CN105017347B - 庆大霉素半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种庆大霉素半抗原及其制备方法和应用。本发明提供的庆大霉素半抗原，结构式如式Ⅰ所示：

Description

庆大霉素半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种庆大霉素半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

庆大霉素(Gentamicin，GM)属于氨基糖甙类抗生素，主要作用于革兰氏阴性细菌，由于其具有广谱抑菌和杀菌作用，被广泛应用于兽医临床和动物饲料添加剂。但GM的血清有效浓度与毒性浓度很相近，安全范围较小，在其应用过程中易产生毒副作用，尤其大剂量不规范使用，易导致动物性食品中GM残留超标，对人体健康构成危害，造成肾毒性和耳毒性。许多国家在动物生产中严禁使用GM或规定有严格的最高残留限量(MRL)，我国农业部235号公告规定，动物性食品中GM的MRL为100ng/g。

目前庆大霉素残留检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、高效毛细管电泳法和免疫学检测法。仪器法检测价格昂贵，不适合在基层推广使用和大量筛选。免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，使用方便。因此，大规模筛选检测以免疫学检测方法更实际、更具有应用前景。酶联免疫吸附法(ELISA)以其灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低等优点适合于大量样品的快速筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种庆大霉素半抗原及其制备方法和应用。

本发明提供的庆大霉素半抗原分子结构式如式Ⅰ所示：

本发明提供的庆大霉素半抗原的制备方法，包括如下步骤：

在100mL两口烧瓶中加入0.5g对溴甲基苯甲酸及1.05g庆大霉素和10mL乙醇，搅拌至溶解，加热至45℃反应6小时后，减压蒸除溶剂。乙醇-水体系中重结晶得到对羧苄基庆大霉素，得到半抗原产物。

本发明的另一个目的是上述庆大霉素半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述庆大霉素半抗原与载体蛋白偶联得到的庆大霉素抗原，及由所得庆大霉素抗原免疫动物制备得到的庆大霉素抗体，所述抗体为庆大霉素单克隆抗体。

其中所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

本发明还提供由上述庆大霉素半抗原或庆大霉素抗原在检测庆大霉素或制备检测庆大霉素的产品中的应用，具体涉及制备的酶联免疫检测试剂盒在检测动物源性食品中庆大霉素残留的应用。

本发明提供的庆大霉素半抗原、庆大霉素抗原合成方法简单，通过免疫动物产生了针对庆大霉素的特异性抗体，抗体的效价、特异性都比较好；用所得的抗体制备酶联免疫检测试剂盒，检测成本低，使用方便，检测方法准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于动物源性食品中庆大霉素残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的庆大霉素半抗原在庆大霉素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：庆大霉素半抗原合成路线图

图2：庆大霉素半抗原核磁共振图

图3：庆大霉素ELISA标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法、材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规方法和常规材料。

实施例1：庆大霉素半抗原的合成和鉴定(合成路线如图1)

在100mL两口烧瓶中加入0.5g对溴甲基苯甲酸及1.05g庆大霉素和10mL乙醇，搅拌至溶解，加热至45℃反应6小时后，减压蒸除溶剂。乙醇-水体系中重结晶得到对羧苄基庆大霉素，得到半抗原产物。

上述庆大霉素半抗原分子结构式如式Ⅰ所示：

取上述产物用核磁共振确定结构，如图2所示，11.0ppm的羧基信号峰、7.44ppm及8.09ppm的芳环信号峰，说明半抗原合成成功。

实施例2：庆大霉素抗原的制备

将庆大霉素半抗原与载体蛋白偶联得到庆大霉素抗原，分子结构式如式Ⅱ所示：

一、免疫原制备

取14mg庆大霉素半抗原用1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，各取30mg碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白(BSA)50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(pH7.2)溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS溶液在4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。

二、包被原制备

将BSA换为卵清蛋白(OVA)按上述方法制备得到包被原。

实施例3：庆大霉素单克隆抗体的制备

动物免疫：将实施例2中得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将庆大霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射庆大霉素的单克隆杂交瘤细胞株，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。该单克隆抗体特异性好，检测灵敏度可达0.1μg/L。

单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

将庆大霉素、链霉素、双氢链霉素、新霉素做系列稀释，制作标准曲线，分析得到IC50，然后按下式计算交叉反应率，结果见表1。

表1抗体特异性

实施例4：由庆大霉素单克隆抗体制备的酶联免疫检测试剂盒

一、酶联免疫检测试剂盒的组成

(1)包被庆大霉素偶联抗原的酶标板；

(2)酶标二抗或酶标二抗浓缩液；

(3)抗体工作液；

(4)标准品溶液：浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，高浓度标准品溶液浓度为1mg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺溶液；

(6)终止液为2mol/L的硫酸溶液；

(7)浓缩洗涤液为含0.5％～1.0％的吐温-20的0.1～0.2mol/L pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH7.2～7.6，0.05～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

二、酶联免疫检测试剂盒检测实际样本的应用

(一)样本前处理方法一

1、组织(鸡肉、鸡肝)样本前处理方法

称取2.0g±0.05g去除脂肪的组织样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入6mL0.1mol/L PBS溶液(称取13.4g十二水合磷酸氢二钠、20.0g氯化钠、0.32g氢氧化钠、0.5g二水合磷酸二氢钾、0.5g氯化钾加入500mL去离子水溶解混匀)，混匀10min；加入60℃水浴环境中60min，取出冷却至室温并摇匀；3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心10min；移取上清液与复溶工作液(用去离子水将2×浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释(1份2×浓缩复溶液+1份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4℃(39.2℉)环境可保存一个月)以1:9的体积比进行稀释(50μL上清液+450μL复溶工作液)，取50μL用于分析。

2、鲜牛奶样本前处理方法

取20μL鲜牛奶样本至2mL聚苯乙烯离心管中，加入780μL复溶工作液，混匀，取50μL用于分析。

3、奶粉样本前处理方法

称取1.0g±0.05g奶粉样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL去离子水，用振荡器充分振荡至奶粉全部溶解；取出50μL样本液加入950μL复溶工作液，混匀，取50μL用于分析。

(二)样本前处理方法二

1、鸡肉样本前处理方法

用均质器均质样本；称取2.0g±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入4mL0.07mol/L碳酸盐缓冲液(称取3.26g无水碳酸钠和0.35g碳酸氢钠加入500mL去离子水溶解混匀)和2mL甲醇，用涡旋仪涡动5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；移取100μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶工作液，用涡旋仪涡动1min；取20μL用于分析。

2、鸡肝样本前处理方法

用均质器均质样本；称取2.0g±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入3mL0.1mol/L碳酸盐缓冲液(称取4.66g无水碳酸钠和0.5g碳酸氢钠加入500mL去离子水溶解混匀)和3mL甲醇，用涡旋仪涡动5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；移取100μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶工作液，用涡旋仪涡动1min；取20μL用于分析。

3、牛奶样本前处理方法

移取1mL牛奶样本至2mL聚苯乙烯离心管中，加入1mL1％三氯乙酸(称取5.0g三氯乙酸加入500mL去离子水溶解混匀)，用涡旋仪涡动3min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；移取100μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶工作液，用涡旋仪涡动1min；取20μL用于分析。

4、奶粉样本前处理方法

称取1.0g±0.05g奶粉至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL去离子水，用涡旋仪涡动3min，使奶粉充分溶解，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；移取100μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶工作液，用涡旋仪涡动1min；取20μL用于分析。

(三)用试剂盒进行检测

将样本按照前处理方法一处理后用试剂盒进行检测，向包被有包被原的酶标板微孔中加入50μL标准品/样本，再加入50μL抗体工作液，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜，37℃恒温箱中避光反应30min。倒出孔中的液体，用洗涤工作液(用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释)250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干以保证完全除去孔中的液体。每孔加入酶标二抗100μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃(99℉)避光环境中反应30min。倒出孔中的液体，用洗涤工作液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干以保证完全除去孔中的液体。每孔加入底物液A液50μL，再加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后37℃恒温箱中避光显色15min。加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测量每孔的吸光度值。

将样本按照前处理方法二处理后用试剂盒进行检测，向包被有包被原的酶标板微孔中加入20μL标准品/样本，再加入80μL抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液(将抗体工作液和酶标二抗浓缩液按10:1体积比混合并混匀)，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜，25℃恒温箱中避光反应30min。倒出孔中的液体，用洗涤工作液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干以保证完全除去孔中的液体。每孔加入底物液A液50μL，再加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后25℃恒温箱中避光显色15min。加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测量每孔的吸光度值。

(四)检测结果分析

用所获得的标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即得到标准品或样本的百分吸光率。以庆大霉素标准品百分吸光率为纵坐标，以庆大霉素标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，如图3所示。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中庆大霉素实际浓度。

三、酶联免疫检测试剂盒技术参数的确定

最低检测限：分别对20份空白鸡肉、鸡肝、牛奶、奶粉样本，按照样本前处理方法一处理后，用试剂盒进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本庆大霉素浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对鸡肉、鸡肝样本的检测限为4μg/kg，对牛奶样本的检测限为4μg/L，对奶粉样本的检测限为10μg/kg。

分别对20份空白鸡肉、鸡肝、牛奶、奶粉样本，按照样本前处理方法二处理后，用试剂盒进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本庆大霉素浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对鸡肉、鸡肝样本的检测限为4μg/kg，对牛奶样本的检测限为2μg/L，对奶粉样本的检测限为5μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。

分别取空白鸡肉、鸡肝样本，以4、8、16μg/kg三个添加浓度，取空白牛奶样本，以4、8、16μg/L三个添加浓度，取空白奶粉样本，以10、20、40μg/kg三个添加浓度的庆大霉素药物对其进行添加，分别按照样本前处理方法一对鸡肉、鸡肝、牛奶、奶粉样本处理后，用试剂盒进行检测，结果得该方法对鸡肉、鸡肝样本的回收率为80％～100％，牛奶、奶粉样本回收率为70％～110％。批内变异系数＜15％，批间变异系数＜25％。

分别取空白鸡肉、鸡肝样本，以4、8、16μg/kg三个添加浓度，取空白牛奶样本，以2、4、8μg/L三个添加浓度，取空白奶粉样本，以5、10、20μg/kg三个添加浓度的庆大霉素药物对其进行添加，分别按照样本前处理方法二对鸡肉、鸡肝、牛奶、奶粉样本处理后，用试剂盒进行检测，结果得该方法对鸡肉、鸡肝、牛奶、奶粉样本的回收率为85％～115％。批内变异系数＜15％，批间变异系数＜25％。

经测定本发明试剂盒在2～8℃至少可以保存12个月。

Claims (2)

1.一种由庆大霉素单克隆抗体制备的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于它的组成包括：

(1)包被庆大霉素偶联抗原的酶标板；

(2)酶标二抗或酶标二抗浓缩液；

(3)抗体工作液；

(4)标准品溶液：浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，高浓度标准品溶液浓度为1mg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺溶液；

(6)终止液为2mol/L的硫酸溶液；

(7)浓缩洗涤液为含0.5％～1.0％的吐温-20的0.1～0.2mol/L pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH7.2～7.6，0.05～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

其中，所述抗体工作液为由庆大霉素抗原制备的庆大霉素单克隆抗体，所述庆大霉素抗原由庆大霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联得到；所述庆大霉素半抗原的制备方法包括如下步骤：在100mL两口烧瓶中加入0.5g对溴甲基苯甲酸及1.05g庆大霉素和10mL乙醇，搅拌至溶解，加热至45℃反应6小时后，减压蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到对羧苄基庆大霉素，即为庆大霉素半抗原，其分子结构式为：

2.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述庆大霉素抗原的制备方法包括如下步骤：取14mg庆大霉素半抗原用1mL DMF溶解，各取30mg EDC和NHS用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL pH7.2的PBS溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS溶液在4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。