CN103570812B - 来源于羊草与耐低温相关的转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种源于羊草并与植物耐低温相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，-8℃低温胁迫处理24h后第14天，野生型拟南芥植株有约81%的植株出现叶片失水萎蔫症状，叶片颜色变白，部分或全部死亡；而转LcWRKY3基因拟南芥苗植株有约84%的植株生长正常，只有约16%的植株出现叶片发白症状，可见本发明对于培育耐冷性提高的植物新品种具有重要理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高际应用价值。

Description

来源于羊草与耐低温相关的转录因子及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种源于羊草并与植物耐低温相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于WRKY家族的羊草冷诱导转录因子及其编码基因与在培育耐低温性提高的植物中的应用。
背景技术
低温胁迫是影响植物正常生长的主要障碍因子之一，植物尤其是经济作物的抗冷性强弱直接影响作物产量。目前抗冷基因的鉴定多集中于拟南芥、水稻等模式植物以及玉米和棉花等重要农作物。它们多为热带起源的植物，都不能忍受冷环境，0℃～12℃即造成伤害。因此，亟需从其它抗冷性强的植物中挖掘相关基因。我国是世界上生物多样性最丰富的国家和主要作物的起源中心之一，不仅植物遗传资源种类多，而且许多是适应恶劣极端环境的野生种，这些物种在抗寒、抗旱和耐盐碱等方面具有明显的优势，是当前和未来农业可持续发展的基础。长期以来，人们对植物响应冷胁迫的机制已经从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度进行了很多研究，积累了丰富的知识。近年来，随着分子生物学的发展，人们进一步在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上加深了对植物抗冷机理的认识，为利用基因工程方法改良植物的抗冷性能提供了坚实的基础。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗旱性十分困难。转基因等基因工程方法为植物抗冷育种提供了有效途径，但高效抗冷基因的分离是限制植物抗冷基因工程的关键因素。
WRKY转录因子是近年来新发现的植物特有新型锌指型转录调控因子，因在其N-端含有由WRKYGQK组成的高度保守的7个氨基酸序列而得名。目前在拟南芥中共发现了74个WRKY成员，而水稻中则发现了105个完整的WRKY成员。研究发现，WRKY结构域及其专一结合的(T)(T)TGAC(C/T)序列（又称W-box）更多地存在于与抗病、损伤、衰老相关基因和水杨酸诱导基因的上游调控区域。
植物抗冷性受多基因调控，要使众多对植物抗逆性状产生作用的功能基因协调发挥作用，才能有效改良植物抗冷性。由于一个抗冷相关转录因子可以调控多个基因的表达，增强一个转录因子的作用就可使植株的抗冷性状得到综合改善。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物耐低温相关的蛋白及其编码基因和应用。
本发明所提供的蛋白质，名称为LcWRKY3，来源于羊草（Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
序列表中序列1由338个氨基酸残基组成。LcWRKY3蛋白在第270-330位氨基酸残基间序列为一个保守的WRKY DNA结合域，221-227位氨基酸残基间序列为可能的核定位信号PRRRCSG。
为了便于LcWRKY3蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
  标签 残基   序列
  Poly-Arg 5-6（通常为5个）   RRRRR
  Poly-His 2-10（通常为6个）   HHHHHH
  FLAG 8   DYKDDDDK
  Strep-tag II 8   WSHPQFEK
  c-myc 10   EQKLISEEDL
上述（a）中的LcWRKY3蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的LcWRKY3蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。
编码所述LcWRKY3蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述LcWRKY3蛋白的基因（命名为LcWRKY3）；所述LcWRKY3基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列2由1017个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组克隆载体具体为将所述核酸分子（基因）连入pMDTM19-T Simple载体所得的重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述LcWRKY3基因转录的启动子具体为如下两种中的任一种：
（1）35S启动子
（2）ADH1启动子。
更为具体的，所述重组表达载体可为如下三种中的任一种：
（1）在p3301-121载体的多克隆位点处***所述LcWRKY3基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为BamH I和Sma I。
（2）在pBridge-BD载体（Clotech公司，Cat No.630404）的多克隆位点处***所述LcWRKY3基因得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为EcoRⅠ和Sal I。
所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：
（1）将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoR I双酶切，回收载体大片段；
（2）将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含GUS基因的片段；
（3）将步骤（1）中回收的载体大片段与步骤（2）中回收的包含GUS基因的片段连接，得到重组载体p3301-121。
所述表达盒由能够启动所述LcWRKY3基因表达的启动子，所述LcWRKY3基因，以及转录终止序列组成。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述LcWRKY3基因的重组酵母；所述酵母具体可为AH109。
所述LcWRKY3蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用也属于本发明的保护范围：
a1）调控植物的耐低温性；
a2）选育耐低温植物品种。
在本发明的一个实施例中，所述调控植株耐低温性具体为提高植物的耐低温性。
所述选育耐低温植物品种的方法，具体可包括将所述LcWRKY3蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育耐低温性提高的转基因植物的方法。
该方法包括将编码所述LcWRKY3蛋白的基因导入目的植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，耐低温性提高。
所述LcWRKY3蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述LcWRKY3蛋白的基因（即LcWRKY3基因）是所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
所述LcWRKY3基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。
所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。
在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥品种哥伦比亚（Col-0）。
所述LcWRKY3蛋白在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。
扩增所述LcWRKY3基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
在本发明的一个实施例中，所述引物对具体为由序列表中序列3和序列4所示的两条DNA单链所组成的引物对。
本发明提供的LcWRKY3具有组织表达特异性，受低温诱导表达，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性：-8℃低温培养箱进行低温胁迫处理24h后的第14天，野生型拟南芥植株有约81%的植株出现叶片失水萎蔫症状，叶片颜色变白，部分或全部死亡；而转LcWRKY3基因拟南芥苗植株有约84%的植株生长正常，只有约16%的植株出现叶片发白症状。可见LcWRKY3及其编码基因对于培育抗冷性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。本发明在农业、畜牧业领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为羊草总RNA的电泳图谱。其中，泳道CK为野生型羊草苗；泳道1为低温处理6小时羊草苗；泳道2为低温处理12小时苗。
图2为LcWRKY3基因的全长cDNA序列PCR扩增产物。其中，泳道M为DL2000Plus DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准；泳道1为PCR扩增产物。
图3为LcWRKY3基因在不同胁迫条件下的表达量分析。其中，A为不同逆境处理6小时表达分析；B为不同激素处理6小时表达分析。A和B中，CK均表示未经任何胁迫处理为对照。
图4为LcWRKY3基因在不同组织中的表达量分析。
图5为酵母单杂验证LcWRKY3基因的转录激活功能结果。其中，A为转化后酵母在缺少色氨酸、组氨酸的选择培养基生长状况；B为β-半乳糖苷酶活性滤纸分析；C为A和B的分布图。WKRY3表示含有pBridge-LcWRKY3的酵母菌株；CK-表示阴性对照；CK+表示阳性对照。
图6为重组表达载体p3301-121-LcWRKY3的构建流程图。
图7为重组载体p3301-121的构建流程图。
图8为重组农杆菌的PCR鉴定结果。其中，泳道M为DL2000Plus DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准；泳道1-10为10个重组农杆菌的鉴定结果。
图9为T2代的转基因拟南芥的PCR鉴定结果。其中，泳道1-8为转基因LcWRKY3拟南芥8个株系PCR鉴定结果；泳道M为DL2000 Plus DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准。
图10为T2代转LcWRKY3基因拟南芥的耐低温性检测结果。其中，平皿的上半部分（黑色线条的上方）为野生型（WT）；平皿的下半部分（黑色线条的下方）为转基因株系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与植物耐低温性相关的基因LcWRKY3的获得
1、植物材料处理及总RNA的提取
以羊草（Leymus chinensis(Trin.)品种吉生一号（吉林省吉生羊草良种站）幼苗为材料，4℃处理6小时和12小时后分别提取总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18SRNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。
2、与植物耐低温性相关的基因LcWRKY3的全长cDNA序列的获得及PCR检测
与植物耐低温性相关的基因LcWRKY3的3’端序列由本实验室四五四测序所得。用获得的LcWRKY3基因3’端cDNA序列在NCBI上进行BLAST比对，发现其同源基因在5’端很保守，故根据其同源基因翻译起始位置设计上游引物LcWRKY3F：5’-ATGGAGGAAGTGGAGGAGGC-3’（序列2的前20位），根据获得的LcWRKY3基因3’端cDNA序列设计下游引物LcWRKY3R：5’-CTAAGCTTGCGCAGACTGAGT-3’第1-21位为序列2的后997-1017位的反向互补序列）。
以步骤1提取的经4℃处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用takara公司反转录试剂盒RT-PCR Kit（目录号DRR014A），并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系（20μl）：1μl RNA，1μl Oligo dT引物（50μM），4μl缓冲液，0.5μl RNA酶抑制剂（40U/μl），1μl dNTP Mix(10mM)，1μlRTase（200U/μl），11.5μl无RNA酶水（反应体系中所涉及的各种溶液均为试剂盒所带）。反应条件：65°C2min，冰上2min，42°C1.5h，72°C7min。
以获得的第一链cDNA为模板，引物LcWRKY3F与引物LcWRKY3R配对进行PCR扩增；PCR反应体系（50μl）：1μl50×HIFI Polymerase，33.5μl PCR-Grade Water，5μl10×HIFI Polymerase BufferⅡ，4μl dNTP Mix(10mM)，2μl引物LcWRKY3F，2μl引物LcWRKY3R，2.5μl cDNA模板（反应体系中所涉及的各种溶液来自TransTaq HighFidelity(HiFi)PCR SuperMix，AS131-21，北京全式金生物技术有限公司）。反应条件：先94℃30s，然后60℃30s，72℃90s，共35个循环；最后70℃延伸10min。
反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，经PCR扩增获得了长度约为1000bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。结果表明，该片段的长度为1023bp，在3’端与步骤一获得的序列完全相同，故与步骤一获得的3’端为同一基因，该片段包含LcWRKY3基因的全长cDNA序列（序列表中序列2）。序列表中序列2自5’端第1位-第1014位，即整个序列2为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的蛋白质。序列表中序列1由338个氨基酸残基组成。将该基因命名为LcWRKY3，将其编码的蛋白命名为LcWRKY3。
实施例2、LcWRKY3及其编码蛋白的生物信息学分析
一、LcWRKY3基因的序列分析及其编码蛋白的结构功能预测
利用DNAMAN和DNAstar软件对实施例1获得的LcWRKY3的全长cDNA序列进行生物信息学分析，编码由338个氨基酸残基组成的蛋白质LcWRKY3。推测其分子量为35.511kDa，等电点PI值9.752。用在线Blast工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析LcWRKY3的结构域，结果表明，LcWRKY3蛋白在第270-330位氨基酸残基间序列为一个保守的WRKY DNA结合域，221-227位氨基酸残基间序列为可能的核定位信号PRRRCSG。表明该蛋白是WRKY转录因子超家族中的一员。
二、羊草LcWRKY3与植物中其它WRKY转录因子氨基酸序列的同源性及***进化树分析
用DNAMAN软件对LcWRKY3与其他WRKY第Ⅱd类转录因子蛋白多重比对的结果表明：LcWRKY3与其他WRKY转录因子在WRKY结构域处高度同源，说明LcWRKY3与其他WRKY转录因子在DNA结合区域高度保守；LcWRKY3在C端含有一个C-motif，而属于第Ⅱd类WRKY转录因子的烟草NtWRKY3和拟南芥AtWRKY39、AtWRKY74、AtWRKY11也含有此结构，说明LcWRKY3也属于第Ⅱd类WRKY转录因子。LcWRKY3与烟草中的NtWRKY3同源率为35.1%，与拟南芥中的AtWRKY39，AtWRKY74和AtWRKY11的同源率分别为51.6%、51.7%和37.4%。
实施例3、LcWRKY3在不同非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式分析及组织特异性表达分析
一、LcWRKY3在不同非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式分析
将正常生长9周的羊草（吉生一号，吉林省吉生羊草良种站）幼苗进行不同非生物胁迫：400mM NaCl、42℃高温、4℃处理6小时和不同激素：100μM6-苄基腺嘌呤（BAP）、100μM水杨酸（SA）、100μM茉莉酸甲酯（MJ）、100μM赤霉素（GA）、100μM脱落酸（ABA）处理6小时。分别提取上述处理羊草幼苗的总RNA，分别使用LcWRKY3基因引物（上游引物：5'-AAGCTGGTCCAGCCATTGTC-3'（序列2的第370-389位）；下游引物：5'-CGTCCTCTTCACCCGCAAC-3'（序列2的第750-768位的反向互补序列））以Actin基因引物（上游引物：5′-GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT-3′；下游引物：5′-CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC-3′）为内参，通过RT-PCR（94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环）方法分析LcWRKY3基因在不同非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式。同时设置未经任何胁迫的对照（CK）。
结果如图3所示，在羊草幼苗受到4℃低温处理6h时LcWRKY3的表达量变化明显，而在NaCl和42℃高温处理中表达量变化不明显，说明LcWRKY3对低温胁迫响应，推测其在低温胁迫中可能发挥作用。
二、LcWRKY3基因的组织特异性表达分析
分别提取将正常生长9周的羊草（吉生一号，吉林省吉生羊草良种站）幼苗的根、根茎、茎、叶和叶鞘五种组织的总RNA。分别使用LcWRKY3基因引物（上游引物：5'-AAGCTGGTCCAGCCATTGTC-3'（序列2的第370-389位）；下游引物：5'-CGTCCTCTTCACCCGCAAC-3'（序列2的第750-768位的反向互补序列））以Actin基因引物（上游引物：5′-GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT-3′；下游引物：5′-CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC-3′）为内参，通过RT-PCR（94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环）进行半定量分析。
结果如图4所示，LcWRKY3在羊草幼苗的根、根茎、茎、叶、叶鞘都有表达，在根、根茎、茎和叶鞘中的表达丰度相对较低，而在叶中的表达量相对较高。
实施例4、酵母单杂验证LcWRKY3基因的转录激活功能
用于酵母单杂交***的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子，含pBridge-BD空载体的酵母菌株，因没有表达与酵母中目的基因相互作用的结合蛋白，无法在色氨酸和组氨酸双缺陷培养基上生长，用β-半乳糖苷酶活性滤纸分析时没有呈现蓝色，将有pBridge-LcWRKY3和阳性对照pBridge-JcERF质粒的酵母菌株表达的蛋白可与目的基因互作，启动下游基因表达，所以能在色氨酸和组氨酸双缺陷培养基上生长，当用β-半乳糖苷酶活性滤纸分析时呈现明显的蓝色，说明LcWRKY3转录因子具有明显的转录激活功能。
一、酵母重组表达载体pBridge-LcWRKY3的构建
以上述实施例1扩增得到的LcWRKY3基因（序列2）为模板，以含有EcoRⅠ和Sal I酶切位点的引物LcWRKY3-EcoR-F和LcWRKY3-Sal-R进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段回收并纯化，将其连接到pMD-19T simple（TaKaRa Code:D104A）载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。
LcWRKY3-EcoR-F：5′-CGGAATTCATGGAGGAAGTGGAGGAGGC-3′（下划线为EcoRⅠ位点，其后的序列为序列2的前20位）
LcWRKY3-Sal-R：5′-GCGTCGACAGCTTGCGCAGACTGAGTTG-3′（下划线为SalI位点，其后的序列为序列2的后20位的反向互补序列）
测序结果表明，扩增出的片段具有序列2中的自5’端第1-1014位所示的核苷酸序列。提取测序结果正确的克隆中的质粒，命名为pMD19-LcWRKY3，用EcoRⅠ和Sal I酶切pMD19-LcWRKY3，回收约1kb的LcWRKY3基因片段，同时用限制性内切酶EcoRⅠ和Sal I双酶切酵母表达载体pBridge-BD（Clotech公司，Cat No.630404），回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的约1kb的LcWRKY3基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证。将经测序表明在载体pBridge-BD的EcoRⅠ和Sal I酶切位点间***了序列表中序列2的第1到1014位所示的LcWRKY3基因片段，证明质粒构建正确，将其命名为pBridge-LcWRKY3。
二、酵母单杂验证LcWRKY3基因的转录激活功能
将步骤一构建的酵母重组表达载体pBridge-LcWRKY3重组质粒转化DH5α，从大肠杆菌提取重组质粒，转化酵母AH109（Clontech公司，Cat No.630303）。在色氨酸和组氨酸双缺陷培养基（泛基诺公司，010-62081950，酵母色氨酸和组氨酸双缺陷培养基）上筛选pBridge-LcWRKY3转化后的酵母AH109，然后用β-半乳糖苷酶活性滤纸显蓝分析。同时设置转入pBridge-BD空载体的对照（阴性对照），以及转入pBridge-JcERF质粒的阳性对照（已有实验证明并发表文章pBridge-JcERF具有转录激活能力，文献：Mingjuan Tang,Jingwen Sun,Yun Liu,Fan Chen,Shihua Shen.Isolation andfunctional characterization of the JcERF gene,a putative AP2/EREBP domain-containingtranscription factor,in the woody oil plant Jatropha curcas.Plant Mol Biol(2007)63:419–428）
结果如图5所示，含pBridge-BD空载体的酵母菌株无法在色氨酸和组氨酸双缺陷培养基上生长，而含有pBridge-LcWRKY3和阳性对照pBridge-JcERF质粒的酵母菌株不仅能在色氨酸和组氨酸双缺陷培养基上生长，当用β-半乳糖苷酶活性滤纸显蓝分析时呈现明显的蓝色，说明LcWRKY3转录因子具有明显的转录激活功能。
实施例5、转LcWRKY3基因拟南芥植株的获得及耐低温性分析
一、转LcWRKY3基因拟南芥植株的获得
1、重组表达载体p3301-121-LcWRKY3的构建
根据上述实施例1扩增得到的LcWRKY3基因设计引物，加入BamH I和Sma I酶切位点，引物序列如下：
引物1：5′-CGGGATCCATGGAGGAAGTGGAGGAGGC-3′（下划线为BamH I位点，其后的序列为序列2的前20位）（序列表中序列3），
引物2：5′-TCCCCCGGGCTAAGCTTGCGCAGACTGAG-3′（下划线为Sma I位点，其后的序列为序列2的后20位的反向互补序列）（序列表中序列4）
以人工合成的序列表中序列2所示的LcWRKY3基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物克隆入pMD19-T Simple(TaKaRa公司)载体，命名为pMD19-LcWRKY3。将pMD19-LcWRKY3利用BamH I和Sma I进行双酶切，回收约1kb的片段，同时用BamH I和Sma I双酶切p3301-121载体（其构建方法见下文）,回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的约1kb的LcWRKY3基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体p3301-121的BamH I和Sma I酶切位点间***了序列表中序列2所示的LcWRKY3基因片段，证明质粒构建正确，该重组质粒含有LcWRKY3基因完整阅读框，将其命名为p3301-121-LcWRKY3，构建过程如图6所示。
所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：
（1）将pCAMBIA3301载体（CAMBIA公司）经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11246bp的载体大片段；
（2）将pBI121载体（Clontech公司）（含35S启动子，GUS报告基因，Tnos）也经过HindIII和EcoR I双酶切，回收包含GUS基因的2942bp的片段；
（3）将步骤（1）中回收的载体大片段与步骤（2）中回收的包含GUS基因的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体p3301-121（图7）。
2、转LcWRKY3基因拟南芥植株的获得
将上述步骤1构建好的重组植物p3301-121-LcWRKY3通过冻融法（参考Holsters M,DE WAELE D,DEPICKER A,et al.Transfection and transformation of Agrobacteriumtumefaciens.等Mol.Gen.Genet.1978,183:181-187）转入农杆菌EHA105（北京拜尔迪生物技术有限公司）。对转化后的重组农杆菌用由引物1（序列表中序列3）和引物2（序列表中序列4）组成的引物对进行PCR鉴定，鉴定结果见图8。将经鉴定表明含有LcWRKY3基因（PCR目的条带大小为1034bp）的农杆菌EHA105命名为EHA105/p3301-121-LcWRKY3；将转入p3301-121空载体的农杆菌EHA105命名为EHA105/p3301-121。
采用农杆菌花序侵染的方法（Bechtold N等，(1993)In plantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants.C.R.Acad.Sci.316:1194–1199）将上述所得的重组农杆菌EHA105/p3301-121-LcMYB7342（或EHA105/p3301-121）转化拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)（Carolina Biological Supply Company公司，Arabidopsis:Columbia(Col-0)Seed，货号：177600）。转化后暗培养2天，进行第二次浸染，然后正常培养到收获种子（T0）。收获的种子在含除草剂抗性的平板（1/2MS+10mg/L草胺磷）上进行抗性筛选，收获抗性苗的种子（T1），收获的种子在含除草剂的平板（1/2MS+10mg/L草胺磷）上种植，筛选后代分离比为3：1的株系，收获其种子（T2）。
进一步对用T2代的转基因拟南芥苗进行PCR检测，以转基因拟南芥苗的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为上述步骤1中的引物1和引物2。
PCR检测结果如图9所示，不同的转基因株系均扩增得到了长度约为1kb的片段。而用同样的引物对转空载体的拟南芥对照植株和野生型拟南芥植株进行PCR检测，均未得到上述扩增片段。此结果表明，所检测的8个（图9泳道1-8）转LcWRKY3基因株系均为阳性。
二、转LcWRKY3基因拟南芥植株的抗低温性分析
将经上述步骤一验证的T2代转LcWRKY3基因拟南芥植株中的5个株系的种子随机分成两组，每组100粒种子，两组均种于含除草剂培养基（MS+10mg/L草胺磷）上，萌发生长（萌发生长条件为：温度为22-24℃，16小时光照8小时黑暗的光周期，空气湿度为60%-80%）一周，然后均移栽到MS培养基上在培养室培养2天（培养室培养的条件：温度为22-24℃，16小时光照8小时黑暗的光周期，空气湿度为50-60%）。2天后，将其中一组放4℃低温驯化48小时，转入-8℃低温培养箱进行低温胁迫处理24小时，再将其取出放4℃24小时，然后放回培养箱22-24℃恢复生长。另外一组则一直正常培养。从低温胁迫的第3天（即从胁迫处理开始时计起，第3天）开始观察植株表型，观察到胁迫处理的第14天，并统计植株受害百分率。同时设置野生型拟南芥植株（WT）作为对照组。同时设置转空载的拟南芥植株EHA105/p3301-121和野生型拟南芥植株（WT）作为对照组。实验设3次重复，结果取3次重复的平均值。
结果如图10和表1所示：野生型拟南芥植株有约81%的植株出现叶片失水萎蔫症状，叶片颜色变白，部分或全部死亡；而转LcWRKY3基因拟南芥苗植株有约84%的植株生长正常，只有约16%的植株出现叶片发白症状。转空载的拟南芥植株表型与野生型拟南芥基本一致，植株受害百分率无显著差异。该实验结果表明转LcWRKY3基因拟南芥与野生型拟南芥相比，具有更强的耐低温能力。
表1转LcWRKY3基因拟南芥在低温胁迫（-8℃）下的存活率统计

Claims (13)

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。
7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为如下两种中的任一种：
(1)35S启动子；
(2)ADH1启动子。
9.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或7或8所述的重组载体，或权利要求5所述的表达盒，或权利要求6所述的重组菌，在如下a1)或a2)中的应用：
a1)调控植物的耐低温性；
a2)选育耐低温植物品种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
11.一种培育耐低温性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，耐低温性提高。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
13.权利要求1所述蛋白质在作为转录因子中的应用。
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