CN105272866A - 苯乙醇胺a半抗原、抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苯乙醇胺A半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述苯乙醇胺A半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的苯乙醇胺A半抗原是式1所示产物，用式1所示产物与载体蛋白连接可以得到苯乙醇胺A抗原。所述苯乙醇胺A抗原可应用于制备苯乙醇胺A特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的苯乙醇胺A人工抗原，通过免疫动物可产生了针对苯乙醇胺A的特异性抗体，可用于制备检测苯乙醇胺A残留的酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

Description

苯乙醇胺A半抗原、抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及苯乙醇胺A半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

β-受体激动剂在现代养殖业中被用于作为饲料添加剂，如之前为人们所熟知的克伦特罗等，这一类药物可以减少脂肪，增加瘦肉，提高猪的单位经济价值，但是它们都有危险的副作用，轻则导致心律不整，严重一点就会导致心脏病。

苯乙醇胺A，又称“克伦巴胺”，化学式：2-[4-（4-硝基苯基）丁基-2-基氨基]-1-甲氧基苯乙醇，分子式：C19H24N2O4，分子量：344，是新一代的瘦肉精。四川省广安市广安区枣山镇畜牧兽医站对某养猪场例行违禁药物监测中，用莱克多巴胺测试卡分别检测母猪、仔猪和育肥猪尿液，发现该场育肥猪尿检呈阳性，之后确认是新型添加物苯乙醇胺A。这种瘦肉精新品种惊现市场，再次敲响中国食品安全警钟。因此被农业部发布的第1519号公告列为“禁止在和动物饮水中使用的物质”。公告称，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》有关规定，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A等物质。各级畜牧饲料管理部门要加强日常监管和监督检测，严肃查处在饲料生产、经营、使用和动物饮水中违禁添加苯乙醇胺A等物质的违法行为。

目前，检测苯乙醇胺A的方法主要为仪器方法——高效液相色谱质谱法，这类方法需要专业的仪器设备和专业的人员进行操作，前处理繁杂，费时，不适合大量样本的筛查和基层人员操作。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。苯乙醇胺A人工抗原的制备为这一方法的实施奠定了重要基础。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯乙醇胺A半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。

本发明提供的苯乙醇胺A半抗原，其结构为式Ⅰ所示：

式Ⅰ

本发明还保护式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

苯乙醇胺A138mg溶于10ml1mol/LHCl和4ml二甲基亚砜中；加入

锌粉100mg，80℃水浴搅拌反应30min，冷却过滤，滤液调pH8.0，20ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，真空干燥；将残留物10mlDMF溶解，加入碳酸钾60mg,碘乙酸82mg，90℃加热反应3h，降低至室温，加入50ml蒸馏水，1M盐酸调pH6.0,50ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，真空干燥滤液，残留物即为半抗原。

本发明所提供的苯乙醇胺A抗原，是将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联获得的抗原。

所述苯乙醇胺A抗原，其结构为式Ⅱ所示：

本发明还保护所述苯乙醇胺A抗原的制备方法，包括如下步骤：

称取半抗原10mg溶于2mlDMF，加入EDC4.3mg，NHS5.1mg，室温搅拌反应2h；50mgBSA溶于5ml0.1M碳酸氢钠缓冲液，将上述活化药物逐滴

加入到蛋白溶液中，室温搅拌过夜，PBS4度透析72小时，期间换透析液6

次。将透析液在无菌条件下过0.22μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20℃保存。

同法合成包被原。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。

所述苯乙醇胺A抗原可以作为免疫原制备苯乙醇胺A特异性抗体，也可以作为包被原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。

式Ⅰ所示产物、所述苯乙醇胺A抗原、所述抗体均可应用于检测苯乙醇胺A。

本发明还公布了应用苯乙醇胺A抗原和苯乙醇胺A单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。

所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有苯乙醇胺A抗原的酶标板、酶标抗体工作液、苯乙醇胺A系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对苯乙醇胺A样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的苯乙醇胺A人工抗原，通过免疫动物可产生了针对苯乙醇胺A的特异性抗体，用于快速检测食品中的苯乙醇胺A残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

附图说明

图1为苯乙醇胺A酶联免疫检测试剂盒标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。人血清白蛋白简称HSA。

实施例1、制备苯乙醇胺A半抗原

苯乙醇胺A138mg溶于10ml1mol/LHCl和4ml二甲基亚砜中；加入

锌粉100mg，80℃水浴搅拌反应30min，冷却过滤，滤液调pH8.0，20ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，真空干燥；将残留物10mlDMF溶解，加入碳酸钾60mg,碘乙酸82mg，90℃加热反应3h，降低至室温，加入50ml蒸馏水，1M盐酸调pH6.0,50ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，真空干燥滤液，残留物即为半抗原。

苯乙醇胺A半抗原的结构式如式Ⅰ所示。

实施例2、苯乙醇胺A人工抗原的制备和鉴定

一、苯乙醇胺A免疫抗原的合成

称取半抗原10mg溶于2mlDMF，加入EDC4.3mg，NHS5.1mg，室温搅拌反

应2h；50mgBSA溶于5ml0.1M碳酸氢钠缓冲液，将上述活化药物逐滴加入到蛋白溶液中，室温搅拌过夜，PBS4℃透析72小时，期间换透析液6次。将透析液在无菌条件下过0.22μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20℃保存。

苯乙醇胺A免疫抗原的结构式如式Ⅱ所示。

二、苯乙醇胺A包被抗原的合成

称取半抗原10mg溶于2mlDMF，加入EDC4.3mg，NHS5.1mg，室温搅拌反

应2h；50mgOVA溶于5ml0.1M碳酸氢钠缓冲液，将上述活化药物逐滴加入到蛋白溶液中，室温搅拌过夜，PBS4℃透析72小时，期间换透析液6次。将透析液在无菌条件下过0.22μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20℃保存。

二、苯乙醇胺A人工抗原的鉴定

按合成苯乙醇胺A免疫抗原和包被抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm~400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得苯乙醇胺A人工抗原。经计算，苯乙醇胺A半抗原分子与BSA分子的结合比为16.8:1，苯乙醇胺A半抗原分子与OVA分子的结合比为11.5:1。

实施例3、酶标单抗的制备和特异性鉴定

一、苯乙醇胺A单抗的制备

1、用上述制备出的免疫原按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

2、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的苯乙醇胺A等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代苯乙醇胺A作对照，其余步骤同上。若经苯乙醇胺A阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

4、将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×10⁶/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

二、酶标抗体的制备

（1）称取辣根过氧化物酶（HRP）2mg溶解于0.5mL水中，加入0.5mL0.06mol/LNaIO₄溶液，4℃避光作用30min；

（2）加入160mmol/L的乙二醇0.5mL，室温作用30min；

（3）加入步骤一制备的苯乙醇胺A单抗2mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0.05mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；

（4）透析液吸至10mL的离心管中，加0.25mL5g/L的NaBH₄溶液，混匀后置4℃2h；

（5）加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min后4℃下3000r/min离心25min，弃上清；

（6）将沉淀溶于1.5mL0.02mol/LpH7.4的PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/LpH7.4PBS透析，4℃过夜(中途更换PBS3次)；

（7）将透析袋中液体吸至微量离心管中，4℃下10000r/min离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。

三、酶标苯乙醇胺A抗体的鉴定

苯乙醇胺A标准品购自Sigma公司。

用方阵滴定法确定苯乙醇胺A包被抗原和步骤一制备的单抗的工作浓度，苯乙醇胺A包被抗原的工作浓度为0.8μg/mL，单克隆抗体的工作浓度为1:5000。

用不同浓度的苯乙醇胺A标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3μg/L，采用8组平行试验(n=8)。间接竞争性ELISA方法：

（1）用上述工作浓度的苯乙醇胺A抗原包被酶标板，将苯乙醇胺A标准品实验溶液与酶标抗体溶液同时加入酶标板微孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将标准品实验溶液用PBS溶液代替，其它一致)，25℃避光环境中反应30min；

（2）倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3~5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；

（3）加入底物显色溶液到酶标板微孔中，25℃避光环境中反应15min；

（4）加入终止液，轻轻振荡混匀，用酶标仪在波长450nm处测定OD值。

以OD值为纵坐标，以苯乙醇胺A实验溶液浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在10%以内。

根据标准曲线得出半数抑制量(IC₅₀)，确定检测灵敏度。

抑制率用以下公式计算：

式中：ODmax：为不加标准品时的吸光值，ODx为标准品x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。

由上述公式计算得苯乙醇胺A抗体在缓冲液中的半数抑制量(IC₅₀)为1.4μg/L。

实施例4、检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒及其制备

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

（1）包被苯乙醇胺A半抗原的酶标板；

（2）酶标苯乙醇胺A抗体工作液：实施例3中所述酶标抗体溶液；

（3）苯乙醇胺A标准品：苯乙醇胺A标准品溶液浓度分别为0、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3μg/L；

（4）底物显色液：由A液和B液组成，A液为2%过氧化脲的水溶液，B液为1%四甲基联苯胺（TMB）的水溶液；

（5）终止液：0.2M硫酸水溶液；

（6）浓缩洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

（7）浓缩复溶液：0.04mo1/L的磷酸盐缓冲液，将浓缩复溶液用水稀释至20倍体积，即为样品稀释液。

二、包被有苯乙醇胺A半抗原的酶标板及其制备

包被苯乙醇胺A半抗原的聚苯乙烯酶标板：用0.05M的碳酸盐溶液将抗原稀释至0.6μg/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6，0.05mo1/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：每1升封闭液按照如下方法配制：将5mL马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

三、试剂盒检测方法

(一)样品前处理

尿样：取20μL待检尿样直接进行检测。注：若混浊，可过滤或4000g离心5min；

肉样：精确称取2g均质后的样品于50mL离心管中，加入6mL肉样提取液充分涡动2min；注：涡动步骤须至组织完全分散；4000g以上离心10min；立即取20μL上清进行检测。样本稀释倍数为4。

(二)用试剂盒检测

1、标准曲线的制作

向包被有苯乙醇胺A半抗原的酶标板微孔中加入苯乙醇胺A标准品溶液50μL，然后加入酶标抗体工作液100μL/孔，轻轻振荡混合均匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干。加入底物A液50μL/孔、底物B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100%，得到百分吸光度值。以苯乙醇胺A标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图1所示。

2、样品中苯乙醇胺A浓度的测定

用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100%，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中苯乙醇胺A的残留量，最后再乘以各样品前处理过程的稀释倍数，即可计算出样品中苯乙醇胺A的浓度。

四、试剂盒检测效果评价

(一)准确度和精密度试验

向不含苯乙醇胺A的尿液样品中添加苯乙醇胺A标准品，使苯乙醇胺A标准品在样品中的终浓度分别为0.3、0.6、1.2μg/L；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如实验三中所述，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。

表1准确度和精密度试验结果

批内变异系数：同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数：同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

结果表明：尿液样品的平均添加回收率在83.3~106.7%，批内变异系数在6.1~10.0%，批间变异系数在8.0~9.7%。

(二)试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2~8℃，经过15个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(0标准)，50%抑制浓度、苯乙醇胺A添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置9天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻9天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少可以保存12个月以上。

(三)交叉反应率试验

选择与苯乙醇胺A结构或功能相似的其他药物进行交叉反应试验，通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明苯乙醇胺A酶联免疫检测试剂盒对苯乙醇胺A的检测特异性越好。结果见表2。

表2苯乙醇胺A试剂盒交叉反应率

试验结果表明，本发明试剂盒对莱克多巴胺的交叉反应率约为11.2%；与多巴盼丁胺的交叉反应率约4.7%；与马布特罗、克伦丙罗、西马特罗、与塞布特罗、克伦潘特、马喷特罗、特普他林、溴代克伦特罗、沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗、卡布特罗<0.1%，所以试剂盒对苯乙醇胺A的特异性好，即本发明试剂盒可以检测苯乙醇胺A。

Claims (9)

1.一种苯乙醇胺A半抗原，为式Ⅰ所示产物：

式Ⅰ。

2.式Ⅰ所示产物的制备方法，包括如下步骤：

苯乙醇胺A138mg溶于10ml1mol/LHCl和4ml二甲基亚砜中；加入锌粉100mg，80℃水浴搅拌反应30min，冷却过滤，滤液调pH8.0，20ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，真空干燥；将残留物10mlDMF溶解，加入碳酸钾60mg,碘乙酸82mg，90℃加热反应3h，降低至室温，加入50ml蒸馏水，1M盐酸调pH6.0,50ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，真空干燥滤液，残留物即为半抗原。

3.一种苯乙醇胺A抗原，是将式Ⅰ所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

4.权利要求3所述苯乙醇胺A抗原的制备方法，包括如下步骤：

称取半抗原10mg溶于2mlDMF，加入EDC4.3mg，NHS5.1mg，室温搅拌反应2h；50mgBSA溶于5ml0.1M碳酸氢钠缓冲液，将上述活化药物逐滴

加入到蛋白溶液中，室温搅拌过夜，PBS4度透析72小时，期间换透析液6

次，将透析液在无菌条件下过0.22μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20℃保存。

5.权利要求3所述苯乙醇胺A抗原在制备苯乙醇胺A特异性抗体中的应用。

6.应用权利要求3所述苯乙醇胺A抗原制备得到的特异性抗体。

7.权利要求1所述产物、权利要求3所述苯乙醇胺A抗原、权利要求6所述抗体在检测苯乙醇胺A中的应用。

8.应用权利要求1所述产物、权利要求3所述苯乙醇胺A抗原、权利要求6所述特异性抗体制备得到的酶联免疫检测试剂盒。

9.权利要求8所述酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，它包括：包被有苯乙醇胺A抗原的酶标板、酶标抗体工作液、苯乙醇胺A系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。