具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步阐述,但本发明的保护范围并不限于此。
斑马鱼相关缩略词
受精后小时数:hpf-hours postfertilization
背长轴血管:DLAV-dorsal longitudinal anastomotic vessel
体节间血管:ISV-intersegmental vessel
背主动脉:DA-dorsal aorta
后主静脉:PCV- posterior cardinal vessel
肠下静脉血管:SIV-subintestinal vessel
绿色荧光蛋白:GFP-green fluorescent protein
实施例1 定性观察美司那对斑马鱼体节间血管(ISV)生成模型的抑制效果
斑马鱼:
本实施例使用的斑马鱼为血管转基因绿色荧光斑马鱼(一种由斑马鱼内皮细胞特异表达的基因作为驱动子驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼血管内皮细胞特异表达),饲养和使用标准严格参照美国实验动物管理和使用委员会(IACUC)的要求进行。
养鱼水(Fish water):
配制方法:1L反渗透水(reverse osmosis (RO) water)加入0.3g海盐(Instant Ocean salts)。
二甲基亚砜(DMSO,分析纯):
购买于上海晶纯实业有限公司(货号#1095515,批号#30573)。0.1% DMSO溶液(阴性对照) 配制:使用时,用养鱼水配制成浓度为0.1%的工作液,现配现用。
洛伐他汀(阳性对照):
购买于大连美仑,纯度大于98%(HPLC法)。使用时,用0.1% DMSO溶液配制成实验所需的浓度,本实验中阳性对照药的使用浓度为10μM。
美司那购买于Sigma-Aldrich公司,使用时用0.1% DMSO溶液配制成不同浓度的美司那溶液,使用浓度为10μM。
斑马鱼血管内皮细胞出芽从受精后20hpf开始,30-31hpf左右形成主要的体节间血管网络,如背长轴血管(DLAV)和体节间血管(ISV),48hpf基本上形成完整的体轴血管网络[30],此时清晰可见完整的体节间血管(ISV)。完整的体节间血管主要指连接背主动脉(DA)和背长轴血管之间(DLAV)之间的那一段血管,见图1(48hpf血管转基因荧光斑马鱼体节间血管模型)。实验方法如下:
(1)实验分组及胚胎处理:取45只发育良好的斑马鱼胚胎,胚胎发育时相为受精后23hpf (hour-postfertilization,hpf) ,随机分为3组(阴性对照组,美司那处理组,阳性对照组),每组胚胎数量为15只。操作时将胚胎均匀分配至48孔细胞培养平板(Greiner,德国)中,每孔15只胚胎,每孔胚胎饲养用水1ml。
(2)药物处理:用移液器(量程100~1000μl,Eppendorf)迅速将预先配制好的药液加入48孔细胞培养平板对应的孔中,每孔1ml。加药液之前,用移液器(量程10~1000μl,Eppendorf)将48孔板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出,此操作需在短时间内预先完成,以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右,相对湿度40~70%。然后用锡箔纸将48孔板包裹好,做好实验标记,迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养24h(培养箱温度控制在28.5±0.5℃)。
(3)表型观察及统计:在体式显微镜下观察各孔胚胎的表型,观察指标:观察药物对胚胎发育、血液循环以及心脏跳动等方面的影响。然后,将血液循环受到影响的胚胎置于体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进一步观察拍照,拍照时相为48hpf,以确认血管生成抑制表型。
实验结果见图2:与阴性对照相比,25μM美司那能够抑制斑马鱼体节间血管(ISV)的生成,表现为部分节间血管缺失。
实施例2 定性观察美司那对斑马鱼肠下血管(SIV)生成模型的抑制效果
斑马鱼肠下血管(SIV, subintestinal vessel)生长在卵黄囊两侧,其形状似一个篮子,肠下血管(SIV)由体节腹侧向下延伸的长度约为50~100μm[15-16]。见图3(72hpf血管转基因荧光斑马鱼肠下血管模型)。实验方法如下:
(1)实验分组及胚胎处理:取45只发育良好的斑马鱼胚胎,胚胎发育时相为受精后48hpf (hour-postfertilization,hpf) ,随机分为3组(阴性对照组,美司那处理组,阳性对照组),每组胚胎数量为15只。操作时将胚胎均匀分配至48孔细胞培养平板(Greiner,德国)中,每孔15只胚胎,每孔胚胎饲养用水1ml。
(2)药物处理:见实施例1中的实验方法操作步骤(2)。
(3)表型观察及统计:在体式显微镜下观察各孔胚胎的表型,观察指标:观察药物对胚胎发育、血液循环,心脏跳动等方面的影响。然后,将血液循环受到影响的胚胎置于体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进一步观察拍照,拍照时相为72hpf,以确认血管生成抑制表型。
实验结果见图4:与阴性对照相比,25μM美司那显著抑制斑马鱼肠下血管(SIV)的生成 ,表现为肠下血管面积减小。
实施例3 定量评价美司那对斑马鱼肠下血管(SIV)生成模型的抑制效果
实验方法:
(1)实验分组及胚胎处理:取240只发育良好的斑马鱼胚胎,胚胎发育时相为受精后48hpf (hour-postfertilization,hpf) ,随机分为8组,见下表:
每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至48孔细胞培养平板(Greiner,德国)中,每孔15只胚胎,每个药物浓度处理30只胚胎,每孔胚胎饲养用水1ml。
(2)药物处理:见实施例1中的实验方法操作步骤(2)。
(3)表型观察及定量统计:将各药物浓度处理后的胚胎在体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进行观察拍照,拍照时相为72hpf,以分析各药物浓度对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的影响。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计,统计指标如下:
①肠下血管面积(SIV area):利用Nikon AZ100体式荧光显微镜配置的
NIS-Elements 3.1软件进行计算
利用GraphPad Prism软件进行统计作图, 并计算美司那抑制斑马鱼肠下血管(SIV)生成的IC50 ,实验结果见图5:美司那对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加,各浓度美司那组对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率分别为:0.25μM(6.9%),0.5μM(18%),1μM(39%),2.5μM(48%),10μM(69%),25μM(85%)。
实施例4 斑马鱼人类结肠癌(Colo320)移植模型评价美司那的抗肿瘤药效
实体肿瘤的生长和扩散依赖于肿瘤内新血管的形成,并通过新生血管获取养分;新血管的形成和生长,促进了肿瘤细胞的转移。本实施例用于说明美司那能够抑制肿瘤的生长和迁移。实验方法如下:
(1)实验分组及胚胎处理:取150只移植有人类结肠癌(Colo320)细胞的斑马鱼胚胎,胚胎发育时相为受精后2dpf (day-postfertilization,dpf) ,随机分为5组,见下表:
每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至6孔细胞培养平板(Greiner,德国)中,每孔30只胚胎,每个药物浓度处理30只胚胎,每孔胚胎饲养用水3ml。
(2)药物处理:用移液器迅速将预先配置好的药液加入6孔细胞培养平板对应的孔中,每孔3ml。然后用锡箔纸将6孔板包裹好,做好实验标记,放置于斑马鱼培养箱中继续培养4d(培养箱温度控制在35.5±0.5℃)。
(3)表型观察及定量统计:将各浓度药物处理后的胚胎在体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进行观察拍照,拍照时相为6dpf,以分析各药物浓度对斑马鱼人类结肠癌(Colo320)移植模型的抑制作用。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计,统计指标如下:
① 定性评价美司那对肿瘤转移的抑制作用;
② 定量评价美司那对肿瘤生长的抑制作用:利用尼康NIS-Elements 3.1软件计算肿瘤细胞荧光强度(S),统计学处理结果以mean±SE表示;美司那对肿瘤生长的抑制效果计算公式如下:
利用GraphPad Prism软件进行统计作图,实验结果见图6~图7:美司那对人类移植癌细胞生长的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加,三个浓度美司那组抑制率分别为:1μM(10.3%),2.5μM(21.2%),10μM(38.9%)。
实施例5 定量评价美司那对湿性老年视黄斑变性的治疗作用
湿性老年视黄斑变性主要因为脉络膜血管异常生成,新生的无效微血管出现渗漏,血管渗漏的液体进而破坏黄斑。氯化钴能够诱导斑马鱼视网膜脉络丛血管增生、视细胞变性,类似于人类湿性老年视黄斑变性的改变[31]。本实施例用于说明美司那对湿性老年视黄斑变性具有治疗效果。实验方法如下:
(1)实验分组及胚胎处理:取150只发育良好的斑马鱼胚胎,胚胎发育时相为受精后1dpf (day-postfertilization,dpf) ,随机分为5组,见下表:
每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至6孔细胞培养平板(Greiner,德国)中,每孔30只胚胎,每孔胚胎饲养用水3ml。
(2)药物处理:阴性对照组中加入DMSO,使其终浓度为0.1%;模型组中加入氯化钴,使其终浓度为1 mg/ml;美司那通过显微注射方式给药,每组均注射30只胚胎,注射后将胚胎按组分别放入3ml含有1 mg/ml氯化钴的饲养用水中。
(3)表型观察及定量统计:将各剂量药物处理后的胚胎在体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进行观察拍照,拍照时相为5dpf,以分析各药物剂量对斑马鱼眼部脉络膜异常增生血管的抑制作用。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计,统计指标如下:
①定性评价美司那对眼部脉络膜异常增生血管的抑制作用;
②定量评价美司那对脉络膜异常增生血管的抑制作用:利用NIS-Elements 3.1软件计算脉络膜异常增生血管荧光强度(S),统计学处理结果以mean±SE表示;美司那对脉络膜异常增生血管的抑制效果计算公式如下:
利用GraphPad Prism软件进行统计作图,实验结果见图8~图9:美司那对脉络膜血管异常增生的抑制率随着剂量的上升而呈现梯度增加,三个美司那剂量组抑制率分别为:0.16μg(10.5%),0.55μg(25.7%),1.64μg(34.3%)。
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