CN116063434B - OsLTPL23蛋白及其编码基因调控水稻抗病性的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsLTPL23蛋白及其编码基因调控水稻抗病性的应用。本发明提供了OsLTPL23蛋白，为SEQ ID NO：1所示蛋白质。编码OsLTPL23蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子在调控植物对白叶枯病的抗病性中的应用。OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子丰度增加，植物对白叶枯病的抗病性增强。OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子丰度降低，植物对白叶枯病的抗病性减弱。本发明可用于水稻种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白叶枯病水稻品种，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体属于植物基因工程领域，涉及OsLTPL23蛋白及其编码基因调控水稻抗病性的应用。
背景技术
水稻(Oryzae sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一，其产量稳定的维持是保障粮食安全和促进经济发展的重大战略需求。白叶枯病是水稻生产中最严重的细菌性病害之一，其由黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)经伤口或水孔入侵水稻叶片引起，可致水稻减产20-30％，严重时可达50％甚至绝收，并会降低稻米品质，对粮食安全构成重大威胁，制约着水稻生产的经济效益。
抗性基因介导的抗病育种被认为是当前农业生产上防控水稻白叶枯病害的最有效措施，而构建生态环境友好型病害防控措施的关键有赖于抗性基因的挖掘，因此，鉴定新的水稻白叶枯病抗性基因，对水稻抗病育种具有重要应用价值，并且有利于我国粮食安全的保障。
发明内容
本发明的目的是提供OsLTPL23蛋白及其编码基因调控水稻抗病性的应用。
本发明提供了一种蛋白质，来源于水稻(Oryzae sativa L.)，命名为OsLTPL23蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)SEQ ID NO：1所示的蛋白质；
(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)来源于水稻且与(a1)具有98％以上同一性且具有调控植物白叶枯病抗病性功能的蛋白质；
(a4)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物白叶枯病抗病性功能的蛋白质。
标签具体如表1所示。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
| HA | 9 | YPYDVPDYA |
蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码OsLTPL23蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
具体的，所述核酸分子为DNA分子。
具体的，编码OsLTPL23蛋白的核酸分子为OsLTPL23基因。
所述OsLTPL23基因具体为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(b2)SEQ ID NO：3所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)杂交且编码OsLTPL23蛋白的DNA分子；
(b4)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有90％以上的同一性且编码OsLTPL23蛋白的DNA分子。
含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述核酸分子的重组载体。使用所述核酸分子构建重组载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。
本发明还保护OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子在调控植物对白叶枯病的抗病性中的应用。所述调控为正调控。OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子丰度增加，植物对白叶枯病的抗病性增强。OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子丰度降低，植物对白叶枯病的抗病性减弱。
本发明还保护OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子作为正调控靶标在培育白叶枯病抗病性提高的植物中的应用。作为正调控靶标的含义为，通过促使OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子丰度增加，使植物对白叶枯病的抗病性增强。
本发明还保护OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子作为负调控靶标在培育白叶枯病感病性提高的植物中的应用。作为负调控靶标的含义为，通过促使OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子丰度增降低，使植物对白叶枯病的感病性增强。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码OsLTPL23蛋白的核酸分子导入目的植物中，得到白叶枯病抗病性高于目的植物的转基因植物。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中编码OsLTPL23蛋白的核酸分子的表达，得到白叶枯病感病性高于目的植物的转基因植物。
本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。
所述植物育种的目标为获得白叶枯病抗病性增强的植物。
所述植物育种的目标为获得白叶枯病感病性增强的植物。
以上任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。
以上任一所述植物可为禾本科植物。
以上任一所述植物可为水稻属植物。
以上任一所述植物可为粳稻亚种的植物。
以上任一所述植物可为水稻。
示例性的，所述植物可为水稻日本晴。
所述白叶枯病是由白叶枯病菌引起的。
所述白叶枯病是由黄单胞菌水稻致病变种引起的。
示例性的，所述白叶枯病菌为白叶枯病菌生理小种PXO61。
本发明发现：过表达OsLTPL23基因能够明显增强水稻对白叶枯病菌的抗病性，抑制OsLTPL23基因表达能够明显增强水稻对白叶枯病菌的易感性。本发明可用于水稻种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白叶枯病的水稻品种，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1的结果图。
图2为实施例2中2种纯合基因编辑植株的测序结果。
图3为实施例2中纯合基因编辑植株中形成的两种突变蛋白。
图4为实施例2中白叶枯病抗性鉴定的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。农杆菌EHA105和农杆菌EHA105/pSoup均为北京博迈德基因技术有限公司产品，产品目录号分别为BC307-01、BC313-01。水稻日本晴(Oryza sativaL.spp.japonica)，属于粳稻，用NIP表示。实施例中所用的水稻白叶枯病菌为菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO61。
载体PMDC43(vector pMDC43)记载于如下文献：Mark Curtis and UeliGrossniklaus.A Gateway TM cloning vector set for high-throughput functionalanalysis of genes in plants.Plant Physiology,2003,133,462-469。载体PMDC43中具有潮霉素B抗性基因。
来源于水稻的OsLTPL23蛋白如SEQ ID NO：1所示。水稻cDNA中，编码OsLTPL23蛋白的开放阅读框如SEQ ID NO：2所示。水稻基因组DNA中，OsLTPL23基因如SEQ ID NO：3所示(该基因包括2个外显子，分别位于第85-434位和第568-577位)。
实施例1、OsLTL23基因过表达植株的制备和鉴定
一、过表达载体的构建
1、提取水稻日本晴叶片的总RNA，反转录得到cDNA。
2、以步骤1获得的cDNA为模板，采用OsLTPL23-cloning-F和OsLTPL23-cloning-R组成的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。
OsLTPL23-cloning-F：5'-ATGGCTCGCGCGGCGAATAA-3'；
OsLTPL23-cloning-R：5'-TCAGTGCACCCTGGAGCAGTCGG-3'。
3、以步骤2获得的扩增产物为模板，采用OsLTPL23-OE-F和OsLTPL23-OE-R组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
OsLTPL23-OE-F：5'-TGAACTATACAAAGGCGCGCCAATGGCTCGCGCGGCGAATAA-3'；
OsLTPL23-OE-R：5'-CTCTAGAACTAGTTAATTAATCAGTGCACCCTGGAGCAGTCGG-3'。
OsLTPL23-OE-F和OsLTPL23-OE-R中，下划线部分为用于后续无缝克隆步骤的同源碱基。
4、用限制性内切酶Pac I和Asc I双酶切载体pMDC43，回收约10730bp的载体骨架。
5、步骤3回收的扩增产物和步骤4回收的载体骨架通过无缝克隆连接，获得重组质粒pMDC43-OsLTPL23。测序验证结果显示，与载体pMDC43相比，重组质粒pMDC43-OsLTPL23的差异仅在于：用SEQ ID NO：2所示双链DNA分子取代了载体pMDC43中Pac I和Asc I酶切位点之间的小片段。
二、重组农杆菌的获得
将重组质粒pMDC43-OsLTPL23导入农杆菌EHA105，获得含有重组质粒pMDC43-OsLTPL23的重组农杆菌，命名为农杆菌EHA105-pMDC43-OsLTPL23。
将载体pMDC43导入农杆菌EHA105，获得含有载体pMDC43的重组农杆菌，命名为农杆菌EHA105-pMDC43。
三、OsLTL23基因过表达植株的制备
1、将农杆菌EHA105-pMDC43-OsLTPL23浸泡侵染水稻日本晴的胚性愈伤组织，然后依次进行共培养、筛选培养(筛选条件：50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄青霉素)、分化培养和生根培养，获得28株T0代再生植株。
2、将T0代再生植株作为供试植株，通过PCR鉴定筛选转基因植株。
PCR鉴定的方法：取供试植株的叶片，提取基因组DNA，采用hpt-F和hpt-R组成的引物对进行PCR鉴定，如果显示480bp的扩增产物，供试植株为转基因植株。
hpt-F：5'-AGCGAGAGCCTGACCTATTG-3'；
hpt-R：5'-CTCCATACAAGCCAACCACG-3'。
3、将T0代转基因植株自交，收获种子并培育为植株，即为T1代植株。将T1代植株进行PCR鉴定，方法同步骤2。对于某一T0代转基因植株，如果其自交得到的T1代植株均为转基因植株，那么该T0代植株为一个纯合的转基因株系。
得到包括OELTPL23-1株系和OELTPL23-6株系在内的多个纯合的转基因株系。
四、空载对照植株的制备
用农杆菌EHA105-pMDC43代替农杆菌EHA105-pMDC43-OsLTPL23，其他同步骤三。
得到纯合的转空载体株系(用EMPTY表示)。
五、检测OsLTPL23基因的相对表达水平
供试植株：水稻日本晴植株、OELTPL23-1株系的T1代植株、OELTPL23-6株系的T1代植株、转空载体纯合株系的T1代植株。每个株系3-5株。
提取供试植株的总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以水稻Actin基因作为内参基因，通过荧光定量PCR检测OsLTPL23基因的相对表达水平。
用于鉴定Actin基因的引物如下：
Actin-qRT-F：5'-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3'；
Actin-qRT-R：5'-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3'。
用于鉴定OsLTPL23基因的引物如下：
OsLTPL23-qRT-F：5'-CGAGCGCGGTGACATGC-3'；
OsLTPL23-qRT-R：5'-TGGTCTGCTGCTTGAGGC-3'。
供试植株中OsLTPL23基因的转录表达水平结果见图1的A。与水稻日本晴植株相比，转基因过表达植株中OsLTPL23基因的转录表达水平显著升高。与水稻日本晴植株相比，转空载体植株中OsLTPL23基因的转录表达水平无显著差异。
六、白叶枯病抗性鉴定
供试植株：水稻日本晴植株、OELTPL23-1株系的T1代植株、OELTPL23-6株系的T1代植株、纯合转空载体株系的T1代植株。每个株系20株。
将供试植株种植于北京市昌平区平西府农场试验基地，单株种植，正常栽培管理。在水稻分蘖盛期采用人工剪叶法接种水稻白叶枯病菌，每株植株接种3-5个叶片(菌液浓度为1×109cfu/mL)。接种水稻白叶枯病菌21天后，观察植株叶片的病斑损伤表型，并进行病斑长度统计。
植株叶片表型照片见图1的B(比例尺，2cm)。病斑长度统计结果见图1的C。与水稻日本晴植株相比，OsLTPL23基因过表达植株均表现出白叶枯病斑变短的表型，病斑长度分别减少33.01％和29.45％。与水稻日本晴植株相比，转空载体植株的表型和病斑长度均无显著差异。
实施例2、OsLTPL23基因编辑植株的制备和鉴定
一、基因编辑载体的构建
通过预实验筛选靶序列。靶序列：TAAGTATGTGGCGGCGGTGATGG。靶序列中，下划线部分为PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列。
制备重组质粒OsLTPL23-Cas9。重组质粒OsLTPL23-Cas9为环形双链DNA分子，其全序列如SEQ ID NO：4所示。重组质粒OsLTPL23-Cas9中，第488至507位编码sgRNA，第2692至6822位编码Cas9蛋白。
二、重组根癌农杆菌的获得
将重组质粒OsLTPL23-Cas9导入农杆菌EHA105/pSoup，获得含有重组质粒OsLTPL23-Cas9的重组农杆菌，命名为农杆菌EHA105-OsLTPL23-Cas9。
三、OsLTPL23基因编辑植株的制备
1、将农杆菌EHA105-OsLTPL23-Cas9浸泡侵染水稻日本晴的胚性愈伤组织，然后依次进行共培养、筛选培养(筛选条件：50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄青霉素)、分化培养和生根培养，获得30株T0代再生植株。
2、将T0代再生植株作为供试植株，筛选基因编辑植株。
筛选方法：取供试植株的叶片，提取基因组DNA，采用OsLTPL23-Dection-F和OsLTPL23-Dection-R组成的引物对进行PCR扩增，然后回收扩增产物并测序；将水稻日本晴作为供试植株的野生型对照；如果供试植株的PCR扩增产物的测序结果与野生型对照的PCR扩增产物的测序结果不同，该供试植株为基因编辑植株。
OsLTPL23-Dection-F：CACCCACACCACACTCCACT；
OsLTPL23-Dection-R：TAGCGTAGGGGATGTTGACG。
30株再生植株中，7株为基因编辑植株。
3、正常培养步骤2获得的基因编辑植株，分别自交并收获种子，将种子培育为植株，即为T1代植株。
4、将T1代植株作为供试植株，筛选纯合基因编辑植株。
筛选方法：取供试植株的叶片，提取基因组DNA，采用OsLTPL23-Dection-F和OsLTPL23-Dection-R组成的引物对进行PCR扩增，然后回收扩增产物并测序；将水稻日本晴作为供试植株的野生型对照；如果供试植株的PCR扩增产物的测序结果为纯合型且与野生型对照的PCR扩增产物的测序结果不同，该供试植株为纯合基因编辑植株。
获得2种纯合基因编辑类型植株，分别命名为osltpl23-1植株和osltpl23-2植株。
2种纯合基因编辑类型植株的测序结果见图2。由于基因编辑，不能形成SEQ IDNO：1所示的OsLTPL23蛋白，而是形成两种突变蛋白，见图3。
5、正常培养步骤4获得的osltpl23-1植株，自交并收获种子，将种子培育为植株，即为osltpl23-1株系的T2代植株。
6、正常培养步骤4获得的osltpl23-2植株，自交并收获种子，将种子培育为植株，即为osltpl23-2株系的T2代植株。
四、白叶枯病抗性鉴定
供试植株：水稻日本晴植株、osltpl23-1株系的T2代植株、osltpl23-2株系的T2代植株。每个株系20株。
方法同实施例2的步骤六。
照片见图4的A(比例尺，2cm)。病斑长度统计结果见图4的B。与水稻日本晴植株相比，基因编辑植株均表现出白叶枯病斑变长的表型，病斑长度分别增加20.59％和31.56％。
实施例1和实施例2的结果表明，OsLTPL23蛋白正调控水稻对水稻白叶枯病菌的抗病性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (11)
1.OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子在调控植物对白叶枯病的抗病性中的应用；所述OsLTPL23蛋白如SEQ ID NO：1所示；所述植物为水稻。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述编码OsLTPL23蛋白的核酸分子为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(b2)SEQ ID NO：3所示的DNA分子。
3.OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子作为正调控靶标在培育白叶枯病抗病性提高的植物中的应用；所述OsLTPL23蛋白如SEQ ID NO：1所示；所述植物为水稻。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述编码OsLTPL23蛋白的核酸分子为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(b2)SEQ ID NO：3所示的DNA分子。
5.OsLTPL23蛋白或编码OsLTPL23蛋白的核酸分子作为负调控靶标在培育白叶枯病感病性提高的植物中的应用；所述OsLTPL23蛋白如SEQ ID NO：1所示；所述植物为水稻。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述编码OsLTPL23蛋白的核酸分子为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(b2)SEQ ID NO：3所示的DNA分子。
7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码OsLTPL23蛋白的核酸分子导入目的植物中，得到白叶枯病抗病性高于目的植物的转基因植物；所述OsLTPL23蛋白如SEQID NO：1所示；所述植物为水稻。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述编码OsLTPL23蛋白的核酸分子为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(b2)SEQ ID NO：3所示的DNA分子。
9.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中编码OsLTPL23蛋白的核酸分子的表达，得到白叶枯病感病性高于目的植物的转基因植物；所述OsLTPL23蛋白如SEQ ID NO：1所示；所述植物为水稻。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述编码OsLTPL23蛋白的核酸分子为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(b2)SEQ ID NO：3所示的DNA分子。
11.权利要求7或8所述方法在水稻白叶枯病抗病性育种中的应用。
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