CN104745499A - 一种共发酵c5和c6生产乙醇微生物的扩大培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，包括将培养所述微生物得到的种子液接种至扩大培养基中，经至少一级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，在所述扩大培养步骤中，通过调节扩大培养过程中的供氧浓度实现对所述微生物的扩大培养。

Description

一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法
技术领域
本发明涉及一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法,属于微生物发酵技术领域。
背景技术
诸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源特别是生物燃料受到越来越多的关注，并带来巨大的商机和社会意义。
根据际能源署（IEA）的相关定义，常规生物燃料包括糖基和淀粉基乙醇、油料作物基生物柴油、可直接利用的植物油以及通过厌氧消化制得的沼气；先进生物燃料技术包括指还处于研发、中试或示范阶段的转化技术，通常称为第二代技术或第三代技术。这一类别包括用动物脂肪和植物油炼制的加氢植物油（HVO），以及用含木质纤维素生物质生产的生物燃料，比如乙醇、费托液和合成天然气。
乙醇是清洁的可再生液体燃料，许多国家已经开始使用添加了一定比例乙醇的汽油—汽油醇，以代替汽油的消耗。这种新型燃料既能缓解石油的消耗速率，又可以减少汽车尾气污染，具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起开始推广使用汽油醇，目前汽油醇占汽油类燃料总消耗量的约20%，并处于逐年增长的势头。
目前国内外生产乙醇所使用的主要原料是玉米等粮食作物。随着世界人口的不断增长，粮食日益短缺，因此从长远来看，粮食作物不是生产乙醇的理想原料。同时，每年有大量的农林业废弃木质纤维材料（如玉米秸秆等）用焚烧等的方式不当处理，不仅造成了原料的浪费，而且污染了环境。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，在农业废弃木质纤维材料中三者的含量大约是：纤维素占30～40%，半纤维素占20～30%，木质素占10～25%。其中葡萄糖是纤维素的主要组成单元，木糖是半纤维素的主要组成单元。在植物纤维材料水解液中木糖占30%左右，是继葡萄糖之后自然界最丰富的糖分，因而利用葡萄糖木糖共发酵生产乙醇原材料丰富，具有广阔的市场前景。
一般而言，用含木质纤维素的生物质进行生物燃料的生产属于先进生物燃料技术范畴。利用含木质纤维素原料生产乙醇通常采用生物化学转化的工艺，包括预处理、水解、发酵和回收等步骤。经过预处理，增加了酶和纤维素材料的可接近性，从而提高原材料的可利用性；水解（包括酶解）以后，半纤维素主要分解为C5糖，而纤维素主要分解为C6糖。由于半纤维素的无定型结构，其更容易被水解为C5糖。在预处理阶段和酶解阶段，会得部分发酵抑制物，例如甲酸、乙酸、糠醛等。
但是，相应面临的困境是，自然界中能高效产醇的微生物通常只能利用葡萄糖等六碳糖生产乙醇，不能利用木糖；而少数能利用木糖产醇的微生物，产醇能力低下，这限制了对自然界中木质纤维素的有效利用。通过代谢工程对微生物进行改造，并利用其代谢转化C5糖主要经过以下反应：木糖还原酶依赖NADPH将木糖还原为木糖醇，木糖醇再在木糖醇脱氢酶作用下转化为木酮糖；再经木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，然后进入磷酸戊糖途径（PPP）。PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶脱羧还原为乙醇。
在基因工程技术的推动下，研究人员获得了一批可以利用木糖代谢生产乙醇的重组发酵微生物。然而，在实际的工业化生产中，尤其是大规模产业化阶段，上述的微生物扩大培养增殖速度较慢，增殖后微生物活力较低，并进一步导致生产乙醇的产率较低，难以实现大规模工厂化应用，并成为了限制这一技术继续向前发展的技术难点之一。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中微生物的扩大增殖速度慢、活力低，难以实现大规模产业化应用的缺陷，从而提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法。
为此,本发明提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，包括将培养所述微生物得到的种子液接种至扩大培养基中，经至少一级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，在所述扩大培养步骤中，通过调节扩大培养过程中的供氧浓度，即逐级减小供氧量的方式，实现对所述微生物的扩大培养。
使用一级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，扩大培养6-12h；随后调整转速40-60rpm、通气量0.18-0.22vvm，扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
使用二级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
1）将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
2）将步骤1）中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-100rpm、通气量0.18-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
使用三级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
1）将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
2）将步骤1）中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-100rpm、通气量0.18-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
3）将步骤2）中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.01-0.2vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
使用四级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
1）将所述种子液按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
2）将步骤1）中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.18-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
3）将步骤2）中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.01-0.2vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
4）将步骤3）中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的四级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、通气量0.0005-0.02vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
所述各级扩大培养过程中，一级扩培罐为50L扩培罐，二级扩培罐为500L扩培罐，三级扩培罐为5立方扩培罐，四级扩培罐为50立方扩培罐。
所述微生物选自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、嗜鞣管囊酵母Pachysolentannophilus、树干毕赤酵母Pichia stipitis、休哈塔假丝酵母Candida shehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纤细假丝酵母Candida tenuis、热带假丝酵母Candida tropicalis、赛沟毕赤酵母Pichia segobiensis、多动拟杆菌Bacteroidespolypragmatus、菊欧文氏杆菌Erwinia chrysanthem、植物克雷伯杆菌Klebsiellaplanticola、嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus、球状螺旋体Spirochaeta coccoides sp.、植物发酵梭菌Clostridium phytofermentas sp.、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、粗糙脉孢菌Neurospora crassa、燕麦镰刀菌Fusariumavenaceum、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis、大肠杆菌Escherichia coli以及重组酿酒酵母S.cerevisiae、重组运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis、重组大肠杆菌Escherichia coli，以及本领域技术人员所熟知的可以进行C5和C6共同发酵产乙醇的其他已知菌株。
本发明所选用的上述微生物是从自然界分离得到，或者经过遗传工程改造后得到，包括细菌、真菌和酵母酿酒。
其中，所述重组酿酒酵母S. cerevisiae是通过真菌的木糖转运酶在酿酒酵母中进行表达，选择木糖异构酶（XI）途径或木糖还原-木糖醇氧化途径（XR-XDH）进行木酮糖转化，并将磷酸戊糖下游代谢路径进行修饰以强化木糖代谢转化乙醇的能力，可利用的酿酒酵母菌记载在专利WO9742307A、WO9513362A、US20110027847、CN1966694A、CN101205525A所公开的菌株。
所述重组运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis 的改造可将E. coli 的xylA(木糖异构酶基因)、xylB(木酮糖激酶基因)、talB(转酮醇酶基因)、tktA(转醛醇酶基因)导入到Z.mobilis中，例如专利US5843760、US5514583、WO200851348A、WO200958927A、WO200944868A或WO200958938A。
所述重组大肠杆菌Escherichia coli，是指将含有PET 操纵子 (携带运动发酵单胞菌丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因) 的质粒转化到E.coli菌株可以使重组E.coli的已糖和戊糖代谢形成的中心代谢物-丙酮酸转向乙醇生产，例如专利CN101875912A中所报道的菌株。
优选的，所述微生物选自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis和/或大肠杆菌E.coli。
进一步优选的，所述微生物为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis。
所述各级扩大培养的过程中，所述扩大培养基彼此独立的含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种做为碳源；含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏中的一种或几种做为氮源；并且选择性的含有尿素、无机盐、氨基酸、微量元素和/或抑制剂。
所述扩大培养能够为后续发酵产生乙醇步骤提供足够多的微生物数量，其中扩大培养基是微生物获得生存的营养来源，对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影响。
所述扩大培养基择性的包括蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液。
作为一种优选，所述扩大培养基为蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且所述扩大培养基中葡萄糖的含量按重量百分比含量为2-10%，优选含量为4-6%。
作为另一种优选，所述扩大培养基中含有4%重量百分比葡萄糖的培养基，或者含重量百分比为4%葡萄糖的玉米糖化醪或糖蜜。
作为另一种优选方，所述扩大培养基还可以是按重量百分比稀释浓度至10-75%的木质纤维素原料酶解液，其中所述木质纤维原料酶解液未被稀释时按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%；优选的，葡萄糖含量为5-20%，木糖含量为3-8%；更优选的，葡萄糖含量为6-12%，木糖含量为3-6%。优选的，所述木质纤维素原料酶解液作为所述扩大培养基时，其按重量百分比稀释浓度为20-30%。
作为又一种优选，为提供所述微生物扩大培养时所需的氮源、微量元素、维生素等物质，所述扩大培养基还含有5-10g/L的黄豆饼粉、玉米饼粉、干物质含量为40-60wt%的玉米浆、鱼粉和/或酵母膏的混合物，优选为8-10 g/L；从而为所述微生物提供包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸的游离氨基酸在内的多种氨基酸，包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙在内的多种微量元素以及包括B族维生素在内的各种维生素。
作为进一步的优选，所述扩大培养基中还含有尿素和/或无机盐，所述尿素在所述扩大培养基中的含量为2-5 g/L，优选为3-4 g/L；所述无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，在所述扩大培养基中的含量为0.5-4 g/L，优选1-3 g/L。更优选的，所述扩大培养基中含有1.5 g/L的磷酸二氢钾和1.5 g/L的磷酸氢二铵。
通常情况下，所述扩大培养过程中如果没有杂菌进入不需要添加抑菌剂，如果有杂菌进入时，作为更进一步的优选，可在所述扩大培养基中添加抑菌剂，所述抑菌剂选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选为青霉素或/链霉素，在所述扩大培养基液中所述抑菌剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。
所述种子液为将所述微生物接种至种子培养基中，经12-24h培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/ml。
所述种子培养基由酵母粉1-15g/L、蛋白胨1-25g/L、葡萄糖15-25g/L，经分装灭菌后混合制备得到。
采用种子培养基对所述微生物进行培养，目的是快速扩增所述微生物，以尽快达到扩大培养所述微生物所需的菌体浓度，所述种子培养基可以采用现有技术中已有的种子培养基，如YEPD等。
所述YEPD是指培养基成分为酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，经分装灭菌后混合制备得到。
本发明的一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法具有以下优点：
1.本发明提供的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，通过至少一级的扩大培养步骤对所述微生物进行培养，并在所述扩大培养步骤中，通过调节供氧浓度，从而使得微生物的增殖速度大大加快，且增殖得到的微生物活性高，相较于同样供氧条件扩培得到的微生物而言，其生产乙醇的产率明显增高。
2.本发明提供的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，选用在逐级扩大的同时调节供氧浓度的培养方式，使得所选微生物能够在更短的时间内得到增殖，且菌种的发酵活力增强，从而更好的实现发酵乙醇的发明目的。
3.本发明提供的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，所述扩大培养基包括碳源、氮源和无机盐等，在扩大培养过程中提供供所述微生物生长扩增所需的各种营养物质，有利于微生物的快速增殖，加快扩大培养的速度以及培养得到微生物的活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法做更加具体的描述。
实施例1
本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S. cerevisiae 424A(LNH-ST)为例进行扩大培养实验，所述重组酿酒酵母S.cerevisiae 424A(LNH-ST)（如Cellulosic ethanol production from AFEX-treatedcorn stover using Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST), M.W. Lau, B.E. Dale,Proc Natl Acad Sci USA, 106 (2009), pp. 1368-1373；Two-step SSCF to convertAFEX-treated switchgrass to ethanol using commercial enzymes and Saccharomycescerevisiae 424A(LNH-ST),M. Jin,M.W. Lau,V. Balan, B.E. Dale,Bioresour Technol,101 (2010),pp. 8171–8178等报道），为市售获得，所述扩大培养方法采用一级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2vvm，培养12h，至上述菌种浓度为（0.1-0.5）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，并调节pH6.5。
B、扩大培养步骤
将培养后的种子液按照5%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度35℃、pH4、转速180rpm通入空气，通气量0.5vvm，培养12h；随后调整转速为40rpm，通气量为0.18vvm，扩大培养12h，至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
所述一级扩大培养基包含用水稀释至30 wt%的木质纤维素原料酶解液、玉米浆（干物质含量40%）15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、(NH4)2HPO4 2.5 g/L，使用去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入2g/L尿素。
对比例1
本对比例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S. cerevisiae 424A(LNH-ST)为例进行扩大培养实验（同实施例1），所述扩大培养方法具体包括如下步骤：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2vvm，培养12h，至上述菌种浓度为（0.1-0.5）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，并调节pH6.5。
B、扩大培养步骤
将培养后的种子液按照5%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度35℃、pH4、转速180rpm通入空气，通气量0.5vvm，培养25 h至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
所述一级扩大培养基与实施例1相同。
实施例2
本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以热带假丝酵母Candida tropicalis为例进行扩大培养实验，所述热带假丝酵母Candidatropicalis为市售所得，所述扩大培养方法采用二级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2vvm，培养至上述菌种浓度为（0.1-0.5）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，并调节pH6.0。
B、扩大培养步骤
1）将培养后的种子液按照20%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.5、转速220rpm通入空气，通气量0.08vvm，培养16h，至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
2）按照20%（v/v）的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.5、转速100rpm通入空气，通气量0.18vvm，培养12 h，至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
所述一级扩大培养基和二级扩大培养基相同，均为含质量百分比为4%的葡萄糖扩大培养基，并含有玉米浆（干物质含量40%）15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、(NH4)2HPO4 1.5g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入3 g/L尿素。
对比例2
本对比例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以热带假丝酵母Candida tropicalis为例进行扩大培养实验，所述热带假丝酵母Candidatropicalis为市售所得，所述扩大培养方法采用二级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.2vvm，培养至上述菌种浓度为（0.1-0.5）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，并调节pH6.0。
B、扩大培养步骤
1）将培养后的种子液按照20%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.5、转速220rpm通入空气，通气量0.08vvm，培养12h，至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
2）按照20%（v/v）的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.5、转速220rpm通入空气，通气量0.08vvm，培养25 h，至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
所述一级扩大培养基和二级扩大培养基均与实施例2相同。
实施例3
本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S. cerevisiae 424A(LNH-ST)为例进行扩大培养实验（同实施例1），所述扩大培养方法采用三级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、通气量0.2vvm、转速200rpm，培养14h，至上述菌种浓度为（0.2-0.3）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉5 g/L、蛋白胨1g/L、葡萄糖25g/L，并调节pH6.5。
B、扩大培养步骤
1）将培养后的种子液按照10%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度30℃、pH5.0、转速200rpm通入空气，通气量0.5vvm，培养14 h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
2）按照15%（v/v）的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25℃、pH6.0、转速100rpm通入空气，通气量0.5vvm，培养16h至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
3）按照5%（v/v）的接种量将所述二级扩培步骤得到的二级扩培液接种至容积为5立方米的含有三级扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度33℃、pH6.2、转速60rpm通入空气，通气量0.01vvm，培养16h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
所述一级扩大培养基和二级扩大培养基相同，均为：含玉米糖化醪4wt%，灭菌后加入3 g/L尿素；
所述三级扩大培养基为：用水稀释至30 wt%木的质纤维素原料酶解液、玉米浆（干物质含量40%）15 g/L、KH2PO4 1.5g/L、(NH4)2HPO4 1.5 g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，并加入3g/L尿素。
对比例3
本对比例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S. cerevisiae 424A(LNH-ST)为例进行扩大培养实验（同实施例1），所述扩大培养方法采用三级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、通气量0.2vvm、转速200rpm，培养14h，至上述菌种浓度为（0.2-0.3）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉5g/L、蛋白胨1g/L、葡萄糖25g/L，并调节pH6.5。
B、扩大培养步骤
1）将培养后的种子液按照10%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度30℃、pH5.0、转速200rpm通入空气，通气量0.5vvm，培养14h，至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
2）按照15%（v/v）的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度30℃、pH5.0、转速200rpm通入空气，通气量0.5vvm，培养26h，至菌种浓度达到（0.1-0.5）×109/ml；
3）按照10%（v/v）的接种量将所述二级扩培步骤得到的二级扩培液接种至容积为5立方米的含有三级扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度30℃、pH5.0、转速200rpm通入空气，通气量0.3vvm，培养31h，至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml。
所述一级扩大培养基、二级扩大培养基和三级扩大培养基均与实施例3相同。
实施例4
本实施例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S. cerevisiae 424A(LNH-ST)为例进行发酵实验（同实施例1），所述扩大培养方法采用四级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
配制YEPD培养基，将保存的上述菌体接种至YEPD培养基中，控制温度30℃、pH6.0、通气量0.2vvm、转速200rpm，培养20h，至上述菌种浓度为（0.2-0.3）×109/ml；
所述YEPD培养基具体含酵母粉1g/L、蛋白胨15 g/L、葡萄糖15g/L，并调节pH6.0。
B、扩大培养步骤
1）将培养后的种子液按照10%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度33℃、pH4.8、转速200rpm通入空气，通气量0.4vvm，培养14 h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
2）按照17%（v/v）的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度30℃、pH5、转速60rpm通入空气，通气量0.3vvm，培养14h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
3）按照18%（v/v）的接种量将所述二级扩培步骤得到的二级扩培液接种至容积为5立方米的含有三级扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度35℃、pH6.5、转速60rpm通入空气，通气量0.18vvm，培养16h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
4）按照20%（v/v）的接种量将所述三级扩培步骤得到的三级扩培液接种至容积为30立方米的含有四级扩大培养基的四级扩培罐中，控制温度33℃、pH5.8、通气量0.01 vvm，培养16h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml。
所述一级扩大培养基和二级扩大培养基均与实施例3中的一级扩大培养基和二级扩大培养基相同；
所述三级扩大培养基和四级扩大培养基均与实施例3中的三级扩大培养基相同。
对比例4
本对比例提供一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，以重组酿酒酵母S. cerevisiae 424A(LNH-ST)为例进行发酵实验（同实施例4），所述扩大培养方法采用四级扩大培养步骤，具体包括：
A、种子液培养步骤
同实施例4。
B、扩大培养步骤
1）将培养后的种子液按照10%（v/v）的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度33℃、pH4.8、转速200rpm通入空气，通气量0.4vvm，培养14 h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
2）按照17%（v/v）的接种量将所述一级扩培步骤得到的一级扩培液接种至容积为500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度33℃、pH4.8、转速200rpm通入空气，通气量0.4vvm，培养24h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
3）按照18%（v/v）的接种量将所述二级扩培步骤得到的二级扩培液接种至容积为5立方米的含有三级扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度33℃、pH4.8、转速200rpm通入空气，通气量0.4vvm，培养24h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml；
4）按照20%（v/v）的接种量将所述三级扩培步骤得到的三级扩培液接种至容积为30立方米的含有四级扩大培养基的四级扩培罐中，控制温度33℃、pH4.8、通气量0.02vvm，培养28h至菌种浓度达到（0.2-0.3）×109/ml。
所述一级扩大培养基、二级扩大培养基、三级扩大培养基和四级扩大培养基均与实施例4相同。
在实施例1、3、4及对比例1、3、4中，木质纤维素原料酶解液的原料选自玉米秸秆，其制备方法如下：
步骤（1）：将玉米秸秆破碎为粒度为10-100 mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；
步骤（2）：在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量2 %的稀释硫酸溶液，进入酸混合罐混合后得到酸性纤维素原料；
步骤（3）：步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPa(G)的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面；
步骤（4）：将生物质处理产物水洗，调节pH 值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合搅拌72h，得到所述酶解液。
发酵产乙醇试验
将实施例1-4和对比例1-4中培养得到的扩大培养菌种液，均按10%接种量接至含发酵培养基的发酵罐中，控制发酵过程中温度30℃，pH6.0，转速200rpm通入空气，通气量0.2vvm，发酵16h，检测发酵产物。
所述发酵培养基为：葡萄糖8wt%、木糖4.5wt%、KH2PO4 0.5 g/L、(NH4)2HPO4 2 g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合。
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法,其特征在于，包括将培养所述微生物得到的种子液接种至扩大培养基中，经至少一级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，在所述扩大培养步骤中，通过调节扩大培养过程中的供氧浓度实现对所述微生物的扩大培养。
2.根据权利要求1所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，使用一级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，扩大培养6-12h；随后调整转速40-100rpm、通气量0.18-0.5vvm，扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
3.根据权利要求1所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，使用二级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
1）将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
2）将步骤1）中得到的扩培微生物按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-100rpm、通气量0.18-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
4.根据权利要求1所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，使用三级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
1）将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
2）将步骤1）中得到的扩培微生物按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-100rpm、通气量0.18-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
3）将步骤2）中得到的扩培微生物按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.01-0.2vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
5.根据权利要求1所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，使用四级扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
1）将所述种子液按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速180-220rpm、通气量0.08-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
2）将步骤1）中得到的扩培微生物按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.18-0.5vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
3）将步骤2）中得到的扩培微生物按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的三级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、转速40-60rpm、通气量0.01-0.2vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL；
4）将步骤3）中得到的扩培微生物按5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的四级扩培罐中，控制温度25-35℃、pH4-6.5、通气量0.0005-0.02vvm，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/mL。
6.根据权利要求1-5任一所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，所述各级扩大培养过程中，一级扩培罐为50L扩培罐，二级扩培罐为500L扩培罐，三级扩培罐为5立方扩培罐，四级扩培罐为50立方扩培罐。
7.根据权利要求1-6任一所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，所述微生物选自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、嗜鞣管囊酵母Pachysolen tannophilus、树干毕赤酵母Pichia stipitis、休哈塔假丝酵母Candidashehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纤细假丝酵母Candida tenuis、热带假丝酵母Candida tropicalis、赛沟毕赤酵母Pichia segobiensis、多动拟杆菌Bacteroides polypragmatus、菊欧文氏杆菌Erwinia chrysanthem、植物克雷伯杆菌Klebsiella planticola、嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus、球状螺旋体Spirochaeta coccoides sp.、植物发酵梭菌Clostridium phytofermentas sp.、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、粗糙脉孢菌Neurospora crassa、燕麦镰刀菌Fusarium avenaceum、运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis、大肠杆菌Escherichia coli以及重组酿酒酵母S.cerevisiae、重组运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis、重组大肠杆菌Escherichia coli。
8.根据权利要求1-7任一所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，所述各级扩大培养的过程中，所述扩大培养基彼此独立的含有玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种做为碳源；含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏中的一种或几种做为氮源；并且选择性的含有尿素、无机盐、氨基酸、微量元素和/或抑制剂。
9.根据权利要求1-8任一所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于，所述种子液为将所述微生物接种至种子培养基中，经12-24h培养至所述微生物浓度达到（0.1-0.5）×109/ml。
10.根据权利要求9所述的共发酵C5和C6生产乙醇微生物的扩大培养方法，其特征在于：所述种子培养基包括酵母粉1-15g/L、蛋白胨1-25g/L、葡萄糖15-25g/L，经分装灭菌后混合制备得到。
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