CN109852607A - 一种去除生物样品中无核红细胞的试剂及在dna提取中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂以及在DNA提取中的应用。该去除红细胞的裂解试剂包含金属离子螯合剂、无机盐、表面活性剂以及溶液缓冲体系。本发明还提供了所述裂解试剂在DNA提取中的应用方法。采用本发明提供的无核红细胞裂解试剂，克服了现有产品稳定性差、需要冷藏保存以及取出需要预热使用的缺点，可有效裂解去除人、鼠等血液样品或组织细胞样品中的红细胞，并分离富集样品中的有核细胞，用于有核细胞的核酸（DNA）提取，具有试剂组分稳定、安全环保，红细胞裂解效率高、操作快速简便的优点；试剂能在常温长期储存、无需冷链运输，配制和使用成本均较低。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及去除生物样品中无核红细胞的裂解试剂及其在DNA提取中的应用。
背景技术
红细胞或红血球（Red Blood Cell，RBC）是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，并具有免疫功能。哺乳类脊椎动物（除骆驼和羊驼外）循环血中成熟的红细胞没有细胞核与DNA；而鸟禽类脊椎动物红细胞有细胞核与DNA，正常成人红细胞总数为（3.5～5.5）x 109个/ml。白细胞或白血球（Leukocyte，White Blood Cell，WBC）是血液中无色、球形、有细胞核与DNA的血细胞，在哺乳动物体内主要起防卫作用，参与机体的免疫防御反应，正常成人白细胞总数为（4.0～10.0）x 106个/ml。在生物化学、分子生物学实验中，从外周血中分离有核白细胞、从脐带血中分离干细胞、以及小鼠等脾细胞的分离时需要去除红细胞，以便用于后续核酸或蛋白提取和分析检测，以及后续细胞原代培养或细胞融合等操作。
目前常用的有核细胞分离方法有：（1）Ficoll、Percoll密度梯度离心法，虽然目前公认去除红细胞好、能纯净分离出单核细胞，但是使用的淋巴细胞分离液试剂体积较大、操作繁琐耗时；（2）氯化铵裂解红细胞法，使用方便但去除红细胞效果不佳、需要反复洗涤，同时氯化铵溶液热稳定性差、需要现用现配或者低温冷藏保存/运输。例如，发明专利“一种红细胞裂解液及其裂解方法”（CN104178244A）公开了所用的红细胞裂解液含有氯化铵、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠等组分，使用时与全血需要混合15～30min，裂解效果不佳、且非常耗时，同时裂解液中氯化铵和碳酸氢钾组分都属于热不稳定组分，只能过滤除菌和冷藏保存，使用前还需要预热，其配制、使用和保存都不方便。发明专利“一种体外分离有核细胞且能去除红细胞的方法和试剂盒”（CN102747035A）也公开的红细胞裂解液由氯化铵和Tris-HCl组成，而发明专利“提取DNA的试剂及使用该试剂提取哺乳动物DNA的方法”（CN1635134A）公开的红细胞裂解液含有Tris-HCl、氯化镁和氯化钠，存在红细胞裂解不完全、有核细胞纯度低、操作时间长等不足。这些公开的红细胞裂解液的缺点将对后续有核细胞DNA提取或培养等造成不利影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂，红细胞裂解试剂含有以下组分：金属离子螯合剂、无机盐、表面活性剂以及溶液缓冲体系，试剂中的金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸钠（Edetate tetrasodium，EDTA）或次氮基三乙酸钠（nitrilotriacetic acid trisodium，NTA）、浓度为1～5mmol/L，无机盐为氯化钠（NaCl）或氯化钾（KCl）、浓度为15～50mmol/L，表面活性剂为曲拉通X-100（Triton X-100）或吐温20（Tween 20）、浓度为0.3～0.8%（v/v），溶液缓冲体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液、浓度为5～20mmol/L、pH范围为7.5～8.0。
本发明提供了无细胞核红细胞裂解试剂的使用方法，将全血或组织细胞样品和红细胞裂解液按1:2～1:5的比例混合1min，无核红细胞在溶液低渗环境和表面活性剂作用下破裂，离心弃上清，在富集的有核细胞沉淀中加入1～2ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀，离心弃上清后即获得完全去除红细胞的有核细胞富集沉淀，可用于下游DNA提取或细胞培养操作。
技术方案
本发明提供一种去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂，红细胞裂解试剂含有以下组分：金属离子螯合剂、无机盐、表面活性剂以及溶液缓冲体系，具体组成说明如下：
（1）金属离子螯合剂：用于螯合裂解溶液中的生物酶作用的钙镁等金属离子，本发明选择EDTA或NTA，在试剂中浓度为1～5mmol/L，优选的浓度为2mmol/L。
（2）无机盐：用于形成裂解溶液的低渗环境，本发明选择KCl或NaCl，浓度为15～50mmol/L，优选的浓度为35mmol/L。
（3）表面活性剂：用于溶液中辅助红细胞裂解，本发明选择Triton X-100或Tween20，浓度为0.3～0.8%（v/v），优选的浓度为0.5%（v/v）。
（4）溶液缓冲体系：用于构建稳定的溶液缓冲环境，本发明采用Tris-HCl缓冲液，浓度为5～20mmol/L，pH7.5～8.0，优选的浓度为10mmol/L Tris-HCl、pH7.8。
配制的红细胞裂解试剂经高压灭菌后，常温保存或运输。
使用方法
本发明还提供了红细胞裂解试剂的使用方法之一如下：
（1）取全血样品或组织细胞样品，按照和红细胞裂解试剂1:2～1:5的比例混合1min，10,000rpm离心1min弃上清液体保留细胞沉淀。
（2）在细胞沉淀中加入1～2ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀，10,000rpm离心1min弃上清液体保留细胞沉淀。
（3）在去除无核红细胞的沉淀中加入磷酸盐PBS缓冲液或细胞培养基重悬，用于下一步操作。
上述操作步骤所需时间在8min以内。
如果用于核酸提取，可在细胞沉淀中加入0.05～0.1ml DNA提取液，混合重悬沉淀，100℃保温5min；12,000rpm离心2min，吸取的上清中即为提取的细胞总DNA，包括细胞DNA、细胞内病毒DNA，可用于下游PCR等基因检测。
全血或组织细胞样品的无核红细胞裂解去除与富集有核细胞DNA提取的全部操作步骤时间在15min以内。
有益效果
本发明根据上述设计的技术方案，通过筛选细胞裂解试剂中的关键组分，并优化组分浓度与使用方法，研制成适用于去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂，其主要特点如下：
（1）生物样品中的无核红细胞在合适的低渗环境和表面活性剂化学作用下完全裂解，而有核细胞保持完整并得到富集，具有去除红细胞效率高、操作简便的优点。
（2）试剂组分简单且化学稳定，可高压灭菌，适合常温储存或运输，使用方便。
（3）试剂适用于生物样品中去除无核红细胞的富集细胞DNA提取，核酸提取效率高，方便下游基因操作检测。
（4）试剂配制和使用安全环保，对操作人员无毒害作用。
试剂盒的上述特点，均为采用筛选的关键组分与浓度优化后获得的较佳红细胞裂解试剂直接引起。从原理上说，本发明细胞裂解试剂利用化学作用在常温条件下裂解全血或组织细胞样品中的无核红细胞，不仅红细胞裂解充分，而且有核细胞得到富集。结合简便的DNA提取液，富集细胞中的基因组DNA或病毒DNA均能得到无损失提取，非常适合下游基因操作检测，提高靶核酸检出率。本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于人、鼠等脊椎哺乳动物全血或组织细胞样品中无核红细胞的裂解与有核细胞的富集。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中所涉及的主要试剂说明：
乙二胺四乙酸钠、次氮基三乙酸钠、氯化钾、氯化钠氨水为分析纯，Triton X-100、Tween 20、Tris为生物级纯度，这些化学试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。EB病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒为上海复星长征医学科学有限公司产品。
实施例1：红细胞裂解试剂的配制
按照发明内容配制4种红细胞裂解试剂A～D，并配制作为对照的细胞裂解试剂E（ACK氯化铵红细胞裂解液），如下：
（1）红细胞裂解试剂A
EDTA 5mmol/L， NaCl 15 mmol/L，Tween 20 0.4%（v/v），Tris-HCl 5 mmol/L，pH值约8.0。
（2）红细胞裂解试剂B
NTA 3mmol/L， NaCl 50 mmol/L，Triton X-100 0.8%（v/v），Tris-HCl 15 mmol/L，pH值约7.6。
（3）红细胞裂解试剂C
EDTA 1mmol/L， KCl 40 mmol/L，Triton X-100 0.3%（v/v），Tris-HCl 20 mmol/L，pH值约7.5。
（4）红细胞裂解试剂D
EDTA 2mmol/L， NaCl 35 mmol/L，Triton X-100 0.5%（v/v），Tris-HCl 10 mmol/L，试剂pH值约7.8。
（5）红细胞裂解试剂E
NH4Cl 155 mmol/L， KHCO3 12mmol/L， EDTA 0.15mmol/L，pH7.2-7.4。
上述红细胞裂解试剂A-D配制后121℃高压灭菌20min，常温保存；红细胞裂解试剂E配制后0.2μm滤膜过滤除菌，2～8℃保存。
实施例2：不同配方细胞裂解试剂对外周血红细胞的裂解去除效果比较
（1）样品采集：采集EDTA抗凝全血1份，体积为5ml，混匀后按400μl/管分装到2ml离心管，共分装10管样品。
（2）取实施例1中配制的5种红细胞裂解试剂，按全血：红细胞裂解液体积为1:3比例，吸取红细胞裂解试剂各1.2ml加入分装的全血中，每种红细胞裂解液裂解2管样品共5组10管样品，充分混匀1min。
（3）将5组10管溶液按10,000rpm离心1min，弃上清液体保留富集的细胞沉淀。
（4）在富集的细胞沉淀中加入1ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀。
（5）将5组10管溶液按10,000rpm离心1min弃上清液体保留细胞沉淀。
（6）在去除无核红细胞的沉淀中加入0.5ml 磷酸盐PBS缓冲液重悬，混匀后取样置于显微镜细胞计数板上，观察视野中的红细胞残留数量。
从如表1可知，和对照红ACK细胞裂解试剂E比较，本发明提供的红细胞裂解试剂A～D在细胞计数板4个大方格中的残留红细胞数极少、且白细胞保持完整，说明红细胞裂解效果良好。
表1 取样镜检5种红细胞裂解样品每个视野中残留的红细胞数量
| 全血 | 裂解试剂A | 裂解试剂B | 裂解试剂C | 裂解试剂D | 裂解试剂E |
| 样品1 | 1 | 2 | 3 | 0 | 53 |
| 样品2 | 2 | 0 | 5 | 0 | 47 |
实施例3：细胞裂解试剂在EB病毒阳性全血样品中的DNA提取应用
（1）DNA提取液：按10mmol/L NaOH、0.1% SDS配方配制，用于DNA提取。
（2）样本采集：人体感染EB病毒引起的相关疾病多样，首先在口咽部上皮细胞增殖，然后感染B淋巴细胞，进入血液循环造成全身性感染，并能长期潜伏在人体淋巴组织和白细胞中。本发明从临床采集经鉴定为EB病毒（Epstein-barr virus）阳性的EDTA抗凝人全血样本5例，每例各分装出400μl/管置于1.5ml离心管，分为2组共10管。
（3）取实施例1和2中经试验裂解红细胞效果较好的红细胞裂解试剂D、以及对照红细胞裂解试剂E，按照全血和红细胞裂解试剂1:2.5的比例，分别将两种裂解试剂按1ml体积加入上面2组分装好的EB病毒阳性全血样品中，混合1min。
（4）将两组溶液按10,000rpm离心1min弃上清液体保留富集的细胞沉淀。
（5）在富集的细胞沉淀中加入1ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀。
（6）将两组溶液10,000rpm离心1min弃上清液体保留细胞沉淀
（7）在富集的细胞沉淀中加入0.05 ml DNA提取液，混合重悬沉淀，100℃保温5min。
（8）12,000rpm离心2min，吸取的上清中含有提取的细胞DNA和EB病毒DNA。
（9）荧光PCR检测：
按照上海复星长征医学科学有限公司EB病毒核酸定量检测试剂说明书配制反应液，加入上述两种红细胞裂解试剂裂解和快速提取的两组各5例样品DNA各10μl，每个反应管体积为30 μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃ 10秒→60℃ 45秒，循环45次，60℃采集FAM、JOE荧光通道的信号（分别对照EB病毒、管家基因内参照）。扩增结束后按仪器软件分析Ct值结果如表2所示。
可知与对照红细胞裂解试剂E比较，本发明提供的红细胞裂解试剂D处理5例EB病毒样品提取DNA检测结果均为EB病毒阳性、内参照检测也为阳性；而对照红细胞裂解试剂E有2例结果为阴性，且EB病毒和内参照检测Ct值总体滞后于本发明红细胞裂解试剂D试验组，说明本发明提供的去除红细胞裂解试剂能在富集的白细胞DNA提取效果较好。
表2 细胞裂解试剂D和E对EB病毒阳性全血样品裂解提取检测结果
Claims (10)
1.本发明一种去除生物样品中无细胞核红细胞的裂解试剂，其特征在于，红细胞裂解试剂含有以下组分：金属离子螯合剂、无机盐、表面活性剂以及溶液缓冲体系。
2.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，金属螯合剂为乙二胺四乙酸钠或次氮基三乙酸钠，浓度为1～5mmol/L。
3.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，无机盐为氯化钠或氯化钾，浓度为15～50mmol/L。
4.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，表面活性剂为曲拉通 X-100或吐温20，浓度为0.3～0.8%（v/v）。
5.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，溶液缓冲体系为Tris-HCl缓冲液，浓度为5～20mmol/L，pH7.5～8.0。
6.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，试剂含有2mmol/L 乙二胺四乙酸钠或次氮基三乙酸钠、35mmol/L 氯化钠或氯化钾、0.5%（v/v）曲拉通 X-100或吐温20、10mmol/L Tris-HCl，pH7.8。
7.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，涉及的生物样品是指人、鼠等脊椎哺乳生物的全血样品或组织细胞样品。
8.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其特征在于，裂解生物样品无核红细胞的操作步骤为：（1）取全血样品或组织细胞样品，按照和红细胞裂解试剂1:2～1:5的比例混合1min，10,000rpm离心1min弃上清液体保留富集的细胞沉淀；（2）在富集的细胞沉淀中加入1～2ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀，10,000rpm离心1min弃上清液体保留细胞沉淀；（3）在去除无核红细胞的沉淀中加入磷酸盐PBS缓冲液或细胞培养基重悬，用于核酸或蛋白提取和分析检测，以及后续细胞原代培养或细胞融合等操作。
9.如权利要求1所述的红细胞裂解试剂在生物样品DNA提取中的应用，其特征在于，操作步骤为：（1）取全血样品或组织细胞样品，按照和红细胞裂解试剂1:2～1:5的比例混合1min，10,000rpm离心1min弃上清液体保留富集的细胞沉淀；（2）在富集的细胞沉淀中加入1～2ml红细胞裂解试剂，混匀重悬沉淀，10,000rpm离心1min弃上清液体保留细胞沉淀；（3）在富集的细胞沉淀中加入0.05～0.1ml DNA提取液，混合重悬沉淀，100℃保温5min；（4）12,000rpm离心2min，吸取的上清中即为提取的细胞总DNA，可用于下游PCR等基因检测。
10.如权利要求9所述的红细胞裂解试剂在生物样品DNA提取中的应用，其特征在于，DNA提取液含有10mmol/L NaOH、0.1% SDS。
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