D3浓度为横坐标，进行指数曲线拟合。根据标准曲线和每个样本检测的荧光值，在标准曲线上找到对应的1,25-（OH）2-D3浓度值（ng/L或pmol/L）。试剂盒性能分析：
（1）1,25-羟基维生素D3检测试剂盒与高效液相色谱法的测定结果的比较
选择代表较大1,25-二羟基维生素D3范围（0-240ng/L）的10个样品通过两种方法检测，在比较数据的基础上进行相关分析：相关系数（r）≥0.90，偏差≤15%。
（2）灵敏度检测
对样本进行浓度梯度稀释，以稀释液作为检测样本，平行测定10次，检测结果的平均吸光度减去两倍标准偏差SD值所对应的浓度，结果不高于3ng/L。
（3）批内精密度检测
用中值质控血清，平行测定10次，CV值≤10%。
（4）线性范围
在试剂盒分析范围（3-240ng/L）内，线性相关系数（r）≥0.990。
（5）特异性分析
样品中维生素D3浓度≤10μg/L时，对检测结果没有影响，即与未加入维生素D3的同一份样本检测结果相比，其结果偏差≤10%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种维生素D合成抗原，其特征在于，其为维生素D与蛋白载体的偶联物，所述维生素D为25-羟基维生素D3或1,25-二羟维生素D3，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白中的一种或多种；
所述维生素D与蛋白载体的重量比为1:16～20；
维生素D合成抗原的制备方法包括如下步骤：
1)将蛋白载体溶于pH8.5的缓冲液中，得溶液A；
2)将维生素D溶于乙醇、二甲基亚砜或吡啶中，得溶液B；
3)分别向溶液A和B中加入活化剂，得到活化的蛋白载体和维生素D；
4)以N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二环已基碳二亚胺为偶联剂，将上述活化的蛋白载体和维生素D进行偶联；
5)透析、干燥，即得维生素D合成抗原；
其中，步骤3)中所述活化剂为含乙二胺和乙二胺二盐酸盐的磷酸氢二钠溶液、4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液、戊二醛或甲醛。
2.制备权利要求1所述维生素D合成抗原的方法，其特征在于，包括步骤：
1)将蛋白载体溶于pH8.5的缓冲液中，得溶液A；
2)将维生素D溶于乙醇、二甲基亚砜或吡啶中，得溶液B；
3)分别向溶液A和B中加入活化剂，得到活化的蛋白载体和维生素D；
4)以N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二环已基碳二亚胺为偶联剂，将上述活化的蛋白载体和维生素D进行偶联；
5)透析、干燥，即得维生素D合成抗原；
其中，步骤3)中所述活化剂为含乙二胺和乙二胺二盐酸盐的磷酸氢二钠溶液、4-二甲氨基吡啶-丙酮混合液、戊二醛或甲醛。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
4.权利要求1所述维生素D合成抗原在维生素D免疫学检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其是将所述维生素D合成抗原与标记物结合作为竞争性抗原，通过与样品中的维生素D竞争结合维生素D单克隆抗体，从而检测样品中的维生素D含量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述标记物为:
a)辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
b)吖啶酯类化合物；或
c)螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述维生素D单克隆抗体为Abcam公司的维生素D单抗产品。
8.维生素D免疫学检测试剂盒，其特征在于，其包括包被维生素D单克隆抗体的酶标板、权利要求1所述的维生素D合成抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原；
其中，所述维生素D单克隆抗体为Abcam公司的维生素D单抗产品；所述标记物为：a)辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；b)鲁米诺或吖啶酯类化合物；或c)螯合有Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+的二乙烯三胺五乙酸、2-[(4-氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、维生素D标准品、底物显色液、反应终止液中的一种或多种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104062440B (zh) * 2014-06-30 2016-05-11 韩雅君 一种快速检测维生素d的试纸条
EP3168619B1 (en) 2014-07-10 2021-10-20 Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co., Ltd. Detection agent for detecting 25-hydroxy vitamin d, preparation method and use
CN107325173A (zh) * 2016-04-28 2017-11-07 上海惠斯生物科技有限公司 一种25羟基维生素d3人工抗原、制备方法及应用
CN106199016A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 25‑羟基维生素d化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
US20190309030A1 (en) * 2016-07-05 2019-10-10 Shenzhen Yhlo Biotech Co., Ltd. Acridine labelled conjugates and preparation methods therefor and chemiluminescent kits
WO2018006269A1 (zh) * 2016-07-05 2018-01-11 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒
EP3483172B1 (en) * 2016-07-05 2022-01-26 Shenzhen Yhlo Biotech Co., Ltd Acridine-marker conjugate and preparation method thereof, and chemiluminescence kit
CN106645697A (zh) * 2016-11-09 2017-05-10 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒
WO2018133038A1 (zh) * 2017-01-20 2018-07-26 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 标记复合物及其制备方法、试剂盒、应用和检测***
CN108362688B (zh) * 2018-01-02 2021-08-24 北京利德曼生化股份有限公司 一种25羟基维生素d磁微粒化学发光检测试剂盒
CN110713533B (zh) * 2019-11-26 2021-03-16 杭州隆基生物技术有限公司 一种25-羟基维生素d3抗原及其制备方法
CN113495158A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 郑州达诺生物技术有限公司 一种样本前处理剂、一种维生素b12定量检测试剂盒及使用方法
CN113495159A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 郑州达诺生物技术有限公司 一种***反应液、一种25羟基维生素d定量检测试剂盒及其使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273062A (zh) * 2005-09-29 2008-09-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗25-羟基维生素d的抗体
WO2012162165A2 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Antibodies to 25-hydroxyvitamin d2 and d3 and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273062A (zh) * 2005-09-29 2008-09-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗25-羟基维生素d的抗体
WO2012162165A2 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Antibodies to 25-hydroxyvitamin d2 and d3 and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
25-羟基维生素D3人工完全抗原的合成与鉴定;万巍巍等;《细胞与分子免疫学杂志》;20111231;第27卷(第11期);第1173页摘要第2-5行,第1174页1.2节第1-10行,图1 *

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