CN103479662A - 金诺芬在制备抗血管生成类药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金诺芬在制备抗血管生成类药物中的应用。至今尚未见有关于金诺芬抗血管生成活性的相关报道。本发明提供金诺芬在制备抗血管生成类药物中的应用。利用斑马鱼血管生成模型进行验证，金诺芬能够显著抑制斑马鱼血管生成。因此，金诺芬可以用于抗血管生成类药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及金诺芬在制备抗血管生成类药物中的应用。
背景技术
血管生成（angiogenesis）是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管。肿瘤生长依赖于血管生成的概念始于20世纪70年代初，但其重要性并未受到关注。近二十年，由于发现了血管生成因子对血管生成的作用，以及血管生成对肿瘤生长和侵入转移、特别对肿瘤早期发生的重要影响，血管生成成为近年来肿瘤研究的热点之一，为肿瘤治疗开辟了一个新的思路。
1971年，哈佛大学Judah Folkman教授首次提出抗肿瘤血管疗法，即通过阻断肿瘤新生血管生成切断肿瘤营养供给，可以达到抑制和***的目的。随着近年来发现的具有阻断肿瘤新生血管功能的抗癌物质不断体现出低毒性和不产生耐药性等诸多优点，该理论于2003年被美国《科学》杂志列入年度十大科技突破。经过40年大量的基础理论研究，目前基于这一疗法，已有多个专利新药上市，如罗氏的Bevacizumab(商品名Avastin,2010年全球销售额67亿美元)，拜耳的Sorafenib（商品名Nexavar,2010年全球销售额9.94亿美元），辉瑞的Sunitinib（商品名Sutent,2010年全球销售额10.7亿美元）。但这些药物价格十分昂贵，均为外企医药巨头垄断。国内目前只有1支真正意义的抗肿瘤血管生成药物通过SFDA批准上市（恩度，先声药业，2005年上市），但年销售额很少（2010年销售额仅2.5亿人民币），尚无法参与全球竞争。其次，由于恩度（重组人血管内皮抑制素注射液，Recombinant Human Endostatin Injection）为大分子蛋白类药物，生产这类高纯度安全制剂需要很高的技术门槛，而且此类型的药物在体内的半衰期较短，从而限制了这些活性蛋白的临床应用。
综上所述，在小分子化合物中寻求新的血管生成抑制剂来有效治疗上述疾病已成为研发热点，开发具有自主知识产权的专利靶向抗血管生成小分子药物迫在眉睫。
金诺芬，英文名：Auranofin;中文化学名：2,3,4,6-四-氧-乙酰基-1-硫代-β-右旋-吡喃葡萄糖-硫（三乙基磷）金盐。英文化学名：(1-Thio-β-D-glucopyranosato)(triethylphosphine)gold2,3,4,6-tetracetate；商品名称：瑞得；分子量：678.49。金诺芬是一种用于治疗类风湿性关节炎的药。金诺芬用于治疗关节炎的机制还不清楚，其抗风湿机制可能与对某些免疫细胞和免疫因子的抑制作用有关。金诺芬的化学结构式如下：
尚未见有关金诺芬抗血管生成（anti-angiogenesis）活性的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供金诺芬的一种新的医药用途。
发明人意外发现金诺芬具有抗血管生成的作用。因此，本发明提供金诺芬在制备抗血管生成类药物中的应用。
上述药物为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型，更具体讲，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式。可以通过本领域已知的方法制备药物制剂。
本发明利用斑马鱼血管生成模型进行金诺芬抗血管生成药效学实验。和传统的血管研究模型（啮齿类小鼠和鸡胚***）相比，目前大量的研究证实，斑马鱼是最理想的血管生物学以及抗血管生成药物评价模型。啮齿类的小鼠和鸡胚***存在各自缺点。通过利用斑马鱼血管生成模型进行药效学评价和药物新靶点验证，已有多支抗癌药物进入临床前实验（Pre-clinical Trail）或者临床试验（Clinical Trial）阶段（包括已获得FDA批准上市的药物）；主要基于斑马鱼抗血管生成模型发现一种治疗恶性肿瘤的老药新用药物-反应停（Thalidomide）已获FDA批准上市。
经斑马鱼体内模型证实，金诺芬对斑马鱼肠下静脉血管（Subintestinal vein,SIV）有显著抑制功能，并呈现一定的剂量依赖性，因此，可用于制备抗血管生成抑制剂。
附图说明
图1为本发明受精后48小时(48hpf)血管转基因荧光斑马鱼体节间血管（ISV）模型。框定区域为斑马鱼体节血管网格局部放大观察的部位。箭头指示体节间血管（ISV,intersegmental vessel）。
图2为本发明定量观察金诺芬对斑马鱼体节间血管生成（angiogenesis）的抑制效果。受精后24hpf的斑马鱼经过药物处理24h,48h时观察。图A为阴性对照（0.1%DMSO），图B为金诺芬1.56μM处理组，图C为阳性对照（150nM VRI）。与阴性对照相比，1.56μM金诺芬能够显著抑制斑马鱼体节间血管（ISV）的生成。带*的为已经断裂的体节间血管。图3为本发明金诺芬对斑马鱼体节间血管（ISV）生成的抑制率。金诺芬对斑马鱼体节间血管（ISV）生成的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，各浓度金诺芬组对斑马鱼体节间血管（ISV）生成的抑制率分别为：0.098μM（26.19%），0.39μM（33.33%），1.56μM（45.24%）。
图4为本发明受精后72小时（72hpf）血管转基因荧光斑马鱼肠下血管（SIV）模型。框定区域为肠下血管（SIV）网格局部放大观察的部位。箭头指示肠下血管（SIV，subintestinal vessel）。
图5为本发明定量观察金诺芬对斑马鱼肠下血管（SIV）的抑制效果。图A-C,受精后24hpf的斑马鱼经过药物处理48h,72h时观察。图A为阴性对照（0.1%DMSO），图B为金诺芬1.56μM处理组，图C为阳性对照（150nM VRI）。虚线所示区域为肠下血管（SIV）面积放大观察的部位。与阴性对照相比，金诺芬能够显著抑制斑马鱼肠下血管（SIV）的生成，表现为肠下血管面积减小。
图6为本发明金诺芬对斑马鱼肠下血管（SIV）生成的抑制率。金诺芬对斑马鱼肠下血管（SIV）生成的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，各浓度金诺芬组对斑马鱼肠下血管（SIV）生成的抑制率分别为：0.098μM（18.37%），0.39μM（29.96%），1.56μM（76.47%），IC50=0.9μM。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
斑马鱼相关缩略词：
受精后小时数：hpf-hours postfertilization；
背长轴血管：DLAV-dorsal longitudinal anastomotic vessel；
体节间血管：ISV-intersegmental vessel；
背主动脉：DA-dorsal aorta；
后主静脉：PCV-posterior cardinal vessel；
肠下静脉血管：SIV-subintestinal vessel；
绿色荧光蛋白：GFP-green fluorescent protein。
实施例1：定性观察金诺芬对斑马鱼体节间血管（ISV）生成模型的抑制效果。
斑马鱼：本实施例使用的斑马鱼为血管转基因绿色荧光斑马鱼（一种由斑马鱼内皮细胞特异表达的基因作为驱动子驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼血管内皮细胞特异表达）（图1），饲养和使用标准严格参照美国实验动物管理和使用委员会（IACUC）的要求进行。
养鱼水（Fish water）配制方法：1L去离子水加入0.2g海盐（Instant Ocean salts）。
二甲基亚砜（DMSO，分析纯）：购买于Sigma-Aldrich(货号#101259268，批号#SHBC2572V)。
0.1%DMSO溶液（阴性对照）配制：使用时，用养鱼水配制成浓度为0.1%的工作液，现配现用。
金诺芬（Auranofin）：购买于Sigma-Aldrich（货号#6512，批号#042M4750V），纯度≥98.0%(HPLC法)，CAS号为：34031-32-8。使用时，用0.1%DMSO溶液配制成实验所需的浓度，本实验中金诺芬的使用浓度为0.098μM,0.39μM,1.56μM。
阳性对照药：酪氨酸激酶受体抑制剂Ⅱ（VRI）：品牌为Calbiochem，货号#676481，批号#D00140685。纯度>99.0%(HPLC法)，CAS号为269390-69-4。使用时，用0.1%DMSO溶液配制成实验所需的浓度，本实验中阳性对照药的使用浓度为150nM。
实验方法：
（1）实验分组及胚胎处理：取100只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时间为受精后24hpf(hour-postfertilization,hpf)，随机分为5组（阴性对照组，三个浓度的药物处理组，阳性对照组），每组胚胎数量为20只。操作时将胚胎均匀分配至24孔细胞培养平板（NUNC,中国）中，每孔20只胚胎，每孔胚胎饲养用水1.0ml。
（2）药物处理：用移液器（量程100-1000μl,Eppendorf）迅速将预先配制好的药液加入24孔细胞培养平板对应的孔中，每孔1.0ml。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40-70%。
（3）表型观察及统计：在体式显微镜下观察各胚胎的表型，观察指标：观察药物对胚胎发育、血液循环，心脏跳动等方面的影响。然后，将胚胎置于荧光显微镜（OLYMPUS IX71）下进一步观察拍照，拍照时间为48hpf，以确认血管生成抑制表型。
实验结果见图2：金诺芬显著抑制斑马鱼节间血管（ISV）的生成，表现为节间血管缺失。
实施例2：定量评价金诺芬对斑马鱼体节间血管（ISV）生成模型的抑制效果。
斑马鱼血管内皮细胞出芽从受精后20hpf开始，30-31hpf左右形成主要的体节间血管网络，如背长轴血管（DLAV）和体节间血管（ISV），48hpf基本上形成完整的体轴血管网络，此时清晰可见完整的体节间血管（ISV）。完整的体节间血管主要指连接背主动脉（DA）和背长轴血管（DLAV）之间的那一段血管。48hpf的斑马鱼一共有28对完整的体节间血管（ISVs）。
实验方法如下：
（1）实验分组及胚胎处理：取100只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时间为受精后24hpf(hour-postfertilization,hpf)，随机分为5组，见表1。
表1
每组胚胎数量为20只。操作时将胚胎均匀分配至24孔细胞培养平板（NUNC,中国）中，每孔胚胎饲养用水1.0ml。
（2）药物处理：见实施例1中的实验方法操作步骤（2）。
（3）表性观察及定量统计：将各药物浓度处理后的胚胎在荧光显微镜下进行观察拍照，拍照时间为48hpf，以分析各药物浓度对斑马鱼体节间血管（ISV）生成的影响。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计，统计指标如下：
①完整的体节间血管（ISVs）数量：连接背主动脉（DA）和背长轴血管之间（DLAV）的血管
利用GraphPad Prism5.0软件进行统计作图。实验结果见图3：金诺芬对斑马鱼体节间血管（ISV）生成的抑制率随着浓度的上升呈梯度增加，各浓度金诺芬组对斑马鱼体节间血管（ISV）生成的抑制率分别为：0.098μM（26.19%），0.39μM（33.33%），1.56μM（45.24%）。
实施例3定性观察金诺芬对斑马鱼肠下血管（SIV）生成模型的抑制效果。
斑马鱼肠下血管（SIV，subintestinal vessel）生长在卵黄囊两侧，其形状似一个篮子，肠下血管（SIV）由体节腹侧向下延伸的长度约为50-100μM。见图4（72hpf血管转基因荧光斑马鱼肠下血管模型）。
实验方法如下：
（1）实验分组及胚胎处理：取100只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时间为受精后24hpf(hour-postfertilization,hpf),随机分为5组（阴性对照组，三个浓度的药物处理组，阳性对照组），每组胚胎数量为20只。操作时将胚胎均匀分配至24孔细胞培养平板（NUNC,中国）中，每孔胚胎饲养用水1.0ml。
（2）药物处理：见实施例1中的实验方法操作步骤（2）。
（3）表型观察及统计：在体式显微镜下观察各胚胎的表型，观察指标：观察药物对胚胎发育、血液循环，心脏跳动等方面的影响。然后，将胚胎置于荧光显微镜（OLYMPUSIX71）下进一步观察拍照，拍照时间为72hpf，以确认血管生成抑制表型。
实验结果见图5：1.56μM金诺芬显著抑制斑马鱼肠下血管（SIV）的生成，表现为肠下血管面积减小。
实施例4：定量观察金诺芬对斑马鱼肠下血管（SIV）生成模型的抑制效果。
（1）实验分组及胚胎处理：取100只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时间为受精后24hpf(hour-postfertilization,hpf),随机分为5组，见表2。
表2
（2）药物处理：见实施例1中的实验方法操作步骤（2）。
（3）表型观察及定量统计：在体式显微镜下观察各胚胎的表型，观察指标：观察药物对胚胎发育、血液循环，心脏跳动等方面的影响。然后，将胚胎置于荧光显微镜（OLYMPUS IX71）下进一步观察拍照，拍照时间为72hpf，以分析各药物浓度对斑马鱼肠下血管（SIV）生成的影响。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计，统计指标如下：
①肠下血管长度（SIV length）:利用Image-Pro Plus6.0软件进行计算。
利用GraphPad Prism5.0软件进行统计作图。实验结果见图6：金诺芬对斑马鱼肠下血管（SIV）生成的抑制率随着浓度的上升呈梯度增加，各浓度金诺芬组对斑马鱼肠下血管（SIV）生成的抑制率分别为：0.098μM（18.37%），0.39μM（29.96%），1.56μM（76.47%），IC50=0.9μM。
Claims (3)
1.金诺芬在制备抗血管生成类药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服给药剂型，注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式。
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