CN105063085A - 甘蓝型油菜基因BnMPK3及其抗油菜菌核病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因<i>BnMPK3</i>及应用，属于植物基因工程领域；主要涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因<i>BnMPK3</i>的分离克隆、功能验证和应用，<i>BnMPK3</i>基因具有控制作物菌核病的功能，本发明通过实验验证在菌核病处理甘蓝型油菜时<i>BnMPK3</i>的表达量显著提高，通过基因工程技术提高<i>BnMPK3</i>基因的表达量能够控制作物菌核病，从而提高甘蓝型油菜及其他作物的抗病性和产量。

Description

甘蓝型油菜基因 BnMPK3 及其抗油菜菌核病的应用

技术领域

本发明涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因BnMPK3及其或其功能类似物调控植物抗菌核病在农业生产中的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

油菜作为一种重要的油料作物，在中国的油料生产中占有重要的地位。我国油菜年种植面积700万公顷（1亿亩），占全世界的1/3，居世界首位，其所产菜籽油占我国整个食用植物油供应的40％（沈金雄等，中国油菜生产及遗传改良潜力与油菜生物柴油发展前景[J]，华中农业大学学报，2007年，26卷6期894-899页）。此外，菜籽油也是适宜于生产的生物柴油，油菜已被欧美各国作为解决全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不仅是食用油的主要来源，也是解决全球能源短缺的重要原料作物，具有十分重要的战略地位。

然而，我国的菜籽生产量目前仅能满足国内2/3的消费需求，大量依赖进口。我国2005年进口植物油600多万吨，是世界上最大的油料进口国，随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，按目前的生产规模，缺口将会变得更大（王汉中，中国油料产业发展的现状、问题与对策[J]，中国油料作物学报，2005年, 27卷4期 100-105页）。在当前和今后相当长的时间内，我国都将面临食用油和化石能源短缺的严峻局面。

油菜菌核病（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.）de Bary）是限制我国油菜生产的主要因子之一。在长江中下游及东南沿海油菜主产区，油菜菌核病的发生率很高，产量损失高达50%以上；全国发生面积在7000万亩以上，产量损失高达30%，严重时达到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难以找到有效的抗性材料以及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜籽单位面积产量的重要策略。

基因工程方法是按预先设计好的目标和计划，通过遗传操作，在分子水平上改良品种的技术。中国农业科学院作物科学研究所发现了一个植物抗病基因为基因a或基因b，将基因a或基因b修饰后对植物的抗性有显著提高（申请号：201110048518.9，2011）。而像油菜菌核病这类在寄主植物种内难于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一种解决问题的途径。

促***原活化蛋白激酶（mitogen-activited protein kinases，MAPKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞中对各种生长因子进行应答，迅速在其丝氨酸、苏氨酸残基部位磷酸化而被激活。它广泛存在于各种真核生物中，与一些其他的信号分子组成MAPK级联途径（MAPK cascades），该途径与激素反应、细胞分化和发育过程密切相关。山东农业大学研究发现，棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6可以使棉花叶片面积增大，果荚数和结实率提高，从而提高棉花产量（郭兴启等，2010；申请号：201010590833）。在植物中，MAPK除了与许多生命活动有关外，在应对冷、热、氧化、紫外线、干旱、病原体侵害等多种非生物和生物胁迫方面起着重要作用。有学者发现，水稻的OsMPK4/OsMPK5与水稻抗低温有关（Huang Fu et a1. Expression of Oryza sativa MAP kinase gene is developmentally regulated and stress-responsive[J]．Physiol Plant，2012年，114期，572-580页）。华中农业大学发现，枳促***原活化蛋白激酶基因PtMAPK可以提高转基因烟草植株抗旱能力，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供了新的基因资源（刘继红等，2010；申请号：201010596044）。促***原活化蛋白激酶基因MPK3是MAPK家族的重要一员，Mao等的研究表明，在拟南芥中MPK3能通过激活WRKY33促进植物植保素的合成，从而起到抗拟南芥灰霉病的作用（Mao et a1. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis[J].Plant Cell, 2011年，23期， 1639–1653页)。目前已证明基因BnWRKY33有抗油菜菌核病的作用（Wang Zheng et a1. Overexpression of BnWRKY33 in Oilseed Rape Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Molecular Plant Pathology[J].Molecular Plant Pathology, 2014年）。因此我们推测，BnMPK3基因也具有提高甘蓝型油菜对菌核病抗性的功能，在加拿大油菜中，已有研究者克隆出BnMPK3基因，（Liang et al. Identification and analysis of MKK and MPK gene families in canola (Brassica napusL.) .BMC Genomics，2013年），但目前对于BnMPK3抗菌核病这一方面的研究还未见有文献及专利的报道。研究发现，菌核病对油菜胁迫处理之后，BnMPK3的表达显著提高，进而，甘蓝型油菜BnMPK3转基因过表达植株显著增强菌核病抗性，这一结果在增强油菜菌核病抗性和提高菜籽油产量上具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，根据一种来源于油菜的控制作物菌核病的基因，其命名为BnMPK3，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；BnMPK3基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明提供带有BnMPK3基因的重组载体1300-35S-MPK3-NOS。

所述重组载体1300-35S-MPK3-NOS的具体制备方法为：在载体pCAMBIA1300（购于北京鼎国昌盛生物公司）的上游EcoRI/KpnI酶切位点处加入CaMV 35S强启动子，其下游BamHI/HindIII酶切位点处加上CaMV Nos终止子，将其改造成载体pCAMBIA1300-35S-Nos；而重组载体1300-35S-MPK3-NOS是以

BnMPK3-1-F (5’-GGTACCTCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3’)，

BnMPK3-1-R (5’-GGATCCGGATATTTAGCCATTCATTCG-3’)

为引物从甘蓝型油菜中双9号的cDNA中扩增出目的基因BnMPK3（该对引物是以NCBI上公布的拟南芥AtMPK3（Gene ID: 823706）的编码序列设计的），进而按照gateway试剂盒（Gateway® LR Clonase™II Enzyme Mix ，Invitrogen Corporation）操作，将目的基因克隆到pCAMBIA1300-35S-Nos的酶切位点KpnI/BamHI上，得到1300-35S-MPK3-NOS。

本发明进一步提供所述BnMPK3基因在提高油菜对菌核病的抗性中的应用，本发明通过过量表达该基因来达到提高甘蓝型油菜对死体营养型病菌菌核病的抗性。

实现本发明的技术如下：

创建甘蓝型油菜cDNA文库，以

BnMPK3-1-F(5’-GGTACCTCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3’)，

BnMPK3-1-R(5’-GGATCCGGATATTTAGCCATTCATTCG-3’)为引物，从甘蓝型油菜中双9号的cDNA文库中PCR扩增出甘蓝型油菜BnMPK3的cDNA序列，进行测序，发现这个cDNA序列全长为1299bp，在GenBank数据库对其Blast核苷酸比对，发现这个cDNA序列与拟南芥、烟草等的转录因子MPK3在核苷酸水平上有很高的同源性。

为了探测MPK3对菌核病侵染的反应，用核盘菌（从甘蓝型油菜中双9号品种分离，购于中国农科院植物油料所）接种油菜叶片，分别在接种0、12、24、36、48 h时采样然后提取叶片总RNA，然后使用实时荧光定量PCR检测BnMPK3的表达量；用携带有1300-35S-MPK3-NOS载体的农杆菌GV3101（购于上海迈其生物科技有限公司）以浸花法转化甘蓝型油菜，采用PCR技术鉴定出转基因株系，通过实时荧光定量PCR技术鉴定出BnMPK3表达水平显著高于非转基因株系的过表达转基因株系。菌核病抗病评价实验表明，与非转基因株系相比，BnMPK3过表达转基因株系显著提高菌核病抗性。

这些结果表明BnMPK3基因在增强油菜菌核病抗性上具有重要的应用前景。

本发明的优点：

1.本发明中所采用的从油菜cDNA文库来克隆基因，可靠性高、速度快、效率高。

2. 本发明中所采用的农杆菌介导的体外浸蘸渗透法转化油菜，速度快、成本低、操作简单。

3.本发明中克隆得到的BnMPK3基因，为其它作物抗病育种提供了新的基因源；为研究怎样提高其它作物的菌核病抗性具有指导借鉴作用。

4.本发明构建的1300-35S-MPK3-NOS载体转化油菜后获得的MPK3过量表达株系，从BnMPK3的功能获得方面进行研究，为MPK3的抗病功能研究提供了原材料，具有重要意义。

5.本发明通过对MPK3过量表达株系在抗菌核病方面的一系列研究，充分证明了MPK3基因在植物抗菌核病方面有积极作用，对阐明BnMPK3基因的生物学功能有重要意义。也为MPK3在主要油料作物（油菜）抗菌核病方面的应用提供了理论与实践依据。为进一步培育具有菌核病抗性的油菜品种提供了新的育种材料。

6.BnMPK3这一油菜菌核病抗性基因的发现，为发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并深入探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论指导意义；在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。

附图说明：

图1为测序得到的MPK3序列与其它物种MPK3的第1-200个氨基酸序列比对结果。

图2为测序得到的MPK3序列与其它物种MPK3的第201-376个氨基酸序列比对结果。

其中图1和图2各物种的缩写为：BnMAPK3为测序得到的MPK3序列；Bj（ Brassica juncea）：芥菜；At （Arabidopsis thaliana）：拟南芥；Cb（Chorispora bungeana）：高山离子芥；Md（Malus domestica ）：苹果；Bp（Betula platyphylla）：白桦；Gh（Gossypium hirsutum）：陆地棉；Sl（Solanum lycopersicum）：番茄；Cm（Cucumis melo）：甜瓜；Cs（Cucumis sativus）：黄瓜；Sp（Solanum peruvianum）：秘鲁番茄。黑色区域显示的为相同的氨基酸，灰色区域显示的为类似的氨基酸。

图3为BnMPK3对核盘菌侵染的反应。

图4为植物转化载体1300-35S-MPK3-NOS的构建过程示意图。

图5为油菜BnMPK3 过表达转基因株系的鉴定；“正”为1300-35S-MPK3-NOS载体的PCR阳性对照。#1到#21分别为21个过表达转基因株系。“负”为非转基因野生型对照。

图6为qPCR检测转基因过表达株系与非转基因野生型株系中BnMPK3表达水平的比较；WT为非转基因野生型对照；O-2、O-5、O-6、O-8、O-18和O-19均 为独立的过表达转基因株系。

图7为 非转基因野生型株系与过表达转基因株系的菌核病抗性比较；WT为非转基因野生型对照； O-8为转基因株系。

图8为过表达转基因株系与非转基因野生型株系菌核病病斑扩展的比较；WT为非转基因野生型对照；O-2、O-6、O-8为独立的BnMPK3 过表达转基因株系。

具体实施方式

实施例 1: BnMPK3 基因的分离克隆

（ 1 ） BnMPK3 基因的分离和克隆

以甘蓝型油菜中双9号品种（购于中国农科院植物油料所）作为实验材料，生长条件为：温度为20 ± 2°C；湿度为60-90%；每天光周期为光照8 h黑暗16 h；光照强度为44 μmol m^–2 s^–1。

油菜叶片总RNA的提取和cDNA的合成采用UNIQ- 10柱式Trizol试剂盒（购于上海英俊生物技术有限公司），使用DNase Ⅰ（宝生物工程 (大连) 有限公司）除去总RNA中混有的少量DNA，最后用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。cDNA 的合成按照MMLV反转录酶试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）的操作说明进行，引物用50 μmol/L Oligo(dT)18 （Thermo Fisher Scientific）。然后使用引物

BnMPK3-1-F (5′- TCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3′) 和

BnMPK3-1-R (5′- GGATATTTAGCCATTCATTCG-3′)来扩增目的条带（该对引物是以NCBI上公布的拟南芥AtMPK3（Gene ID: 823706）的编码序列设计的），然后将PCR产物克隆进pMD18-T载体（宝生物工程 (大连) 有限公司）。目的片段的回收、连接与转化参照UNIQ- 10柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）进行操作。目的片段与T 载体的连接体系为：4.6 μL 目的片段、0.4 μL pMD-18T载体、5 μL Solution Ⅰ（宝生物工程 (大连) 有限公司）在16℃ 下连接过夜。将其送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

（ 2 ） BnMPK3 基因序列结构分析

经测序，发现这个基因的核苷酸序列长为1299bp，含有一个全长的开放阅读框，使用ClustalX(Thompson et al., 1997 ）程序进行多种氨基酸序列的比对发现，这个目的条带与拟南芥、芥菜、高山离子芥、苹果、白桦、陆地棉、番茄、甜瓜、黄瓜和秘鲁番茄的MPK3在氨基酸水平上有很高的同源性，与在NCBI上比对的结果一致（图1和图2）。

实施例 2 : BnMPK3 对核盘菌的反应

（ 1 ） 核盘菌的处理

对油菜幼苗（四叶一心期时）第三叶进行菌核病病原菌核盘菌（从甘蓝型油菜的中双9号品种（购于中国农科院植物油料所）中分离，经实验室活化）的接种处理，处理前将植株进行23℃恒温培养4～5天，然后叶片置于黑暗环境保湿24 h。然后用核盘菌的菌丝块进行接种，对照接以无菌培养基块。分别在接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h采样。

（ 2 ） 甘蓝型油菜 RNA 的提取

利用植物Trizol（上海英俊生物技术有限公司）试剂抽提步骤1中核盘菌处理0h 、12h 、24h、 36h 、48h后叶片的总RNA。

（ 3 ） 实时定量 PCR

荧光定量PCR使用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix –Plus–试剂盒（宝生物工程 (大连) 有限公司），采用油菜管家基因BnUBC21和BnTIP41作为内参，BnUBC21 (ubiquitin-conjugating enzyme 21)作为内标基因，其引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Bn UBC21（Gene ID: 832645）引物为：

F:5’- CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT

R:5’- CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC

Bn TIP41（Gene ID:AT4G34270）由于NCBI数据库中缺乏相关基因的序列信息，本发明使用拟南芥中同源基因的蛋白序列与已公布的芸苔属植物数据库（Brassica gene database，BRAD）进行蛋白序列比对（BLASTP）以获得这个内参基因在白菜中的同源蛋白序列（Gene ID: Bra011516）及相应的DNA序列。使用Primer Premier 5.0软件该基因的编码区设计特异性引物（由于数据库提供的DNA序列信息缺乏UTR区），并应用Primer-BLAST(NCBI)在芸苔属植物基因数据库（BRAD）和油菜EST数据库中进行引物特异性比对分析，以验证引物的特异性。

Bn TIP41的引物是:

5’- TGAAGAGCAGATTGATTTGGCT-3’和

5´- ACACTCCATTGTCAGCCAGTT-3´，

BnMPK3基因的引物序列：

BnMPK3-2-F： 5´- ACCAGGGCTTGTCTGAGGA-3´ 和

BnMPK3-2-R： 5´- AATCGCAGTTGGCGTTCA- 3´。

（该对引物是以实施例1中测序得到的核苷酸序列设计的荧光定量PCR特异性引物）荧光定量反应体系为20 µL：含有SYBR Mix 10 µL，正反向引物（10 µmol/L）各0.8 µL，模板2 µL和DEPC处理过的无菌水。扩增条件为：95℃，30sec；然后95℃ 5s，60℃ 30 s，72℃ 27s，40个循环；每个循环于72℃复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至72℃，再缓慢升温至95℃，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。检测BnMPK3分别在油菜核盘菌诱导的叶片0-48 h 的动态表达变化。

利用ABI(美国应用生物***公司)型号为QPCR7300仪所自带的软件7300 System-SDSS hell，优化内标基因和目的基因PCR反应条件，使之扩增产物特异。本实验以油菜BnUBC21和BnTIP41为内标基因，分别测定内标基因和目的基因的Ct值，取其平均值，用比较Ct法得到目的基因对内标基因的DCt，然后以水处理的叶片为参照（即将其值转换成1）分别获得其它处理的DDCt，最后通过2-DDCt估算目的基因的相对表达值，并且求出***误差。

结果显示，当核盘菌侵染12h时，BnMPK3的转录水平升高5.06倍，当核盘菌侵染48h时，BnMPK3的表达量相较于未接种核盘菌菌株提高8.98倍（图3），说明油菜BnMPK3对核盘菌的侵染有显著的响应。

实施例 3: 过表达 BnMPK3 转基因油菜植株的获得

（ 1 ） 植物过表达载体构建

根据NCBI上公布的CaMV 35S序列（Gene ID:AJ007626）使用Primer Premier 5.0软件设计引物

5′-GAATTCTTAATTAAGAGCTCGCATGCC-3′和

5′-GGTACCGTCCCCGTGTTCTCTCCAA-3′，采用PCR的手段从pEGAD载体（购于宝生物工程(大连)有限公司）中扩增得到CaMV 35S片段，然后将其连接到pCAMBIA1300载体（购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）的EcoRI/KpnI酶切位点；同时根据NCBI上公布的CaMV Nos序列（Gene ID: AJ007624）使用Primer Premier 5.0软件设计引物

5′- GGATCCGAATTTCCCCGATCGTTCAA′-3′和

5′-AAGCTTGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3′，用PCR从pEGAD载体中扩增得到CaMV Nos片段，将其连接到pCAMBIA1300载体的BamHI/HindIII酶切位点，则得到pCAMBIA1300-35S-Nos载体。所用内切酶EcoRI、KpnI、BamHI及HindIII均购于宝生物工程 (大连) 有限公司，酶切条件为37℃静置12h。

接着设计引物（以NCBI上公布的拟南芥AtMPK3的编码序列（Gene ID: 823706）设计的）

BnMPK3-1-F ：5′-GGTACCTCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3′和

BnMPK3-1-R：5′-GGATCCGGATATTTAGCCATTCATTCG-3′，以甘蓝型油菜cDNA为模板进行PCR扩增，得到长为1299kb的目的片断，将其连接到pCAMBIA1300-35S-Nos的KpnI/BamHI酶切位点上，反应体系为：I. KpnI 1 µL，10*Hbuffer1µL，DNA 1ul (2µg)，ddH20 7µL；II. BamHI 1µL，10*Kbuffer1µL，DNA 1ul (2µg)，ddH20 7µL，将其置于37℃静置 12h。从而创建到甘蓝型油菜BnMPK3转基因过量表达载体1300-35S-MPK3-NOS，在其T-DNA区内含有抗潮霉素的筛选标记，BnMPK3过量表达的启动子为35s启动子（图4）。

（ 2 ） 油菜的遗传转化

a.将载体1300-35S-MPK3-NOS转入农杆菌GV3101（购于上海迈其生物科技有限公司），浸染油菜花三次，每次五分钟。浸染步骤为：

b.在含有利福平 、庆大霉素、 卡那霉素(50mg/mL)的LB液体培养基的试管中培养含有重组质粒的农杆菌GV3101，然后按10%的比例接入含有上述三种抗生素（50mg/mL）的LB液体培养基的三角瓶使农杆菌培养液终浓度为OD600约为2.0左右。

c. 在培养基内加入转化缓冲液：

0.1% Silwet-L77

2ng/L 6-BA

8mg/L 乙酰丁香酮

把油菜的整个未开的花蕾部分浸泡在1300-35S-MPK3-NOS载体转化GV3101后得到的农杆菌溶液中3-5min，同时轻轻摇动使花蕾充分接触农杆菌液。把浸泡过的花蕾套入羊皮纸袋24h，以保持花蕾具有较高的湿度，避免花蕾在过量的阳光中暴晒，防止农杆菌失去活性。

d. 隔一天重复步骤c，并把整个花蕾套在羊皮纸袋中48h。

e. 浸花结束后，去掉花序上的羊皮纸袋，剪切新生出的侧枝花序以及经过浸花的花序其顶端新萌发的花蕾，并利用彩色丝线对浸染过农杆菌的花序进行系线标记，不同重组质粒的构建进行标签标记。

f. 正常的浇灌培养植株，并定时剪除新生的侧枝花序以及新生花蕾，直到种子成熟时停止灌溉，收获干种子，通过重组质粒上携带的选择标记进行转化子的筛选，通过此方法筛选出大量的BnMPK3过量表达转化株。

（ 3 ） 转基因植株鉴定

收获的种子出苗以后先用25mg/L的潮霉素（购于北京拜尔迪生物技术有限公司）筛选，选取抗潮霉素的植株，分别进行标号区分（编号为从#1至#21），提取基因组，用PCR进行鉴定，所用的引物为

BnMPK3-1-F ：5′-TCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3′和

BnMPK3-1-R ：5′-GGATATTTAGCCATTCATTCG-3′，

对照为非转基因野生型植株（WT），为阴性对照组；阳性对照为含有该基因的一个质粒。

检测结果表明（图5），阳性对照和#1-#3，#5-#8，#10-#15，#17-#19这16个转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带（952bp），而阴性对照则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有外源基因DNA 片段。

（ 4 ）过表达 BnMPK3 转基因油菜的 qPCR 鉴定

为了确定BnMPK3在油菜中是否过量表达，采用qPCR方法对步骤（3）鉴定得到的转基因植株进行分析，BnMPK3的扩增引物为

BnMPK3-2-F ：5'-ACCAGGGCTTGTCTGAGGA-3'和

BnMPK3-2-R：5'-AATCGCAGTTGGCGTTCA-3'（该对引物是以实施例1中测序得到的核苷酸序列设计的荧光定量PCR特异性引物） ，内参基因为BnTIP41，其扩增引物5’- TGAAGAGCAGATTGATTTGGCT -3’和5’- ACACTCCATTGTCAGCCAGTT-3’，上海生工合成。PCR程序：95℃预变性30S，然后经40 个循环（95℃ 10s、57℃ 10s、72℃ 26s）。

将步骤（3）鉴定得到的转基因植株分析过表达的植株编号前面加O（over的缩写）。

如图6所示，O-2、O-5、O-6、O-8、O-18和O-19株系的BnMPK3表达水平均显著高于非转基因的野生型对照，表达量均在3倍以上，O-18株系的表达量达到野生型株系的7倍。表明这几个株系为独立的BnMPK3过表达转基因株系。

实施例 4 ： BnMPK3 过表达转基因油菜抗菌核病的评价

取实施例3中PCR检测为阳性的四叶一心期的转BnMPK3阳性植株的第四片真叶进行离体接种。叶片剪下置于白瓷盘中，每个转基因植株叶片与非转基因对照并排置于一个盘中，叶片下铺一层湿纱布，取新鲜制备的φ5mm菌丝块，有菌丝的面朝下，接种于叶片中部稍稍偏离主脉的位置，每叶接种两个菌丝块。用透气膜蒙上盘口利于保湿，然后置22℃黑暗培养。

菌丝培养后12 h开始观察记录菌丝的发生情况，培养后24 h开始观测记录菌斑生长量，每隔24 h一次，直至菌丝长到离体叶边缘为止。

离体叶片接种鉴定结果显示转基因植株明显增强菌核病抗性。如图7和图8所示，从接种0h到72小时持续对叶片进行观察，发现核盘菌病斑在BnMPK3过表达转基因株系中的生长面积要比非转基因株系中小很多，损伤组织的面积也要小。根据核盘菌的生长面积可以发现，野生型植株软腐坏死发生在核盘菌接种18 h后，且在30-54 h期间生长迅速，在54 h时其生长面积达到最大。BnMPK3过表达转基因植株的侵染时间比野生型菌株晚，菌斑扩散速率和野生型菌株相差不大，因其侵染时间晚，在核盘菌侵染72小时后达到最大侵染面积。由此可知，BnMPK3能有效增强油菜叶片对菌核病的抗性，且对菌核病的抗性可能为抗侵型。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 甘蓝型油菜基因BnMPK3及其抗油菜菌核病的应用

<130> 甘蓝型油菜基因BnMPK3及其抗油菜菌核病的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400> 1

tcttctcatt tcagtccctc atctaactgt aatataatta tatatataaa ggagtcacac 60

aataccttca gattcactat acctcaaagc acaacaagtc aagcttgaag ttgacttagc 120

gcgtcatcga ttgaaagaga gagagagaga gagatgaaca acgccggcgg ccaatatcca 180

gattttccgg cggtgcagac gcacggagga cagttcataa gctacgatat cttcggtagt 240

ttattcgagg tcacatccaa gtaccgtcct ccgattgttc caatcggtcg gggcgcatac 300

ggcatcgttt gctctgtgtt ggattcggag acgaacgagc ttgtggcgat gaagaagata 360

gccaacgcct ttgataatca catggacgcc aagcgtacac ttcgcgagat caagcttctt 420

cgtcatctcg atcatgaaaa catcatagct ataagagatg tggttcctcc accacttaga 480

agagagttca gtgatgttta tatcgccact gggttaatgg acactgatct tcatcaaatc 540

atcagatcca accagggctt gtctgaggaa cactgtcagt acttcctgta ccagcttctt 600

cgagggctca agtacatcca ctcggctaaa gttatccaca gggatctaaa gcctagcaat 660

cttctcctga acgccaactg cgatttaaag atctgtgatt ttggtcttgc tagacccact 720

tcagagaacg agtttatgac tgagtatgtt gttaccagat ggtatagagc acctgagctt 780

ctgctcaact catctgatta cacagctgct atagatgttt ggtctgttgg ttgtatcttt 840

atggagctca tgaacagaaa gcctttgttc cctggtaaag accatgtcca tcagatgcgc 900

ttattgacag agttgcttgg cacgccgaca gaatcagatc tcgggtttac acacaacgag 960

gatgccaaaa gatacatccg gcagcttccc aacttccctc gccaaccgtt agctaaactg 1020

ttctctcatg ttaactcatt ggccattgat ctagttgaca gaatgttgac gtttgacccc 1080

aacaaaagaa tcactgttga agaagctctg aatcacccgt acctagccaa gttgcacgac 1140

ccgaatgatg agccaatctg tctaaagcca ttctctttcg actttgaaca acaacctcta 1200

gacgaggaac agataaaaga gatgatctac agggaagcca ttgcactcaa tccaacatat 1260

gcttagaaga gcagcaaccg aatgaatggc taaatatcc 1299

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400> 2

Met Asn Asn Ala Gly Gly Gln Tyr Pro Asp Phe Pro Ala Val Gln Thr

1 5 10 15

His Gly Gly Gln Phe Ile Ser Tyr Asp Ile Phe Gly Ser Leu Phe Glu

20 25 30

Val Thr Ser Lys Tyr Arg Pro Pro Ile Val Pro Ile Gly Arg Gly Ala

35 40 45

Tyr Gly Ile Val Cys Ser Val Leu Asp Ser Glu Thr Asn Glu Leu Val

50 55 60

Ala Met Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp Asn His Met Asp Ala Lys

65 70 75 80

Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Leu Asp His Glu Asn

85 90 95

Ile Ile Ala Ile Arg Asp Val Val Pro Pro Pro Leu Arg Arg Glu Phe

100 105 110

Ser Asp Val Tyr Ile Ala Thr Gly Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln

115 120 125

Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly Leu Ser Glu Glu His Cys Gln Tyr Phe

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Lys Val

145 150 155 160

Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys

165 170 175

Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Pro Thr Ser Glu Asn

180 185 190

Glu Phe Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu

195 200 205

Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser

210 215 220

Val Gly Cys Ile Phe Met Glu Leu Met Asn Arg Lys Pro Leu Phe Pro

225 230 235 240

Gly Lys Asp His Val His Gln Met Arg Leu Leu Thr Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Thr Pro Thr Glu Ser Asp Leu Gly Phe Thr His Asn Glu Asp Ala Lys

260 265 270

Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Asn Phe Pro Arg Gln Pro Leu Ala Lys

275 280 285

Leu Phe Ser His Val Asn Ser Leu Ala Ile Asp Leu Val Asp Arg Met

290 295 300

Leu Thr Phe Asp Pro Asn Lys Arg Ile Thr Val Glu Glu Ala Leu Asn

305 310 315 320

His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu His Asp Pro Asn Asp Glu Pro Ile Cys

325 330 335

Leu Lys Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Gln Pro Leu Asp Glu Glu

340 345 350

Gln Ile Lys Glu Met Ile Tyr Arg Glu Ala Ile Ala Leu Asn Pro Thr

355 360 365

Tyr Ala

370

Claims (6)

1.一种重组载体1300-35S-MPK3-NOS，其特征在于，所述载体包含SEQ ID NO.1所示的BnMPK3基因的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的重组载体1300-35S-MPK3-NOS在抗油菜菌核病中的应用。

3.根据权利要求1所述的重组载体1300-35S-MPK3-NOS，其特征在于，所述重组载体是在载体pCAMBIA1300的上游EcoRI/KpnI酶切位点处加入CaMV 35S强启动子，其下游BamHI/HindIII酶切位点处加上CaMV Nos终止子，将其改造成载体pCAMBIA1300-35S-Nos；再将BnMPK3基因克隆到pCAMBIA1300-35S-Nos的酶切位点KpnI/BamHI上得到。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：构建重组载体1300-35S-MPK3-NOS；将得到的重组载体转入农杆菌GV3101，以浸花法转化甘蓝型油菜，采用PCR技术鉴定出转基因株系；通过实时荧光定量PCR技术鉴定BnMPK3基因表达水平；重组载体1300-35S-MPK3-NOS转染的BnMPK3过表达转基因株系的油菜叶片表现出对菌核病的抗性。

5.如SEQ ID NO.1所示的一种油菜BnMPK3基因在抗油菜菌核病中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据SEQ ID NO.1所示的油菜BnMPK3基因，构建重组载体1300-35S-MPK3-NOS；

（2）将步骤（1）得到的重组载体转入农杆菌GV3101，以浸花法转化甘蓝型油菜，采用PCR技术鉴定出转基因株系；

（3）通过实时荧光定量PCR技术鉴定BnMPK3表达水平；

（4）BnMPK3过表达转基因株系的BnMPK3表达水平显著高于非转基因株系，BnMPK3能有效增强油菜叶片对菌核病的抗性。