CN103575914B - 检测维生素b12的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测维生素B12的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有维生素B12偶联抗原的酶标板，酶标记抗抗体工作液，维生素B12特异性抗体工作液，维生素B12标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测维生素B12的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测谷物类（玉米面、黄豆面、小米面、大米面）、牛奶、奶粉中维生素B12的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测维生素B12的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测维生素B12的酶联免疫试剂盒，其适用于谷物类（玉米面、黄豆面、小米面、大米面）、牛奶、奶粉中维生素B12的测定。

技术背景

维生素是各种生物维持正常生理功能所必需的一类低分子有机化合物，它们大多数是生化代谢过程中的主要辅酶，在体内参与、调节、控制许多合成和分解代谢，当生物体缺乏维生素时，就会引发物质代谢障碍，引起多种疾病。维生素B12又叫钴胺素，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。维生素B12对于促进畜禽生长特别是在促进幼畜生长发育方面效果显著，在畜禽体内主要以参与一碳单位和丙酸代谢发挥作用，影响遗传物质的合成，还能维持神经功能的完整性，是畜禽不可缺少的营养原料。养殖生产过程中，常规饲料中的维生素B12一般作为安全用量，额外添加适量维生素B12可以提高畜禽生产性能，带来可观的经济效益。

近年来，余林梁等报道了以HPLC测定维生素H，邓富良等用HPLC同时测定注射用水溶性维生素中维生素H和叶酸，任一平、龙朝阳等以HPLC测定食品中的叶酸，杨谊等以HPLC测定维生素B12。隋玉荣等用离子对色谱法测定了维生素B12及叶酸的含量，H.B.Li、Heudi用不同波长同时测定了维生素H、叶酸和维生素B12，宋金春等通过优化色谱条件，建立了同一波长条件下HPLC同时测定注射用水溶性维生素中维生素H、叶酸及维生素B12含量的方法。另外维生素B12的测定方法主要有比色法、电化学分析法、离子交换法、激光共振拉曼光谱法等，这些方法均是先测定样品中Co含量，由钴含量换算成VB12的含量，操作繁琐，选择性较差。刘保生等建立了利用AO-R6G能量转移荧光猝灭法测定维生素B12的新方法。免疫学检测方法也应用于维生素B12的检测中，采用间接竞争ELISA方法测定维生素B12含量的方法，简便、快速、灵敏度高，稳定性好，能满足维生素B12的现场大批量样品的快速筛选。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于维生素B12含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

（1）包被有维生素B12偶联抗原的酶标板；

（2）维生素B12特异性抗体；

（3）酶标记抗抗体；

（4）维生素B12标准品溶液；

（5）底物显色液；

（6）终止液；

（7）浓缩洗涤液；

（8）复溶液。

所述维生素B12偶联抗原为维生素B12半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述维生素B12半抗原的结构如下：

。

所述维生素B12半抗原制备过程：0.50g维生素B12、0.10g琥珀酸酐和1ml吡啶在20mlDMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应40小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系多次重结晶后得到邻苯二甲酸单维生素B12酯，为维生素B12半抗原。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述维生素B12特异性抗体为维生素B12单克隆抗体，是用维生素B12偶联抗原为免疫原免疫动物得到的；所述维生素B12特异性抗体可为鼠源、马源、羊源或兔源抗体，所述维生素B12单克隆抗体优选为维生素B12鼠单克隆抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括维生素B12标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。

所述的终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。

所述浓缩洗涤液为pH7.2~7.6，含0.5%~1.0%吐温-20和0.01‰~0.05‰的叠氮化钠防腐剂的0.1~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

所述的复溶液为pH值为7.0~7.2，含有5%~10%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.0~9.6，0.1~0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH7.2~7.6，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释成0.1~0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被维生素B12偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入维生素B12特异性抗体溶液，样本中的维生素B12与酶标板上包被的维生素B12偶联抗原竞争维生素B12特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用底物显色液显色，样本吸光值与维生素B12的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中维生素B12的含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的维生素B12标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中维生素B12的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测维生素B12的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明检测维生素B12的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法检测样品中维生素B12的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的维生素B12单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选。

附图说明

图1：维生素B12半抗原合成图

图2：试剂盒的标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1试剂盒组分的制备

1、维生素B12半抗原制备

0.50g维生素B12、0.10g琥珀酸酐和1ml吡啶在20mlDMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应40小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系多次重结晶后得到邻苯二甲酸单维生素B12酯，为维生素B12半抗原。

2、抗原的制备

免疫原制备——维生素B12半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原

1）取20mg半抗原，溶解于1mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；

2）取30mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2ml水充分溶解后加入上述1）中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；

3）称取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mL0.01mol/LPBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；

4）用0.01mol/LPBS4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

包被原制备——维生素B12半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被原

制备方法同上，将BSA50mg替换为OVA50mg。

3、维生素B12单克隆抗体的制备

a.动物免疫

将上述步骤得到的免疫抗原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌维生素B12单克隆抗体的维生素B12单克隆杂交瘤细胞株。

c.细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被抗原稀释成0.1~0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

6、酶标记羊抗鼠抗抗体的制备

将抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4:1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体，为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

1）省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。

2）降低了辣根过氧化物酶:抗抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。

实施例2检测维生素B12的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测维生素B12的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

（1）包被维生素B12偶联抗原的酶标板；

（2）维生素B12单克隆抗体工作液；

（3）用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

（4）维生素B12标准品溶液5瓶，浓度分别为0μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L；

（5）底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲，底物液B液为四甲基联苯胺；

（6）终止液为2mol/L硫酸；

（7）浓缩洗涤液为pH7.2~7.6，含0.5%~1.0%吐温-20和0.01‰~0.05‰的叠氮化钠防腐剂的0.1~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

（8）复溶液为pH值为7.0~7.2，含有5%~10%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

实施例3样品中维生素B12的检测

1.样品前处理

样品的前处理主要是为了从样品中获得维生素B12溶液，从而用于后续的检测。下面是样品的前处理方法：

（1）谷物（玉米面、黄豆面、小米面、大米面）

称取1.0g±0.05g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml0.8mol/L磷酸盐缓冲溶液，用振荡器振荡3min，3000g以上室温离心5min；取100μl上清液加入400μl复溶液，用振荡器振荡3min，混匀；取50μl用于分析。

（2）奶粉

称取1.0g±0.05g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml10%NaCl溶液，立即用振荡器振荡3min；使其完全溶解；取100μl上述溶解液加入400μl复溶液，用振荡器振荡3min，混匀；取50μl用于分析。

（3）原奶

直接点板分析。

（4）成品奶

取50μl牛奶样本加450μl复溶液混匀；取50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有维生素B12偶联抗原的酶标板微孔中加入维生素B12标准品溶液/样品50μl，再加入维生素B12单克隆抗体工作液50μl，用盖板模封板，25℃避光反应30min，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板4-5次，用吸水纸拍干，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体工作液100μl，轻轻振荡混匀，用盖板模封板，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板4-5次，用吸水纸拍干，每孔加入底物液A液过氧化脲50μl，底物液B液四甲基联苯胺（TMB）50μl，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个标准品溶液（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，得到百分吸光度值。以维生素B12标准品浓度（μg/L）的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出维生素B12的含量。

实施例4维生素B12酶联免疫试剂盒灵敏度、精密度和准确度、保存期实验

1.试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度试验，试剂盒灵敏度为0.2μg/L，分别对20份空白样本（谷物类、牛奶、奶粉）进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本维生素B12浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对谷物类（玉米面、黄豆面、小米面、大米面）检测限为4μg/kg，对奶粉检测限为4μg/kg，对原奶的检测限为1μg/L，对成品奶的检测限为2μg/L。

2.试剂盒准确度和精密度

以重复测定某一浓度样品的检测结果变异系数（CV%）作为精密度评价指标。以回收率作为准确度评价指标。变异系数CV%计算公式为：CV（%）=SD/X×100%；其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。回收率计算公式为：回收率（%）=实际测定值/理论值×100%。其中理论值为模拟样品的添加浓度。

按8μg/kg、16μg/kg两个浓度维生素B12对玉米面、黄豆面、小米面、大米面、奶粉样品进行添加回收测定，按2μg/L、4μg/L两个浓度维生素B12对原奶样品进行添加回收测定，按4μg/L、8μg/L两个浓度维生素B12对成品奶样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂盒进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1精密度及准确度试验

以8、16μg/kg两个浓度的维生素B12对谷物类（玉米面、黄豆面、小米面、大米面）样品进行添加，平均回收率在78.5%~93.6%之间；以8、16μg/kg两个浓度的维生素B12对奶粉样品进行添加，平均回收率在76.5%~85.3%之间；以2、4μg/L两个浓度的维生素B12对原奶样品进行添加，平均回收率在76.8%~88.3%之间；以4、8μg/L两个浓度的维生素B12对成品奶样品进行添加，平均回收率在86.6%~90.8%之间；变异系数均小于20%。检测结果的精密度和准确度均符合相关标准要求。

3.试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2~8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃可以保存12个月。

Claims (7)

1.一种检测维生素B12的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括有：

(1)包被有维生素B12偶联抗原的酶标板；

(2)维生素B12特异性抗体；

(3)酶标记抗抗体；

(4)维生素B12标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)复溶液；

其中，所述维生素B12偶联抗原是由维生素B12半抗原与载体蛋白偶联得到；所述维生素B12半抗原的制备方法主要包括如下步骤：0.50g维生素B12、0.10g邻苯二甲酸酐和1mL吡啶在20mLDMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应40小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系多次重结晶后得到邻苯二甲酸单维生素B12酯，即为维生素B12半抗原；所述维生素B12半抗原结构如下：

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的维生素B12特异性抗体为维生素B12单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与抗抗体偶联得到。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，所述底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗涤液为pH7.2～7.6，含重量百分比为0.5％～1.0％的吐温-20和重量百分比为0.01‰～0.05‰的叠氮化钠防腐剂的0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述的复溶液为pH值为7.0～7.2，含有重量百分比为5％～10％的酪蛋白、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述维生素B12标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L。

7.一种检测样品中维生素B12含量的方法，主要步骤包括：

1)将待测样品进行前处理；

2)用权利要求1-6任一项所述的酶联免疫试剂盒进行检测；

3)分析检测结果。