CN103525780B - 水稻钙依赖性蛋白激酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻钙依赖性蛋白激酶基因及其应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。本发明对于将水稻中响应病原菌的CDPK应用于增强植物抗病能力的分子育种具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及水稻钙依赖性蛋白激酶基因及其应用。
背景技术
水稻是世界上重要的粮食作物，水稻病害的发生严重影响了水稻的品质，降低了水稻的产量。通过提高植物自身的抗病性来防止水稻病害是最经济、持久、环保的方法。提高水稻抗病性的有效途径是利用基因工程的方法改善植物抗病防卫反应过程中关键基因的表达。
钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase,CDPK）是一种结合了蛋白激酶结构和类钙调素结构的新型钙离子感受器（1）。CDPK是植物特有的（在纤毛虫和柔嫩艾美耳球虫这两种原生动物中也存在）一种丝氨酸/苏氨酸激酶，动物中不存在CDPK。CDPK在植物中以大的基因家族的形式存在：拟南芥中有34种CDPK，水稻中有29种CDPK（2）。外界刺激会引发植物细胞质内钙离子浓度有规律的瞬时上升，这种钙离子浓度的变化会激活CDPK，使其表现出丝氨酸/苏氨酸激酶活性（3）。植物病原体的侵染也会引发植物细胞质内钙离子浓度的上升，因此也会激活CDPK（4）。
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发明内容
本发明的目的是提供水稻钙依赖性蛋白激酶基因OsCPK10和OsCPK20及其应用。
本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白；
（2）将SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQ ID No.1中自5’末端起第1位至第1170位核苷酸所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
本发明提供的另一种蛋白也属于本发明的保护范围，该蛋白为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白；
（2）将SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQ ID No.3中自5’末端起第1位至第996位核苷酸所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且上述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
一种制备水稻稻瘟病的抗病性增强的转基因水稻的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白的编码基因或SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白的编码基因导入出发水稻中，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻的水稻稻瘟病的抗病性增强。
上述方法中，所述编码基因是通过表达盒导入所述出发水稻中的；
所述表达盒是通过重组表达载体导入所述出发水稻中的，所述重组表达载体是将所述编码基因的表达盒***载体pCAMBIA1381Xa的HindIII酶切位点间得到的；
所述表达盒按照如下方法制备：将SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白的编码基因***出发载体pRTL-HA的KpnI和BamHI位点间，得到中间载体；HindIII酶切中间载体，回收2365bp的片段，得到表达盒；
所述表达盒由35S启动子、HA标签、SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白的编码基因和终止子组成；
或，
所述表达盒按照如下方法制备：将SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白的编码基因***出发载体pRTL-HA的KpnI和BamHI位点间，得到中间载体；HindIII酶切中间载体，回收2191bp的片段，得到表达盒；
所述表达盒由35S启动子、HA标签、SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白的编码基因和终止子组成；
所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的。
或，上述任一所述的蛋白或编码基因在提高水稻抗水稻稻瘟病能力中的应用也属于本发明的保护范围；
所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的。
OsCPK10和OsCPK20是首次从水稻29个CDPK中筛选得到的两个正调控水稻抗病防卫反应的CDPK基因。研究结果表明，OsCPK10和OsCPK20的表达水平受到了稻瘟菌激发子的显著诱导。进一步将具有组成性活性的OsCPK10和OsCPK20（分别为OsCPK10VK和OsCPK20VK）转入水稻中，并进行抗病表型分析，结果表明，两种转基因水稻的CDPK基因可以提高水稻抵御稻瘟菌侵染的能力。本发明对于将水稻中响应病原菌的CDPK基因应用于增强植物抗病能力的分子育种具有重要的意义。
附图说明
图1为响应病原菌信号的水稻CDPK的筛选。
图2为OsCPK10和OsCPK20的克隆。
图3为过表达载体的构建过程。
图4为转基因水稻的鉴定。
图5为转基因水稻的抗病表型分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
番茄-燕麦液体培养基按照如下方法制备：取30g燕麦片，加800mL水，在沸水中煮30min，以两层纱布过滤除去残渣。称500g番茄，榨成200mL番茄汁，加入到上述燕麦汁中。加水补足至1L，调节培养基的pH为7.0，灭菌后备用。
番茄-燕麦固体培养基按照如下方法制备：取30g燕麦片，加800mL水，在沸水中煮30min，以两层纱布过滤除去残渣。称500g番茄，榨成200mL番茄汁，加入到上述燕麦汁中。加水补足至1L，调节培养基的pH为7.0，然后加入20g琼脂。灭菌后备用。
野生型水稻为日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare），该水稻在文献“Li,T.Li,W.-D.Kim,M.Kitaoka,S.Yoshida,M.Nakajima,H.Kobayashi.Characterization of raffinose synthase from rice(Oryza sativa L.var.Nipponbare),Biotechnol Lett,29(2007)635-640.”中公开过，公众可从北京大学生命科学学院蛋白质与植物基因研究国家重点实验室获得。
稻瘟病菌菌种M.oryzae strain Kyu77-07A(race102.0)在文献“K.Kishimoto,Y.Kouzai,H.Kaku,N.Shibuya,E.Minami,Y.Nishizawa,Perception of thechitin oligosaccharides contributes to disease resistance to blast fungusMagnaporthe oryzae in rice,The Plant journal:for cell and molecular biology,64(2010)343-354.”中公开过，公众可从北京大学生命科学学院蛋白质与植物基因研究国家重点实验室获得。
pRTL-HA载体在文献“Shanping He,Guihong Tan,Qian Liu,Kuowei Huang,JiaoRen,Xu Zhang,Xiangchun Yu,Ping Huang,Chengcai An,The LSD1-interactingprotein GILP is a LITAF domain protein that negatively regulates hypersensitivecell death in Arabidopsis,PLoS ONE,2011,Vol.6(4):e18750”中公开过，公众可从北京大学生命科学学院蛋白质与植物基因研究国家重点实验室获得。
pCAMBIA1381Xa购自CAMBIA。
实施例1、与抗病防卫反应有关的水稻CDPK基因的筛选及克隆
一、稻瘟菌诱导物的制备
稻瘟病菌诱导粗提物的制备方法如下：
（一）稻瘟病菌的菌种是以布满真菌菌丝的滤纸片的形式保存的，接种时将滤纸片放置于番茄-燕麦固体培养基上，每个平板放置3-4个滤纸片。
（二）将平板置于30℃培养箱中培养4-5天，此时以纸片为中心会长出大量菌丝。
（三）在每个平板上加入4-5mL的无菌水，用涂棒在平板上来回涂布以刮取菌丝。
（四）用无菌水洗下菌丝，加入番茄-燕麦液体培养基中，28℃，200rpm，黑暗条件下振荡培养4-5天。
（五）收取培养物，10000rpm离心5min，弃掉上清，收集沉淀（即菌丝）。
（六）以等体积蒸馏水重悬菌丝，10000rpm离心5min洗涤菌丝。
（七）重复步骤（六）两次，共洗涤菌丝3次，以200mL蒸馏水重悬菌丝。
（八）将获得的菌丝置于匀浆器中充分匀浆，将匀浆后的产物在10000rpm的条件下离心。
（九）收集上清，将上清121℃条件下灭菌20min，即得到稻瘟菌诱导物，将其保存于-80℃备用。
二、水稻愈伤组织的制备和处理
（一）首先将日本晴水稻种子剥去种皮，以20%的次氯酸钠溶液振荡处理70min，之后用无菌水清洗8-10次，待次氯酸钠被完全洗净后，将种子放置于无菌滤纸上充分晾干。
（二）将种子的胚向上***含有2.5mg/L2,4-D的NB固体培养基上，28℃条件下黑暗培养10-14天。
（三）在成熟胚盾片处可长出愈伤组织，用镊子剥取愈伤组织，置于含有2mg/L2,4-D的NB固体培养基上，28℃条件下继代培养10-14天。
（四）选取色泽明亮，直径在1-2cm的愈伤组织用于下一步的实验。
（五）将水稻的一组愈伤组织置于含有步骤一得到的稻瘟菌诱导物的三角瓶中作为实验组，同时将另一组愈伤组织置于含有无菌水的三角瓶中作为负对照。黑暗条件下，在摇床上缓慢振荡三角瓶以使稻瘟菌诱导物或者无菌水充分接触水稻愈伤组织。
（六）在诱导的0h对愈伤组织进行取样，然后分别于1h、3h、6h和12h对两组样品进行取样。将各样品置于液氮中速冻后，然后于-80℃冰箱中冻存备用。
三、水稻中29种CDPK基因的表达模式的分析
利用半定量RT-PCR的方法检测各组各时间点的样品的CDPK基因的表达情况，同时以OsPAL1基因作为标记基因，检测其表达水平的变化以确保实验体系无误，并以OsACTIN1作为内参基因。
CDPK基因OsCPK20的半定量RT-PCR引物如下：
OsCPK20-sense pair:5’-GGAAGAAACAGCAGCAGGAG-3’
OsCPK20-antisense pair:5’-GCATTGTCGTCCTCGTAGGT-3’
CDPK基因OsCPK10的半定量RT-PCR引物如下：
OsCPK10-sense pair:5’-CCTGCAAGTCCATCCTGAAG-3’
OsCPK10-antisense pair:5’-AGAGGAAGTTCTCGGGCTTG-3’
OsPAL1基因的半定量RT-PCR引物如下：
OsPAL1-sense pair:5’-AGGCAAGCACATCGACCCGTT-3’
OsPAL1-antisense pair:5’-AACACCGCACGCCTCCACACT-3’
OsACTIN1基因的半定量RT-PCR引物如下：
OsACTIN1-sense pair:5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’
OsACTIN1-antisense pair:5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’
半定量RT-PCR的反应程序如下：
95℃5min
以下三步：25个循环→30个循环→35个循环
25个循环→30个循环→35个循环是指在以上半定量RT-PCR实验中，首先设置25个循环检测能否扩增出亮度比较好的条带，如果不能，则将循环数提高到30个循环，如果还不能，则将循环数提高到35个循环。
各基因的半定量RT-PCR结果如图1所示。
图1中，OsCPK20-30代表以30个循环鉴定OsCPK20基因；
OsCPK10-30代表以30个循环鉴定OsCPK10基因；
OsPAL1-25代表以25个循环鉴定OsPAL1基因；
OsACTIN1-25代表以25个循环鉴定OsACTIN1基因。
图1表明，与诱导前和负对照组相比，实验组（即稻瘟菌诱导物处理组）OsCPK10和OsCPK20两种CDPK基因的表达量有了显著的提升，并且两种基因的表达量的峰值出现在稻瘟菌诱导物处理后1h。通过检测OsPAL1的表达水平证明了实验体系无误，同时OsPAL1的表达也受到稻瘟菌诱导物的显著影响，其表达量的峰值出现在稻瘟菌诱导物处理后3h。通过比较，两个CDPK基因的表达水平的峰值要明显早于OsPAL1基因表达水平的峰值，这证明两个CDPK基因是响应稻瘟菌侵染的早期应答基因（OsPAL1基因是水稻中的苯丙氨酸解氨酶基因，该基因在水稻抗病防卫反应的信号转导途径中位于非常下游的位置）。
实施例2、转基因水稻的制备及表型分析
一、OsCPK10和OsCPK20基因的克隆
（一）设计OsCPK10基因的引物如下：
OsCPK10-sense pair:5'-ATGGGGAACACGTGCGTC-3'
OsCPK10-antisense pair:5'-TCAAGACATCCTCAAGGCCTC-3'
设计OsCPK20基因的引物如下：
OsCPK20-sense pair:5'-ATGGGCAACTGCTGCGTGAC-3'
OsCPK20-antisense pair:5'-CTATTGGGTAGTTGTTAACTGCAATG-3'
（二）提取实施例1中稻瘟菌诱导物处理1h的日本晴水稻的愈伤组织的RNA，反转录后得到cDNA，以cDNA为模板，分别以OsCPK10和OsCPK20基因的引物对进行PCR扩增，得到OsCPK10和OsCPK20基因。
PCR反应体系如下：
（三）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增片段的大小，结果如图2所示。
图2表明，OsCPK10和OsCPK20基因扩增片段大小与预计的一致。
将PCR产物进行测序，测得OsCPK10的序列如SEQ ID No.1所示，OsCPK10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
OsCPK20的序列如SEQ ID No.3所示，OsCPK20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
二、过表达载体的构建
（一）针对OsCPK10和OsCPK20基因的组成性活性区域设计引物，并附加合适的保护性碱基和酶切位点（下划线所示序列为酶切位点）。
OsCPK10基因的组成性活性区域引物序列如下：
OsCPK10VK-1-KpnI:5’-CGGGGTACCATGGGGAACACGTGCGTC-3’；
OsCPK10VK-2-BamHI:5’-CGCGGATCCCTACCATGGATGCCTTAAAACTTC-3’。
OsCPK20基因的组成性活性区域引物序列如下：
OsCPK20VK-1-KpnI:5’-CGGGGTACCATGGGCAACTGCTGCGTGAC-3’；
OsCPK20VK-2-BamHI:5’-CGCGGATCCCTACCAAGGATGATCAAGCACTTG-3’。
（二）将步骤一PCR扩增得到的OsCPK10和OsCPK20基因片段回收，得到纯化的基因片段。
（三）以OsCPK10基因片段为模板，利用OsCPK10VK-1-KpnI和OsCPK10VK-2-BamHI扩增出OsCPK10的组成性活性区，将其命名为OsCPK10VK。该片段的序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第1位至第1170位核苷酸所示，其编码的蛋白序列为SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示。
以OsCPK20基因片段为模板，利用OsCPK20VK-1-KpnI和OsCPK20VK-2-BamHI扩增出OsCPK20的组成性活性区，将其命名为OsCPK20VK。该片段的序列如SEQ ID No.3中自5’末端起第1位至第996位核苷酸所示，其编码的蛋白序列为SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示。
（四）利用KpnI和BamHI对OsCPK10VK进行双酶切，得到基因片段；KpnI和BamHI双酶切质粒载体pRTL-HA，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到pRTL-HA-OsCPK10VK，测序验证正确。
利用KpnI和BamHI对OsCPK20VK进行双酶切，得到基因片段；KpnI和BamHI双酶切质粒载体pRTL-HA，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到pRTL-HA-OsCPK20VK，测序验证正确。
（五）以HindIII分别酶切pRTL-HA-OsCPK10VK和pRTL-HA-OsCPK20VK，分别回收2365 bp和2191 bp的片段，得到包含35S启动子、HA标签、OsCPK10VK和终止子的表达盒1，或包含35S启动子、HA标签、OsCPK20VK和终止子的表达盒2。
（六）以HindIII酶切pCAMBIA1381Xa，回收载体大片段。将表达盒1与载体大片段连接，构建稳定表达载体，将其命名为p1381-HA-OsCPK10VK，将质粒转化DH5α，提质粒、酶切和测序正确。
以HindIII酶切pCAMBIA1381Xa，回收载体大片段。将表达盒2与载体大片段连接，构建稳定表达载体，将其命名为p1381-HA-OsCPK20VK，将质粒转化DH5α，提质粒、酶切和测序正确。
质粒构建过程如图3所示。
图3中最后一行为p1381-HA-OsCPK20VK或p1381-HA-OsCPK10VK的T-DNA片段，以T-Border (left)和T-Border （right）标记片段的两个边缘。
三、转基因水稻的制备
将p1381-HA-OsCPK10VK和p1381-HA-OsCPK20VK分别转入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌p1381-HA-OsCPK10VK/GV3101和p1381-HA-OsCPK20VK/GV3101，再用重组农杆菌p1381-HA-OsCPK10VK/GV3101和p1381-HA-OsCPK20VK/GV3101转化日本晴水稻，得到35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻以及35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻。以OsACTIN1为内参基因，采用RT-PCR的方法对转基因苗进行鉴定，结果如图4所示。
鉴定所用引物如下：
OsACTIN1基因的鉴定引物：
OsACTIN1-1：5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’；
OsACTIN2-2：5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。
35S:HA-OsCPK10VK的鉴定引物：
OsCPK10-1：5’-CCTGCAAGTCCATCCTGAAG-3’；
OsCPK10-2：5’-AGAGGAAGTTCTCGGGCTTG-3’。
35S:HA-OsCPK20VK的鉴定引物：
OsCPK20-1：5’-GGAAGAAACAGCAGCAGGAG-3’；
OsCPK20-2：5’-GCATTGTCGTCCTCGTAGGT-3’。
图4中，WT:野生型日本晴水稻；
OsCPK10-25代表以25个循环鉴定OsCPK10VK基因；
OsCPK20-25代表以25个循环鉴定OsCPK20VK基因；
OsACTIN1-25代表以25个循环鉴定OsACTIN1基因。
图4A为35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻的RT-PCR鉴定。
图4A表明，编号为1、2、15、17、19、21、24和26的35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻为阳性苗。
图4B为35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻的RT-PCR鉴定。
图4B表明，编号为19、21、22、23、25、26、28、32和36的35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻为阳性苗。
四、转基因水稻的抗病表型分析
（一）将稻瘟菌接种在番茄-燕麦固体培养基上，于25-27℃条件下培养5-7天。
（二）用无菌水轻轻洗下菌丝（菌丝团要小）和分生孢子，制成悬浮液，将其悬浮液均匀涂于另一新的番茄-燕麦固体培养基上（培养基要适当硬一些），每皿约加悬浮液400μL，超净工作台上吹干涂布悬液的平板。
（三）将平板置于25℃培养箱中培养约35-40h至培养基表面长出一层稀疏的气生菌丝体。
（四）向平板的菌落上加少量水，用棉签轻轻擦去表面的气生菌丝，并用水将培养基表面的菌丝和分生孢子清洗干净，将培养基表面晾干。
(五)待培养基表面晾干后罩上2层纱布，用皮筋绑好，于25℃光照条件下培养约24h，至有大量分生孢子产生。
（六）从培养基上洗下分生孢子，擦镜纸过滤后镜检，用0.2%明胶水溶液调整孢子悬浮液浓度至每毫升悬液含2×105个孢子。
（七）将几层吸水纸剪成培养皿底合适大小的圆片，平铺于空培养皿内，加水浸湿。
（八）取35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻和35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻的T0代水稻以及野生型日本晴水稻的叶片中部5cm左右的叶段（每种至少3-5个叶段）。在预备要接种的地方用接种环划伤水稻叶片，将水稻叶片置于步骤（七）制备的保湿的培养皿内，每皿放4-5个叶段，用0.2%明胶水溶液均匀喷雾（雾滴要细，培养皿盖同时喷雾以便于保湿）。
（九）用微量移液器取稻瘟病菌孢子悬浮液滴于划伤过的水稻叶片上，每个叶段接种4-5滴孢子悬液，每滴约3-5μL，盖上培养皿盖。
（十）将接种叶段的培养皿在28℃完全黑暗、100%相对湿度条件下保湿30h左右。然后在28℃全光照条件下培养，观察病斑的状态。
（十一）接种七天后，以尺子测量病斑大小，并拍照。
结果如图5所示。
图5A为步骤三制备的编号17和21的35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻和野生型日本晴水稻中OsCPK10VK的表达情况。
图5B为接种稻瘟菌七天后，步骤三制备的编号17和21的35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻和野生型日本晴水稻的发病情况。
图5C为步骤三制备的编号17和21的35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻和野生型日本晴水稻的病斑大小。
图5D为步骤三制备的编号28和36的35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻和野生型日本晴水稻中OsCPK20VK的表达情况。
图5E为接种稻瘟菌七天后，步骤三制备的编号28和36的35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻和野生型日本晴水稻的发病情况。
图5F为步骤三制备的编号28和36的35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻和野生型日本晴水稻的病斑大小。（Student’s t test;**P＜0.01）。
图5A表明，与野生型日本晴水稻相比，编号为17和21的两株35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻中OsCPK10VK的表达上升。图5B和5C表明，这两株转基因水稻比野生型日本晴水稻的发病程度低，病斑显著小于野生型日本晴水稻的病斑。
图5D表明，与野生型日本晴水稻相比，编号为28和36的两株35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻中OsCPK20VK的表达上升。图5E和5F表明，这两株转基因水稻比野生型日本晴水稻的发病程度低，病斑显著小于野生型日本晴水稻的病斑。
抗病表型分析表明，与野生型日本晴水稻相比，分别转入OsCPK10和OsCPK20组成性活性区域的35S:HA-OsCPK10VK转基因水稻和35S:HA-OsCPK20VK转基因水稻的抗稻瘟病能力明显增强。
Claims (10)
1.一种蛋白，为SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为SEQ ID No.1中自5’末端起第1位至第1170位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种蛋白，为SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白。
6.权利要求5所述蛋白的编码基因。
7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为SEQ ID No.3中自5’末端起第1位至第996位核苷酸所示的DNA分子。
8.含有权利要求6或7所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
9.一种制备水稻稻瘟病的抗病性增强的转基因水稻的方法，包括如下步骤：将SEQ ID No.2中自N端起第1位至第390位氨基酸所示的蛋白的编码基因或SEQ ID No.4中自N端起第1位至第332位氨基酸所示的蛋白的编码基因导入出发水稻中，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻的水稻稻瘟病的抗病性增强。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过表达盒导入所述出发水稻中的；
所述表达盒是通过重组表达载体导入所述出发水稻中的，所述重组表达载体是将所述编码基因的表达盒***载体pCAMBIA1381Xa的HindIII酶切位点间得到的；
所述表达盒按照如下方法制备：将权利要求1所述蛋白的编码基因***出发载体pRTL-HA的KpnI和BamHI位点间，得到中间载体；HindIII酶切中间载体，回收2365 bp的片段，得到表达盒；
所述表达盒由35S启动子、HA标签、权利要求1所述蛋白的编码基因和终止子组成；
或，
所述表达盒按照如下方法制备：将权利要求5所述蛋白的编码基因***出发载体pRTL-HA的KpnI和BamHI位点间，得到中间载体；HindIII酶切中间载体，回收2191bp的片段，得到表达盒；
所述表达盒由35S启动子、HA标签、权利要求5所述蛋白的编码基因和终止子组成；
所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的；
或，权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在提高水稻抗水稻稻瘟病能力中的应用：
或，权利要求5所述的蛋白、权利要求6或7所述的编码基因在提高水稻抗水稻稻瘟病能力中的应用：
所述水稻稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的。
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| CN103525780A (zh) | 2014-01-22 |
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