CN104628835B - 一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用 - Google Patents

一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104628835B
CN104628835B CN201510046065.4A CN201510046065A CN104628835B CN 104628835 B CN104628835 B CN 104628835B CN 201510046065 A CN201510046065 A CN 201510046065A CN 104628835 B CN104628835 B CN 104628835B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
plant
protein
gmsqm
contain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510046065.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104628835A (zh
Inventor
王笑
王笑一
陈海峰
张婵娟
单志慧
陈李淼
陈水莲
张晓娟
周新安
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Original Assignee
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences filed Critical Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority to CN201510046065.4A priority Critical patent/CN104628835B/zh
Publication of CN104628835A publication Critical patent/CN104628835A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104628835B publication Critical patent/CN104628835B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用。本发明的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐虫性相关的蛋白质。通过实验证明：和野生型拟南芥植株和转空载的拟南芥植株相比，转GmSqm拟南芥植株喂养初孵棉铃虫幼虫后，棉铃虫幼虫的虫重明显减低，体长明显减短。本发明的蛋白GmSqm在培育耐虫的植物方面具有重要意义。

Description

一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用。
背景技术
在未来的40年内，世界人口数量将达到100亿。在此情形下，农业的首要任务是在环境可持续发展和节约成本的前提下，实现食品和其它产品的最大化生产，而限制食品生产的一个主要因素是由于昆虫的侵害，估计其会造成10-20％农作物损失。大豆是世界上主要的油料作物，其是植物脂肪和蛋白的主要来源。在大豆生产中，大豆的产量和品质经常会受到植食性昆虫的危害。但是大豆的产量常常会由于植食性昆虫对大豆叶片的取食而造成严重的损失。棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)属于鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性昆虫，常常对许多重要的经济作物(例如大豆)造成严重的危害。在过去很长一段时间里，对农业害虫的防治主要依赖化学杀虫剂，但大量使用杀虫剂会对环境造成严重污染，而且害虫会对农药产生耐药性。
在上世纪90年代中期，随着转基因玉米、马铃薯和棉花(转基因植物表达来自苏云金芽孢杆菌中编码杀虫内毒素的基因)的商业化，基因改造后的作物对害虫具有内源性抗性，这是转基因技术的成功。目前，全世界有超过十亿亩地种植Bt转基因作物，虽然Bt转基因作物对双翅目(如蝇和蚊子)、鞘翅类(如甲虫和象鼻虫)和膜翅目(如黄蜂)有抗性的毒素已经发现，但已经种植的这些转基因作物表达的毒素主要是对鳞翅类害虫有抗性(如蝴蝶和蛾类)。目前虽然表达Bt毒素的转基因作物能有效的抵抗害虫，但仍需要进一步研究开发更多的抗虫基因，研究并克隆抗虫相关基因，对培育抗虫大豆新品种具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；
b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐虫性相关的蛋白质。
为了使上述a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagⅡ 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子的为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述严格条件可为如下：在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为在65℃，6×SSC，0.5％SDS的溶液中中杂交，在2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述生物材料中，B6)所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。
上述生物材料中，所述重组载体可用现有的植物表达载体构建；所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
本发明的重组载体具体为在载体pCXDG的两个Xcm Ⅰ位点间***如序列表中序列表2所示的GmSqm得到的重组载体。
上述蛋白质或上述相关生物材料在提高植物耐虫性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述虫为棉铃虫。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
本发明最后一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的培育转基因植物的方法包括如下步骤：向出发植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物耐虫性高于所述出发植物。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因序列如序列表中序列2所示。
上述方法中，所述转基因植物耐虫性高于所述出发植物体现在降低棉铃虫虫重和/或降低虫长。
上述方法中，所述虫为棉铃虫。
上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
本发明的实验证明，本发明发现了新蛋白GmSqm，将其编码基因导入拟南芥中得到的转GmSqm拟南芥，其和野生型拟南芥植株与转空载的拟南芥植株相比，转GmSqm拟南芥植株喂养初孵棉铃虫幼虫后，棉铃虫幼虫的虫重明显减低，体长明显减短，表明蛋白GmSqm具有抗棉铃虫的特性。本发明的蛋白GmSqm在培育耐虫的植物方面具有重要意义。
附图说明
图1为T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系(TL)的PCR检测结果。其中，M为分子量标准，从上至下的条带大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；泳道1、泳道2、泳道3和泳道4分别为TL1、TL2、TL3和TL4株系，为不同的T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系；泳道5为重组载体pCXDG-GmSqm阳性对照；泳道6和泳道7为野生型拟南芥和转pCXDG空载的拟南芥植株阴性对照。
图2为T3代纯合转pCXDG空载体的拟南芥株系(CK)的PCR检测结果。其中，M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；泳道1和泳道2分别为CK1和CK2，为不同的T3代纯合转pCXDG空载体的拟南芥株系；泳道3为载体pCXDG阳性对照；泳道4为野生型拟南芥阴性对照。
图3为T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系(TL)中目的基因GmSqm的相对表达量测定结果。其中，WT为野生型拟南芥阴性对照，TL1、TL2、TL3和TL4为T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系。
图4为将T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系(TL)、野生型拟南芥(WT)和T3代纯合转pCXDG空载体的拟南芥株系(CK)的莲座叶喂养棉铃虫6天后的棉铃虫表型。其中，TL1、TL2和TL3为T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系。
图5为将T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系(TL)、野生型拟南芥(WT)和T3代纯合转空载体pCXDG的拟南芥株系(CK)的莲座叶喂养棉铃虫2、4、6天后的棉铃虫的虫重增长情况。其中，TL1、TL2和TL3为不同的T3代纯合转GmSqm基因的拟南芥株系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
野生大豆ED059(Glycine soja Sieb.et Zucc.)在文献“Xiaoyi Wang,HaifengChen,Aihua Sha,Rong Zhou,Zhihui Shang,Xiaojuan Zhang,Chanjuan Zhang,LimiaoChen,Qingnan Hao,Zhonglu Yang,Dezhen Qiu,Shuilian Chen,Xinan Zhou.Laboratorytesting and molecular analysis of the resistance of wild and cultivatedsoybeans to cotton bollworm,Helicoverpa armigera(Hübner).The cropjournal.2015；3(1):19-28”中公开过，公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得。
根癌农杆菌GV3101在文献“Amanda M Davis,Anthony Hall,Andrew J Millar,Chiarina Darrah and Seth J Davis,Protocol:Streamlined sub-protocols forfloral-dip transformation and selection of transformants in Arabidopsisthaliana,2009,5:310.1186/1746-4811-5-3”中公开过，公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得。
哥伦比亚生态型拟南芥Columbia-0(以下简称为野生型拟南芥)在文献“Xia T,Xiao D,Liu D,Chai W,Gong Q,Wang NN.Heterologous expression of ATG8c fromsoybean confers tolerance to nitrogen deficiency and increases yield inArabidopsis.PLoS One.2012；7(5):e37217”中公开过，公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得。
载体pCXDG的T-DNA片段上含有致死基因ccdB，其两侧含Xcm Ⅰ酶切识别序列。该载体为拟南芥生物资源中心(The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC；网址：http://abrc.osu.edu/)的产品，产品目录编号为Vector:5019471959。
实施例1、GmSqm蛋白及其编码基因的获得
1、将野生大豆ED059(Glycine soja Sieb.et Zucc.)在正常条件下培养至第三片三初复叶时，用三龄的棉铃虫幼虫在第二片完全展开复叶上进行处理。
2、棉铃虫处理24h后，采下处理叶片，提取总RNA，并反转录获得cDNA；以所述cDNA为模板，采用引物PF和引物PR进行PCR扩增，得到1590bp的PCR扩增产物。上述引物的序列如下：
引物PF：5’-ATGATGGGTTATGAGTATATTTTGG-3；
引物PR：5’-TTAATCTTCCAAATTGGTAGGGGGT-3。
3、回收PCR扩增产物、克隆至pGEM-T载体，得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌DH5α后送交测序。
经测序，该PCR扩增产物具有序列表中序列2所示的核苷酸，将该序列所示的基因命名为GmSqm，其开发阅读框如序列表中序列2所示，该基因编码的蛋白命名为GmSqm，其氨基酸序列为序列表中序列1。
实施例2、转GmSqm拟南芥的获得及其表型鉴定
一、植物表达载体的构建
1、将野生大豆ED059(Glycine soja Sieb.et Zucc.)在正常条件下培养至第三片三初复叶时，用三龄的棉铃虫幼虫在第二片完全展开复叶上进行处理。
2、棉铃虫处理24h后，采下处理叶片，提取总RNA，并反转录获得cDNA；以所述cDNA为模板，采用引物PF和引物PR进行PCR扩增，得到大小为1590bp的PCR扩增产物。上述引物的序列如下：引物PF：5’-ATGATGGGTTATGAGTATATTTTGG-3；引物PR：5’-TTAATCTTCCAAATTGGTAGGGGGT-3。
对得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化大小为1590bp的PCR扩增产物(即为GmSqm)；用Xcm Ⅰ酶酶切载体pCXDG，回收10587bp骨架载体片段；用T4连接酶将上述骨架载体片段与上述大小为1590bp的GmSqm连接，得到重组载体pCXDG-GmSqm。
对重组载体pCXDG-GmSqm进行测序验证，重组载体pCXDG-GmSqm为将载体pCXDG的两个Xcm Ⅰ位点间的DNA替换为序列表中序列2所示的GmSqm，保持载体pCXDG的其他序列不变得到的重组载体，表达蛋白GmSqm。
二、重组根癌农杆菌的获得
将步骤一中获得的重组载体pCXDG-GmSqm采用冻融法转化根癌农杆菌GV3101，得到含有重组载体pCXDG-GmSqm的根癌农杆菌GV3101，经菌落PCR验证后(引物为PF和PR)，将含有大小为1590bp的DNA片段的重组农杆菌命名为GV3101/pCXDG-GmSqm。
同时将空载体pCXDG采用冻融法转化根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，将不含有大小为1590bp的DNA片段的重组农杆菌命名为GV3101/pCXDG。
三、转GmSqm拟南芥的获得
将步骤二中获得的GV3101/pCXDG-GmSqm和GV3101/pCXDG，采用花芽浸泡法分别转化哥伦比亚生态型拟南芥Columbia-0(以下简称为野生型拟南芥WT)，得到T3代纯合转GmSqm的拟南芥株系4个和T3代纯合转空载体的拟南芥株系(CK)2个，具体方法如下：
1、分别取重组农杆菌GV3101/pCXDG-GmSqm和GV3101/pCXDG，用含利福平30μg/ml、庆大霉素4030μg/ml和卡那霉素100μg/ml的YEP培养液培养至OD600为0.8；室温离心后将菌体沉淀重悬于100ml infiltration medium溶液(配方：MS 4.4g/L、蔗糖50g/L和silwet50ul/L；PH为5.7-5.9)中，获得菌悬液；将野生型拟南芥倒置，使其莲座叶以上的花序分别在不同菌悬液中浸泡30S-1min后，侵染过的植株横着放在黑色的盒子里，上面再盖一黑盒子，22℃环境中放置24小时。24小时后揭掉上面的黑盒子，竖直培养直至收获种子(即T0代种子)，种子经室温干燥后备用。
2、将步骤1中获得的2种T0代种子在4℃条件下处理4-7天，播种于含75mg/L潮霉素的MS培养基中，置于22℃光照培养箱中持续培养，7-10天后挑选可正常生长的潮霉素抗性植株(潮霉素抗性植株表现为植株健壮，根系发达；非潮霉素抗性植株表现为黄化死亡，根系弱小)，移入正常MS培养基中缓苗3-7天，播种于营养土中直至收获T1代种子。按照同样的方法种植筛选出的T1代种子，移栽潮霉素抗性分离比为3:1的T1代株系，并单株收获T1代株系内各单株上所结T2代种子，取T2代株系种子按照同样的方法进行潮霉素抗性筛选，得到T2代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转GmSqm的拟南芥株系4个和T2代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转空载体株系2个；将T2代纯合转GmSqm的拟南芥株系和T2代纯合转空载体的拟南芥株系繁殖，得到T3代纯合转GmSqm的拟南芥株系和T3代纯合转空载体的拟南芥株系。
T0代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
四、转GmSqm拟南芥的分子鉴定
1、PCR鉴定
分别提取步骤三中获得的T3代纯合转GmSqm的拟南芥株系(分别命名为株系TL1、TL2、TL3、TL4)和野生型拟南芥植株(WT)的基因组DNA，采用引物PF和引物PR进行PCR扩增，得到目的基因GmSqm。
将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将获得1590bp条带的植株记为阳性。结果表明(图1)：TL1、TL2、TL3和TL4株系植株全部为阳性，WT植株全部为阴性。
分别提取步骤三中获得的T3代纯合转空载体的拟南芥株系(CK，各株系分别为CK1和CK2)和野生型拟南芥植株(WT)的基因组DNA，采用引物F和引物R进行PCR扩增，得到靶基因ccdB基因。引物序列如下：
F:5’-TTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGAT-3’；
R:5’-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGT-3’。
将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将获得896bp条带的植株记为阳性。结果表明(图2)：T3代纯合转空载体的拟南芥株系CK1和CK2全部为阳性，WT植株全部为阴性。
2、实时荧光定量PCR检测
分别提取实施例1中获得的T3代纯合转GmSqm的拟南芥株系(TL1、TL2、TL3、TL4)和野生型拟南芥植株(WT)的基因组RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，采用特异引物F1和R1进行实时荧光定量PCR扩增。
实时荧光定量PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以拟南芥TUA2为内参，引物为FC和RC，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和技术重复，数据取3次重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT处理-ΔCT对照)＝2-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]。上述引物的序列(5’-3’)如下：
F1：5’-AACCACGGGCACGTTATCTT-3’；
R1：5’-GCCATGTCACCATTGCCAAG-3’；
FC：5’-CGATGAAGCTCAATCCAAACGA-3’；
RC：5’-CAGAGTCGAGCACAATACCG-3’。
结果如图3所示，野生型拟南芥植株中不表达目的基因GmSqm；而转GmSqm的拟南芥株系TL1、TL2、TL3、TL4中目的基因GmSqm的表达量都很高。T3代纯合转空载体的拟南芥株系的结果与野生型拟南芥植株相同。
五、转GmSqm拟南芥的表型鉴定
取步骤三中获得的T3代纯合转GmSqm的拟南芥株系(TL1和TL2)、T3代纯合转空载体的拟南芥株系(CK)和野生型拟南芥(WT)种子，正常种植至莲座期。抗虫实验在27℃，85％湿度和16小时光照的培养箱中进行，取棉铃虫的同一块新鲜虫卵在27℃下孵化。孵化后饥饿处理12h，然后接入培养皿(100×25mm)中。
分别取生长了四周左右的T3代纯合转GmSqm拟南芥株系(TL1、TL2、TL2)、T3代纯合转空载体的拟南芥株系(CK)和野生型拟南芥(WT)的莲座叶对棉铃虫进行饲养，每次取6片叶子，每天换一次叶片，在喂养6天后停止实验。在实验的第2、4、6天分别对棉铃虫幼虫称重。每个株系做10次抗虫鉴定，每个抗虫鉴定中仅用一头棉铃虫。以野生型拟南芥和转空载的拟南芥作为对照。
结果表明如图4和图5所示：棉铃虫幼虫取食转GmSqm拟南芥株系后的幼虫虫重及虫长均明显小于取食转空载载体的拟南芥株系和野生型拟南芥株系的幼虫，棉铃虫取食不同植株后的表型和虫重增长情况。

Claims (7)

1.序列表中序列1所示的蛋白质在提高植物耐虫性中的应用；所述虫为棉铃虫。
2.与序列表中序列1所示的蛋白质相关的生物材料在提高植物耐虫性中的应用；
所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码序列表中序列1所示的蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料；
所述虫为棉铃虫。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为序列表中序列2所示的DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向出发植物中导入序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物耐虫性高于所述出发植物；所述虫为棉铃虫。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因序列如序列表中序列2所示。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。
CN201510046065.4A 2015-01-29 2015-01-29 一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用 Expired - Fee Related CN104628835B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510046065.4A CN104628835B (zh) 2015-01-29 2015-01-29 一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510046065.4A CN104628835B (zh) 2015-01-29 2015-01-29 一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104628835A CN104628835A (zh) 2015-05-20
CN104628835B true CN104628835B (zh) 2017-11-21

Family

ID=53208118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510046065.4A Expired - Fee Related CN104628835B (zh) 2015-01-29 2015-01-29 一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104628835B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795975B (zh) * 2018-07-04 2021-10-22 中国农业科学院油料作物研究所 野生大豆相关蛋白在提高植物抗虫性中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1037913C (zh) * 1995-12-28 1998-04-01 中国农业科学院生物技术研究中心 编码杀虫蛋白质的融合基因和表达载体及其应用
CN1384189A (zh) * 2001-05-09 2002-12-11 深圳万德福基因工程有限公司 棉铃虫增效蛋白基因工程菌株的构建及其增效蛋白的表达
NZ566028A (en) * 2005-08-31 2011-09-30 Monsanto Technology Llc Nucleotide sequences encoding insecticidal proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN104628835A (zh) 2015-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100269227A1 (en) Tissue specific promoters
CN104558130B (zh) 抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的应用
CN105753953B (zh) 小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用
CN109868273A (zh) 用于检测玉米植物dbn9501的核酸序列及其检测方法
CN108368515A (zh) 耐旱玉米
CN102464710A (zh) 棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用
CN115820685B (zh) 一种柑橘CsGSTF1基因及其应用
CN109971880A (zh) 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法
CN106496313B (zh) 抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用
WO2022188288A1 (zh) 与水稻氮吸收与转化相关的蛋白质及其编码基因与应用
CN104711268A (zh) 一种抗虫基因Zm-Cry1A(h)及其相关生物材料与应用
CN102482683A (zh) 能够提供热耐受性的转录调节因子的表达
CN107325161B (zh) 一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用
CN104628835B (zh) 一种与植物耐虫性相关蛋白GmSqm及其编码基因与应用
CN105400814B (zh) 一种培育抗虫转基因玉米的方法
CN103570813B (zh) 与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用
CN105585623A (zh) 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用
CN104628836B (zh) 一种与植物耐虫性相关蛋白GmIFR及其编码基因与应用
CN104140462A (zh) 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用
CN103923922B (zh) 重金属诱导启动子在培育土壤重金属污染预警转基因植物中的应用
CN114276426A (zh) 与水稻产量相关的蛋白质与生物材料及二者在提高水稻产量中的应用
CN108517322B (zh) 一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用
CN105400797B (zh) 一种含有抗虫基因的重组dna片段及其应用
CN105349570B (zh) 一种人工合成的抗虫基因表达载体及其应用
CN105368848B (zh) 一种人工合成的抗虫基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20171121

Termination date: 20220129