CN103509096B - 植物耐逆性相关蛋白GmNF-YB6及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YB6及其编码基因和应用。本发明所提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加,且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的GmNF-YB6可以在低温、干旱和高温的诱导性下表达，可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件（核心元件CCAAT）的基因的转录表达，可以提高植物的耐旱性、抗冻性和耐高温能力。本发明的GmNF-YB6为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用这为人为控制耐逆相关基因的表达提供了基础，将在耐逆性增强的植物育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YB6及其编码基因和应用。
背景技术
干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的重要任务之一。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子（蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等）合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。
目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2（APETALA2）/EREBP（乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein）转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP（basic region/leucine zippermotif transcription factors）类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF（CCAAT binding factor）类转录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇（Trp cluster）的MYB家族。
NF-Y是一类结合顺式作用元件CCAAT-box的转录因子，特异的识别并结合许多真核生物组成型、诱导性和细胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的顺式作用元件CCAAT-box，进而在转录水平调控这些基因的表达。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个不同亚基组成的杂合三聚体。NF-YB蛋白与NF-YC蛋白通过彼此的HFM保守域，采用头尾相接的方式形成异源二聚体互作平台，吸引NF-YA蛋白结合到这个二聚体平台从而形成具有活性的异源三聚体核转录因子。NF-Y通过NF-YA亚基上的DNA结合域结合到靶基因启动子部分的CCAAT盒，执行转录激活或转录抑制功能。NF-Y的三个亚基的保守域分别具有不同的蛋白结构域,其中NF-YA保守域具有DNA结合结构域（DNAbinding domain）和与NF-YB/C异源二聚体互作结构域（subunit interaction domain）。NF-YB和NF-YC蛋白保守域则由组蛋白折叠基序（Histone-fold motif）构成。其中NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相似，而NF-YC与H2A组蛋白折叠基序相似，组蛋白基序由三个α螺旋和两个环组成，负责H2A/H2B二聚体的形成。
由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键转录因子促进多个功能基因的表达，增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物耐逆性相关的蛋白质。
本发明所提供的蛋白质是一种结合CCAAT-box的核转录因子蛋白，名称为GmNF-YB6，来源于大豆属大豆（Glycine max L.），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
序列1的蛋白质由122个氨基酸残基组成。
为了使（a）中的GmNF-YB6便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的GmNF-YB6可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的GmNF-YB6的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述GmNF-YB6蛋白的基因（命名为GmNF-YB6）；所述GmNF-YB6基因为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列2中由369个核苷酸组成，开放阅读框架为整个序列2，编码序列表中序列1所示的蛋白质（GmNF-YB6）。
含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
可用现有的植物表达载体构建含有所述核酸分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti）质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如小麦贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建所述重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为如下a1）或a2）：
a1）35S启动子，如CaMV 35S启动子；
a2）Pmin启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为如下b1）或b2）所述重组质粒：
b1）在pBI121载体的多克隆位点（Sma Ⅰ和Sac I）之间***所述GmNF-YB6基因得到的重组质粒。
b2）在YEP-GAP载体（参考文献Liu Q，Kasuga M，SakumaY，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Two transcription factors,DREB 1and DREB2,withan EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively，in Arabidopsis,Plant Cell 1998Aug;10(8):1391-1406）的多克隆位点（BamH I和Xho I）之间***所述GmNF-YB6基因得到的重组质粒。
所述GmNF-YB6蛋白或所述核酸分子在调控植物耐逆性中的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明中，所述调控植物耐逆性具体体现为提高植物的耐逆性。
本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性转基因植物的方法。
该方法包括如下步骤：将所述GmNF-YB6蛋白的编码基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比耐逆性更高的转基因植物。
在本发明中，所有所述耐逆性具体可为耐旱性，和/或抗冻性，和/或耐高温。所述耐旱性，和/或抗冻性，和/或耐高温的提高具体可体现在植株在相应逆境胁迫下存活率的提高上。
所述GmNF-YB6蛋白的编码基因为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
所述GmNF-YB6基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述GmNF-YB6基因的所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化目的植物，如植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述目的植物既可以是双子叶植物也可以是单子叶植物。在本发明的另一个实施例中，所述植物具体为双子叶植物拟南芥，如拟南芥品种哥伦比亚生态型Col-0。
所述GmNF-YB6蛋白质在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。所述转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能。
本发明所提供的GmNF-YB6可以在低温、干旱和高温的诱导性下表达，可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件（核心元件CCAAT）的基因的转录表达，可以提高植物的耐旱性、抗冻性和耐高温能力。本发明的GmNF-YB6为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
附图说明
图1为GmNF-YB6受胁迫诱导表达的荧光实时定量（Real-time）PCR图谱。
图2为重组表达载体pBI121-GmNF-YB6的质粒图谱。。
图3为T3代转GmNF-YB6基因拟南芥中的GmNF-YB6基因的cDNA水平检测结果。其中，泳道M为Marker（条带自上而下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）；泳道col为哥伦比亚生态型拟南芥植物；泳道1-4分别为4个待鉴定转GmNF-YB6基因拟南芥植株。
图4为T3代转GmNF-YB6基因拟南芥和野生型拟南芥耐旱性比较。其中，A为干旱处理前；B为干旱处理14天后；C为复水3天后。TL表示T3代转GmNF-YB6基因拟南芥。
图5为T3代转GmNF-YB6基因拟南芥和野生型拟南芥抗冻性比较。其中，A为低温处理前；B为低温处理恢复3天后。TL表示T3代转GmNF-YB6基因拟南芥。
图6为T3代转GmNF-YB6基因拟南芥和野生型拟南芥耐高温比较。其中，A为高温处理前；B为高温处理恢复3天后。TL表示T3代转GmNF-YB6基因拟南芥。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、GmNF-YB6的克隆
一、mRNA的分离
将水培的生长10天左右的大豆（Glycine max L.）品种铁丰8号（参考文献：孙啸,董建辉,陈明,徐兆师,叶兴国,李连城,曲延英,马有志.2008.大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析.作物学报,34(8):14751479）四叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit（Pharmacia）进行mRNA的分离。第一链cDNA合成用反转录酶XL（AMV）。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
二、GmNF-YB6基因全长序列的获得
通过5’RACE和3’RACE的方法获得大豆CCAAT-box的核转录因子B族基因全长序列。
该基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因命名为GmNF-YB6基因，其开放阅读框为序列2整个序列。GmNF-YB6基因编码序列表中序列1所示的蛋白质（命名为GmNF-YB6蛋白），GmNF-YB6蛋白由122个氨基酸残基组成，具有保守的组蛋白折叠基序。
实施例2、实时荧光定量PCR分析GmNF-YB6的表达特性
一、胁迫处理
苗龄为10天的大豆品种铁丰8号幼苗，进行以下处理：
（1）干旱处理：将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
（2）低温处理：将大豆幼苗置于4℃培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。
（3）高温处理：将大豆幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。
（4）对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照（0小时）。
二、mRNA的分离
采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit（Pharmacia）对步骤一得到的各样品进行mRNA的分离。
三、反转录为cDNA
将步骤二得到的纯化后mRNA反转录为cDNA。
四、实时荧光定量PCR
将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因3′端非编码区的特异引物对对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对步骤一中各种处理的应答情况，以Actin做内参。Q-RT-PCR在7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT=（CT.GmNF-YB6－CT.Actin）Timex－（CT.GmNF-YB6－CT.Actin）Time 0
Time x表示任意时间点，Time 0表示经Actin校正后1倍量的目标基因（GmNF-YB6）表达所对应的时间点。
结果见图1。
实施例3、GmNF-YB6的激活特性
YEP-GAP载体：中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供；参考文献Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Twotranscription factors,DREB 1and DREB2,with an EREBP/AP2DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression,respectively，in Arabidopsis,Plant Cell 1998Aug;10(8):1391-1406。
YPD液体培养基：细菌培养用酵母抽提物（Bacto-Yeast Extract）10g/L，细菌培养用胰化蛋白胨（Bacto-Peptone）20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。
SD/His-/Ura-/Trp-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源（Yeast nitrogen base）6.7g/L，营养缺陷型混合物（drop-out media without His/Ura/Trp）100ml，琼脂粉（Bacteriological agar）20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。
营养缺陷型混合物（drop-out mix）：（10×）：L-Isoleucine（异亮氨酸）300mg/L，L-Valine（缬氨酸）1500mg/L，L-Adenine（腺嘌呤）200mg/L，L-Arginine（精氨酸）200mg/L，L-Leucine（亮氨酸）1000mg/L，L-Lysine HCl（赖氨酸）300mg/L，L-Methionine（甲硫氨酸）200mg/L，L-Phenylalanine（苯丙氨酸）500mg/L，L-Threonine（苏氨酸）2000mg/L，L-Tyrosine（酪氨酸）300mg/L。
1×PEG/LiAc：50％（w/v）PEG33508ml，10×TE buffer 1ml，10×LiAc 1ml。
10×TE Buffer：100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH=7.5，121℃高压灭菌，室温保存。
1×TE/LiAc：10×TE buffer 1ml，10×LiAc 1ml，ddH2O 8ml。
Z溶液：Na2HPO4·7H2O 16.1g/L，NaH2PO4·H2O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O0.246g/L，调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。
X-gal储存液（X-gal Stock Solution）：用N,N-dimethyl-formamide（DMF）溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。
含有X-gal的Z缓冲液100ml（Z buffer with X-gal），现用现配：Z溶液98ml，β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）0.27ml，X-gal储存液（X-gal stock solution）1.67ml。
10×LiAc：100Mm Tris-HCl，100mM EDTA，pH=7.5。121℃高压灭菌、室温保存。
用酵母单杂交***证明转录因子的激活特性的主要原理：将CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin（minimal promoter）上游，Pmin启动子下游连接报道基因（His3、LacZ和URA3）。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP（不含激活功能）分别转化到连有CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。
以下将详述检测GmNF-YB6蛋白是否具有激活特性。具体操作如下：
一、重组表达载体YEP-GAP-GmNF-YB6的构建
1、GmNF-YB6基因的获得
根据GmNF-YB6基因的序列设计引物GmNF-YB6和GmNF-YB6-XI，引物末端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，以大豆品种铁丰8号（中国农业科学院作物科学研究所）的cDNA为模板，PCR扩增获得GmNF-YB6基因。
GmNF-YB6：5'-TTTGGATCCATGGATAACGTTGGAG-3'（下划线部分的序列为BamH I酶切位点的识别序列，其后的序列对应序列2的第1-16位）；
GmNF-YB6-XI：5'-GGTCTCGAGTTATCCTCTTTTGGGGGGG-3'（下划线部分的序列为Xho I酶切位点的识别序列，其后的序列对应序列2的后19位的反向互补序列）。
PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（TaKaRa公司,Code No.:DV807A）回收纯化387bp左右的PCR产物。
2、重组表达载体YEP-GAP-GmNF-YB6的构建
①用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
②用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切表达载体YEP-GAP，回收载体骨架；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株（Clontech公司），37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到的阳性重组质粒在YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间***了序列表的序列2所示的DNA片段，将该重组质粒命名为YEP-GAP-GmNF-YB6。重组表达载体YEP-GAP-GmNF-YB6中启动GmNF-YB6基因转录的启动子为Pmin启动子。
二、GmNF-YB6的体内结合特异性和激活特性的验证
1、酵母报道子的构建
（1）正常双重酵母报道子的构建
DNA片段A（含4个CCAAT元件；TTTAACCAATCAGAAA）：
5’-GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3'（CCAAT的核心序列：CCAAT）。DNA片段A的核苷酸序列见序列表的序列3。
以上述DNA片段A为模板，以A1和A1-XI组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物用限制性内切酶Xho Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切，与经同样双酶切的pHis-1载体（MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司）大片段相连，将得到的重组质粒测序，将测序表明含有序列表中序列3所示的DNA序列的重组载体命名为pHis-1-CCAAT。在重组载体pHis-1-CCAAT中，所述DNA片段A位于Pmin启动子上游。用Xho Ⅰ和Nco Ⅰ内切酶将重组载体pHis-1-CCAAT切成线状。
A 1：5'-CCGCTCGAGGA ATTCTTTA ACCA ATCAGA-3'（下划线处为XhoⅠ的识别位点，其后的序列为序列3的前20位）；
A1-XI：5'-CATGCCATGGGTCGACTTTCTGATTGGTT-3'（下划线处为Nco Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列3的后19位的反向互补序列）
先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞（YM4271株系，MATCHMAKEROne-Hybrid System,Clontech公司）内，获得能在SD/His-培养基上正常生长的酵母转化子（Yeast transformant）。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含线状pLacZi-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His-/Ura-培养基上，选择获得含有pHis-1-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报道子。
（2）突变体双重酵母报道子的构建
DNA片段B（含4个mCCAAT元件）：
5’-GAATTC-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-GTCGAC-3'（MDRE：将4个CCAAT元件的核心序列CCAAT突变成TTTTA）。DNA片段B的核苷酸序列见序列表的序列4
用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤（1），得到突变体双重酵母报道子。
2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析
（1）接种酵母菌YM4271株系到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600=1.7-1.8（约4×107个/mL）。
（2）取30ml步骤（1）过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时（至OD600=0.5±0.1），室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心。
（3）吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用。
（4）取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μg步骤一制备的YEP-GAP-GmNF-YB6、0.1mg ssDNA（鲑鱼精DNA，SiTaa）、0.6ml PEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟。
（5）加入70μl DMSO，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min。
（6）吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞。
（7）用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-选择性培养基上画线培养。
（8）平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。
（9）颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。
（10）结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。
3、半乳糖苷酶活性检测
（1）从0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s。
（2）弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50μl Z/X-gal溶液（Z buffer with X-gal），30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。这说明转录因子GmNF-YB6能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了GmNF-YB6的体内结合特异性和激活功能。
实施例4、GmNF-YB6提高植物的抗旱性与抗冻性的检测
一、重组表达载体pBI121-GmNF-YB6的构建
1、GmNF-YB6基因的克隆
根据GmNF-YB6基因的序列设计引物对（GmNF-YB6-121F和GmNF-YB6-121R），引物末端分别引入Sma Ⅰ和Sac I酶切识别位点，以大豆属大豆（Glycine max L.）品种铁丰8号的cDNA为模板PCR扩增GmNF-YB6基因。
GmNF-YB6-121F：5'-TCCCCCGGGATGGATAACGTTGGAG-3″（划线部分为SmaⅠ的识别位点序列，其后的序列为序列2的前16位）；
GmNF-YB6-121R：5'-CGAGCTCTTATCCTCTTTTGGGGGGG-3'（划线部分为SacI的识别位点序列，其后的序列为序列2的后19位的反向互补序列）。
PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司,Code No.:DV807A)回收纯化385bp左右的条带。
2、重组表达载体pBI121-GmNF-YB6的构建
①用限制性内切酶Sma Ⅰ和Sac I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
②用限制性内切酶Sma Ⅰ和Sac I酶切pBI121（Clontech公司），回收载体骨架；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株（购自北京天根公司），37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到的阳性重组质粒在pBI121的Sma Ⅰ和SacI酶切位点之间***了序列表的序列2所示的DNA片段。将该重组质粒命名为pBI121-GmNF-YB6（质粒图谱如图2所示）。重组表达载体pBI121-GmNF-YB6中启动GmNF-YB6基因转录的启动子为CaMV 35S启动子。
二、转GmNF-YB6基因植物的获得
1、用步骤一构建的重组表达载体pBI121-GmNF-YB6转化农杆菌C58C1（北京拜尔迪生物技术公司），得到重组农杆菌。具体操作如下：
取20μl农杆菌C58C1的感受态细胞，加入1μl步骤一构建的重组表达载体pBI121-GmNF-YB6混匀，电击转化，加入1ml YEB液体培养基28℃/180rpm恢复培养3h，取200μl涂YEB抗性平板（Kan 50mg/L，Rif50mg/L，Gen 50mg/L）28℃培养2～3d。之后以GmNF-YB6-121F和GmNF-YB6-121R所组成的引物对，进行菌液PCR鉴定。将经菌液PCR鉴定表明含有GmNF-YB6基因（大小约为385bp的目的条带）的农杆菌阳性克隆进行测序分析。将经测序表明转入pBI121-GmNF-YB6的农杆菌命名为pBI121-GmNF-YB6/C58C1。同时设置转入pBI121空载体的农杆菌，将其命名为pBI121/C58C1。
2、将步骤1得到的两种重组农杆菌接种于LB（含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素）液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时。
3、将步骤2的菌液转移至LB（含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素）中，28℃、300rpm培养约14小时（菌液OD600达到1.5-3.0）。
4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用含10%蔗糖MS液体培养基（含0.02%（v/v）的silwet77）稀释至OD600约为0.8-1.0。
5、将拟南芥（哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司）整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T1代种子，卡那霉素筛选（浓度为50μg/L卡那霉素）阳性植株。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T3代植株进行DNA和cDNA水平鉴定（DNA水平和cDNA水平鉴定的引物对均如下F和R，预期条带为369bp），cDNA水平鉴定部分样本的结果见图3。将经鉴定表明含有GmNF-YB6基因的阳性植株（DNA和cDNA水平检测均为阳性的植株）命名为pBI121-GmNF-YB6/Col-0。
F:5'-ATGGATAACGTTGGAG-3'（序列2的前16位）；
R:5'-TTATCCTCTTTTGGGGGGG-3'（序列2的后19位的反向互补序列）；
三、转空载体对照植物的获得
用重组农杆菌pBI121/C58C1转化拟南芥Col-0，得到转入pBI121空载体的对照植株，命名为pBI121/Col-0。具体转化方法同步骤二。
四、转GmNF-YB6基因植物的耐旱性鉴定、抗冻性和耐高温性鉴定
1.转GmNF-YB6基因植物的耐旱性鉴定
分别将经步骤二鉴定为阳性（DNA水平和cDNA水平鉴定均为阳性）的T3代转基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0（TL）、T3代转空载体对照植株pBI121/Col-0（CK）和拟南芥Col-0（WT）（各60株）进行耐旱性检测。设置三次重复实验，结果取平均值。
将正常生长的萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株Col-0枯萎（2周左右），然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率。
结果如图4和表1所示，转GmNF-YB6基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0有90.6%存活且能正常生长；而野生型拟南芥Col-0的存活率仅为23.2%，且生长状态欠佳，转空载体对照植株pBI121/Col-0的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。
表1T3代转基因拟南芥植株耐旱性鉴定的存活率统计结果
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| TL | 91.6% | 89.5% | 90.7% | 90.6% |
| CK | 22.3% | 21.5% | 23.4% | 22.4% |
| WT | 23.1% | 22.3% | 24.2% | 23.2% |
2.抗冻性鉴定
分别将T3代转基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0（TL）、T3代转空载体对照植株pBI121/Col-0（CK）和拟南芥Col-0（WT）（各60株）进行抗冻性检测。设置三次重复实验，结果取平均值。
将正常生长的萌发15天的幼苗，置于-4℃处理2小时直至野生型植株Col-0叶片出现受冻表型，然后置于正常培养条件下继续培养，观察表型、拍照并统计存活率。
结果如图5和表2所示，转GmNF-YB6基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0有88.4%存活且能正常生长；而野生型拟南芥Col-0的存活率仅为22.2%，且生长状态欠佳，转空载体对照植株pBI121/Col-0的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。
表2T3代转基因拟南芥植株抗冻性鉴定的存活率统计结果
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| TL | 89.4% | 87.2% | 88.6% | 88.4% |
| CK | 22.8% | 21.4% | 23.6% | 22.6% |
| WT | 23.3% | 21.1% | 22.2% | 22.2% |
3.耐高温鉴定
分别将T3代转基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0（TL）、T3代转空载体对照植株pBI121/Col-0（CK）和拟南芥Col-0（WT）（各60株）进行耐高温检测。设置三次重复实验，结果取平均值。
将正常生长的萌发15天的幼苗，置于42℃处理6小时，直至野生型植株Col-0萎蔫（2周左右），然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率。
结果如图6和表3所示，转GmNF-YB6基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0有70.2%存活且能正常生长；而野生型拟南芥Col-0的存活率仅为46.47%，且生长状态欠佳，转空载体对照植株pBI121/Col-0的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。
表3T3代转基因拟南芥植株耐高温鉴定的存活率统计结果
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| TL | 69.4% | 70.0% | 71.2% | 70.2% |
| CK | 45.4% | 47.2% | 46.6% | 46.4% |
| WT | 47.7% | 46.8% | 44.9% | 46.47% |
Claims (10)
1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。
7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为如下a1)或a2)：
a1)35S启动子；
a2)Pmin启动子。
8.权利要求1所述蛋白质，或权利要求2或3所述核酸分子在调控拟南芥耐逆性中的应用；
所述耐逆性为耐旱性，和/或抗冻性，和/或耐高温。
9.培育耐逆性转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的拟南芥中，得到与所述目的拟南芥相比耐逆性更高的转基因拟南芥；
所述耐逆性为耐旱性，和/或抗冻性，和/或耐高温。
10.权利要求1所述的蛋白质在作为转录因子中的应用。
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