CN102692469A - 液相色谱－串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种液相色谱-串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)对待测人参样品进行预处理；(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的人参样品中一种或多种真菌毒素的含量。该测定方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于人参或类似药材中真菌毒素的多成分残留测定。

Description

液相色谱-串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法

技术领域

本发明涉及人参中真菌毒素含量的测定方法，具体涉及采用液相色谱-串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxin)，也称霉菌毒素，是真菌产生的次级代谢产物，一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。由于真菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经济损失。人或动物摄入被真菌毒素污染的农、畜产品，或通过吸入及皮肤接触真菌毒素可引发多种中毒症状。如致幻，催吐，出血症，皮炎，中枢神经受损，甚至死亡。动物试验和流行病学的调查结果还证实，许多真菌毒素还可在体内积累后产生致癌、致畸、致突变、类激素中毒，白细胞缺乏症等，对机体造成永久性损害(参见张艺兵等，农产品中真菌毒素的检测分析[M]北京：化学工业出版社，2006)。

目前研究关注的真菌毒素主要集中在黄曲霉毒素(aflatoxin)，赭曲霉毒素(OA)，呕吐毒素(DON)，伏马毒素(FUM)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，T-2毒素及展青霉素(PAT)等。随着对真菌毒素危害的深入研究，公众逐渐认识到其对社会经济和人类健康造成的严重威胁，各国政府对药品食品中真菌毒素的分布及检测也都予以了极大的关注，特别是欧盟及美国等发达国家更是对此设定了严格的限量规定。食品方面，我国已相继出台了很多有关真菌毒素的法定标准(参见GB2715-2005食品中真菌毒素限量[S]和GB2761-2005食品中真菌毒素限量[S])，但在药品领域，除中国药典收载了黄曲霉毒素的检测方法(参见中国人民共和国药典2010年版[S])外，尚无其他标准出台。而已有的食品标准均为针对单一的真菌毒素进行检测，尚无同时检测多成分残留的标准出台。

因此，急需开发药品特别是人参中真菌毒素多成分残留的高效测定方法。

发明内容

鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种采用液相色谱-串联质谱测定人参中真菌毒素含量的方法。该方法可用于人参中真菌毒素残留的筛查，为拟定药品中真菌毒素的标准提供技术服务。

本发明通过如下技术方案实现：

提供一种用于测定人参中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)用HLB柱对待测人参样品进行预处理；

(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的人参样品中一种或多种真菌毒素的含量。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素B₁、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或赭曲霉毒素A；其中所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁或黄曲霉毒素G₂。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述HLB柱在预处理人参样品前先用甲醇洗脱，再用水洗脱。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述人参样品的预处理包括用甲醇提取待测人参样品，上HLB柱并收集流出HLB柱的溶液的步骤；或包括用甲醇提取待测人参样品，上HLB柱并用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液的步骤。

根据本发明的一个特别优选的实施方式，人参样品的预处理包括：精密称取人参样品粉末，精密加入甲醇溶液，超声处理，离心，滤过，精密吸取上清液，用水稀释，摇匀，取稀释后的溶液通过已经处理好的HLB柱，直至有适量空气通过，收集流出HLB柱的溶液，用氮气缓慢吹干，精密加入甲醇溶液使溶解，即得；或在样品上HLB柱后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，氮气缓慢吹干后，精密加入甲醇溶液使溶解，离心，取上清液，即得。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的色谱条件为：采用C18柱，流动相由A相和B相组成，A相为甲醇，B相为甲酸，采用梯度洗脱。

优选地，所述C18柱的粒径为1.7～5μm，柱内径2.1～4.6mm，柱长为5～10cm，更优选为ACQUITY UPLC BEH C18柱；B相的浓度为0.01～0.05％，优选0.01％(体积)；A∶B体积比为5～95％∶95～5％，优选流速为0.2～0.4ml/min，优选0.3ml/min。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的质谱条件为：采用电喷雾离子源，采用正负离子模式进行数据采集，去簇电压为-100～120伏、碰撞池能量为-48～53伏。

本发明方法还包括用各种真菌霉素的标准品绘制标准曲线，并由此计算人参样品中各种真菌霉素的含量。

本发明方法为首次应用于人参中真菌毒素多成分残留的检测与分析。本发明方法在药品真菌毒素的多成分残留的检测中，可以有效排除干扰、保证待测物的稳定。该测定分析方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于人参或类似药材中真菌毒素的多成分残留测定。

本发明方法通过液相色谱-串连质谱对人参样品进行进样分析，检测人参中多种真菌毒素的残留量，分析成本低、同时又减少了假阳性，提高了测定的准确性，有较强的实用性。该方法对人参中真菌毒素多成分残留的检测具有重要指导意义，对新药等关键技术有良好的指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面。该方法可有效应用于国家标准的制订、企业新药的研发、企业现有产品质控方法的提升。

附图说明

图1为负离子模式的混合标准品溶液(1)的总离子流图；

图2为负离子模式的混合标准品溶液(2)的总离子流图；

图3为正离子模式的混合标准品溶液(2)的总离子流图；

图4为负离子模式的供试品溶液(1)的总离子流图；

图5为负离子模式的供试品溶液(2)的总离子流图；

图6为正离子模式的供试品溶液(2)的总离子流图；

图7为负离子模式的加样回收供试品溶液(1)的总离子流图；

图8为负离子模式的加样回收供试品溶液(2)的总离子流图；

图9为正离子模式的加样回收供试品溶液(2)的总离子流图。

具体实施方式

实施例1

1、材料与方法

1.1主要仪器与试剂

API 4000串联四极杆质谱仪(美国应用生物***公司)，ACQUITYUltra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，MIKRO 200R离心机(德国Hettich公司)，超纯水机(美国Millipore公司)。

黄曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素B₁、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或赭曲霉毒素A标准品(美国SUPELCO公司)；乙腈、甲酸、甲酸铵均为色谱纯。HLB净化柱(Waters公司)。

1.2实验方法

1.2.1色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；以100％甲醇为流动相A相，以0.01％甲酸为流动相B相，流速0.3ml/min；按下表进行梯度洗脱：

表1、流动相梯度

1.2.2质谱条件

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管去簇电压、碰撞池能量等质谱参数见表2。

表2、质谱参数表

1.2.3标准溶液的制备

对照储备溶液的制备精密称取黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、T-2毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮呕及吐毒素标标准品适量，加乙腈配制成5mg/L的溶液，作为混合对照储备液。

标准曲线溶液的制备分别精密吸取上述混合对照储备液适量，用50％甲醇稀释成下表所述浓度的系列混合对照溶液。

表3、系列标准溶液浓度表

另取人参样品粉末(华宇药材有限公司提供；已经分别按照《中国药典》2010年版附录、GB/T5009.118-2008、GB/T23502-2009、SN/T1572-2005、GB/T23504-2009、GB/T23503-2009描述的方法检验，未检出黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、T-2毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素B 1、玉米赤霉烯酮及呕吐毒素)(过二号筛)5g，精密称定，按照下述“供试品溶液的制备”项下方法制备操作至“收集流出HLB柱的溶液，用氮气缓慢吹干”，分别加入上述系列标准溶液1ml，作为系列标准曲线溶液(1)。随后用5ml甲醇洗脱HLB柱，收集甲醇洗脱液，用氮气缓慢吹干，精密加入上述系列标准溶液1ml，作为系列标准曲线溶液(2)。

1.2.4供试品溶液的制备

精密称取人参样品粉末(华宇药材有限公司提供)(过二号筛)5g，精密加入70％甲醇溶液50ml，超声处理30分钟，离心，滤过，精密吸取上清液10ml，用水稀释至20ml，摇匀，精密吸取稀释后的溶液5ml，缓慢通过已经处理好的HLB(先用甲醇2ml洗脱，再用水2ml洗脱)柱，直至有适量空气通过，收集流出HLB柱的溶液，用氮气缓慢吹干，精密加入50％甲醇1ml溶液使溶解，作为供试品溶液(1)；随后用5ml甲醇洗脱HLB柱，收集甲醇洗脱液，用氮气缓慢吹干，精密加入50％甲醇1ml溶液使溶解，作为供试品溶液(2)。

2、结果

2.1测定

分别精密吸取上述系列标准曲线溶液(1)及供试品溶液(1)各1μl，注入液相色谱-质谱联用仪，测定，按标准曲线法测定计算呕吐毒素的含量，再精密吸取系列标准曲线溶液(2)和供试品溶液(2)各1μl，注入液相色谱-质谱联用仪，测定，按标准曲线法测定计算黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、T-2毒素、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的含量，即得。

2.2计算

$\mathrm{\ω}=\frac{\mathrm{\ρ}\×20}{m}$

式中：

ω——样品中每种毒素的浓度，μg/kg；

ρ——从标准曲线中得出的测试溶液中每种毒素的浓度，ng/ml；

m——样品取样量，g。

上述人参样品中没有检出呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、T-2毒素、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A或玉米赤霉烯酮。

2.3线性关系

精密吸取上述系列标准溶液各1μl，进样分析，记录各待测组分色谱峰面积，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归分析，结果(见表4)表明，各成分线性关系良好。

表4、回归方程和相关系数

2.4检测限

测定低浓度加样回收率溶液的信噪比，以信噪比为3∶1计算方法检测限(见表5)，结果表明，本方法检测限远低于目前食品行业的限量标准。

表5、检测限

2.5精密度试验

取基质标准溶液3，连续进样6次，记录峰面积，结果表明，上述七种成分6次进样峰面积的RSD值在1.3％-3.1％范围内，精密度良好。

2.6稳定性试验

取回收率试验项下的中间浓度的样品溶液，每隔6小时进样分析，记录峰面积，结果表明，在0-12小时之内，样品溶液基本稳定。

2.7加样回收率试验

取人参样品粉末5g，分别加入不同浓度水平的标准品适量，照样品处理项下方法依法操作，计算回收率及相应RSD值。结果(见表6)表明，本方法回收率试验结果良好。

表6、回收率试验(n＝9)

Claims (14)

1.用于测定人参中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)用HLB柱对待测人参样品进行预处理；

(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的人参样品中一种或多种真菌毒素的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素B₁、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或赭曲霉毒素A。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素选自黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁或黄曲霉毒素G₂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HLB柱在预处理人参样品前先用甲醇洗脱，再用水洗脱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测人参样品的预处理包括用甲醇提取待测人参样品，上HLB柱并收集流出HLB柱的溶液的步骤；或包括用甲醇提取待测人参样品，上HLB柱并用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液的步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测人参样品的预处理包括：精密称取人参样品粉末，精密加入甲醇溶液，超声处理，离心，滤过，精密吸取上清液，用水稀释，摇匀，取稀释后的溶液通过已经处理好的HLB柱，直至有适量空气通过，收集流出HLB柱的溶液，用氮气吹干，精密加入甲醇溶液使溶解；或在样品上HLB柱后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，氮气吹干后，精密加入甲醇溶液使溶解，离心，取上清液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的色谱条件为：采用C18柱，流动相由A相和B相组成，A相为甲醇，B相为甲酸，采用梯度洗脱。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的质谱条件为：采用电喷雾离子源，采用正负离子模式进行数据采集，去簇电压为-100～120伏、碰撞池能量为-48～53伏。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述C18柱的粒径为1.7～5μm，柱内径2.1～4.6mm，柱长为5～10cm。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述C18柱为ACQUITYUPLC BEH C18柱。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中B相的浓度为0.01～0.05％。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中B相的浓度为0.01％。

13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中A∶B体积比为5～95％∶95～5％。

14.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中流动相的流速为0.2～0.4ml/min。

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