CN103446083B - 海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。本发明研究海兔素对胶质瘤的抗瘤活性，本发明中经MTT实验发现，随海兔素浓度的增加，对C6细胞的抑制率升高，但80μg/ml以上浓度虽增加，对细胞抑制率却没有明显的增高，说明海兔素最有效的抑瘤浓度为80μg/ml；从作用时间效果看，48h为最佳作用时间，时间再延长，细胞抑制率却没有明显提升。动物实验发现，随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间延长，胶质瘤重量减轻，淋巴细胞浸润增多，40mg/kg·bw为最佳作用剂量。本发明通过实验证明可将海兔素用作治疗胶质瘤的药物，而且海兔素属于天然海洋药物，毒副作用少，具有良好的市场应用前景。

Description

海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。

背景技术

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，且颅内发病率最高，目前的治疗方法仍以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等。但是手术难以切除干净，复发率、死亡率高，放疗化疗效果均不理想。虽然新的治疗方法如基因治疗、免疫治疗等也有应用，但都未获得突破性进展。目前的对症治疗手段都无法有效控制脑胶质瘤的发展，因此，寻找天然有效的化疗药物，延缓病程的进展，提高存活率，具有不可估量的临床应用价值和广阔的经济社会效益。

海兔素作为一种天然的海洋药物，它是一种海藻溴代倍半萜，它是从海洋三列凹顶藻中提取的脂溶性化合物，分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量小，仅为295。但是目前还没有关于海兔素在治疗胶质瘤方面的研究报道。

发明内容

本发明提供了海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，利用本发明所述海兔素，可以很好地起到抗肿瘤作用，而且其具有天然活性，毒副作用少，具有广泛的应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。

进一步的，所述海兔素的最佳作用浓度为80μg/ml。

进一步的，所述海兔素的最佳作用时间为48h。

进一步的，在20-80μg/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，细胞凋亡率明显增高。

进一步的，在20-80μg/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，处于G₀/G₁期细胞数增加。

进一步的，所述海兔素通过抑制Ras/Raf/ERK-MAPK通路，启动线粒体凋亡程序，促使C6细胞凋亡。

进一步的，在动物实验中，海兔素的最佳作用剂量为40mg/kg·bw。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明通过实验研究海兔素对胶质瘤的抗瘤活性，本发明中经MTT实验发现，随海兔素浓度的增加，对C6细胞的抑制率升高，但80μg/ml以上浓度虽增加，对细胞抑制率却没有明显的增高，说明海兔素最有效的抑瘤浓度为80μg/ml；从作用时间效果看，48h为最佳作用时间，时间再延长，细胞抑制率却没有明显提升。动物实验发现，随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间延长，胶质瘤重量减轻，CD8⁺T淋巴细胞浸润增多，但剂量大于40mg/kg·bw时变化不再明显，说明40mg/kg·bw为最佳作用剂量。本发明还通过实验具体从Ras-Raf-MAPK细胞传导通路、PI3K-AKT通路及动物实验研究海兔素对胶质瘤的抑制作用。

本发明中海兔素是从海洋三列凹顶藻中提取的脂溶性化合物，具有天然活性，毒副作用少，本发明通过实验证明海兔素可以起到良好的抗肿瘤作用，可以用作治疗胶质瘤的药物，而且海兔素属于天然海洋药物，具有良好的市场应用前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是流式细胞仪分析海兔素影响C6胶质瘤细胞周期实验结果，其中图1A为对照组，图1B为20μg/ml海兔素实验组，图1C为40μg/ml海兔素实验组，图1D为80μg/ml海兔素实验组。

图2是流式细胞仪检测C6胶质瘤细胞凋亡的实验结果，其中图2A为对照组，图2B为20μg/ml海兔素实验组，图2C为40μg/ml海兔素实验组，图2D为80μg/ml海兔素实验组。

图3是Western blot检测C6胶质瘤细胞信号传导通路中相关蛋白表达变化的实验结果，其中图3A为对照组，图3B为80μg/ml海兔素实验组。

图4是各组大鼠的生存曲线，图4A为20mg/kg·bw海兔素组大鼠生存曲线，图4B为40mg/kg·bw海兔素组大鼠生存曲线，图4C为80mg/kg·bw海兔素组大鼠生存曲线，control为对照组大鼠生存曲线。

图5是大鼠胶质瘤细胞HE染色。

图6是免疫组化显示各组大鼠胶质瘤CD8⁺T淋巴细胞浸润情况，其中图6A为对照组，图6B为20mg/kg·bw海兔素实验组，图6C为40mg/kg·bw海兔素实验组，图6D为80mg/kg·bw海兔素实验组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明所用实验材料如下：C6胶质瘤细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM培养基购自美国GIBCO BRL公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；EGFR、COX-2、Bcl-2、Bax、ERK、PI3K单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；小鼠抗大鼠CD₈Mcab(Serotec)。

一、海兔素的制备

本发明从三列凹顶藻中提取海兔素（也可以从含有海兔素的海洋藻类中提取），所述三列凹顶藻(Laurencia tristicha Tseng，Chang，E.Z.et.B.M.Xia)属红藻门(Rhodophyta)红藻纲(Rhodophyceae)，仙菜目(Ceramiales)，仙菜科(Cermiaceae)，凹顶藻属(Laurencia)。三列凹顶藻由中国科学院海洋研究所提供并鉴定。

海兔素制备方法：将常温风干的所述三列凹顶藻样品(5kg)，用体积分数为0.95的乙醇室温下浸泡3d，提取3次，提取液经减压浓缩(温度低于40℃)得到乙醇提取物325g；然后将所述乙醇提取物悬浮于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，有机相回收溶剂得到萃取物105g。取所述乙酸乙酯萃取物，干法上样，进行正相硅胶柱色谱分离，用石油醚丙酮梯度洗脱，薄层色谱检查，合并相同部分。洗脱液经过反复正相硅胶、生物胶Bio-beads、凝胶Sephadex LH-20柱色谱和反相HPLC分离纯化，得到一白色化合物，经IR、¹³C-NMR及¹H-NMR鉴定此化合物为溴代倍半萜海兔素单体(Aplysin)，分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量为295。

提取到的海兔素的特征如下：

海兔素：C₁₅H₁₉BrO；无色针晶(石油醚)，mp96～98℃；

IR v^KBr _max cm^-1：2952，2864，1577，1487，1460，1375，1308，1267，1234，1192，1007，904，881862；EI-MS m/z(%)：296[M(⁸¹Br)]⁺(100)，294[M(⁷⁹Br)]⁺(100)，281[M(⁸¹Br)-CH₃]⁺(95)，279[M(⁷⁹Br)-CH₃]⁺(95)，239(45)，237(45)，200[M—Br]⁺(35)，160(16)，115(12)，109(10)，69(5)；

¹H-NMR(CD₃COCD₃，500MHz)δ：1.06(3H，d，J=6.5Hz，H-9)，1.04～1.08(1H，m，H-2a)，1.27(3H，s，H-10)，1.33(3H，s，H-12)，1.60～1.68(2H，m，H-2b，1a)，1.81～1.86(2H，m，H-1b，3)，2.26(3H，s，H-11)，6.60(1H，s，H-5)，7.2(1H，s，H-8)；¹³C-NMR(CD₃COCD₃，125MHz)δ：43.0(C-1)，31.9(C-2)，46.6(C-3)，100.4(C-3a)，159.4(C-4a)，110.5(C-5)，137.5(C-6)，114.3(C-7)，127.3(C-8)，137.4(C-8a)，55.1(C-8b)，13.3(C-9)，23.1(C-10)，23.4(C-11)，20.1(C-12)。

上述数据与现有技术中文献报道的海兔素一致，因此确定提取到的化合物为海兔素aplysin。结构式如下：

二、海兔素对胶质瘤作用的实验方法及结果

2.1细胞培养

将大鼠C6胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(青霉素50I u／mL，链霉素50mg／mL)中，置37℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养至对数生长期。

2.2MTT法检测细胞增殖抑制试验

收集对数生长期的C6细胞，以1×10⁶/ml的密度加入96孔板内，5%CO₂、37℃恒温条件培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液。实验组加入不同浓度的海兔素（10、20、40、80、100、200μg/ml），对照组加入等体积含10%胎牛血清的DMEM培养液，每组均设6个重复孔，分别培养24、48、72h。每孔加入20μl MTT，4h后弃上清，每孔加入150μl DMSO，充分震荡后用酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度值，绘制细胞增殖曲线，计算细胞增殖抑制率(Inhibitory Rate,IR)。细胞增殖抑制率IR%=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。实验结果见表1所示。

表1不同浓度海兔素对C6胶质瘤细胞增殖的影响（OD值，）

从表1中可以看出：

1组：A-D组随海兔素浓度的增加，OD值不断减少，抑制率升高。总体比较差异显著，P＜0.05；而D-F组，随海兔素浓度的增加，OD值无显著变化，差异不显著，^aP＞0.05。因此，可将D组(80μg/ml)作为最佳浓度。

2组：A-D组随海兔素浓度的增加，OD值不断减少，抑制率升高。总体比较差异显著，P＜0.05。而D-F组，随海兔素浓度增加，OD值无显著变化，^bP＞0.05，因此，D组(80μg/ml)可作为最佳浓度。

3组：A-D组随海兔素浓度的增加，OD值不断减少，抑制率升高。总体比较差异显著，P＜0.05。而D-F组，随海兔素浓度增加，OD值无显著变化，^cP＞0.05。因此，D组(80μg/ml)可作为最佳浓度。

D组：1组、2组、3组随作用时间的延长，OD值不断减少，抑制率升高，组间比较差异显著，有统计学意义，P＜0.05。b、c间比较差异不显著，无统计学意义，P＞0.05。说明48h以后随时间延长，抑制率差异不显著，因此可将48h作为最佳作用时间。

本发明通过MTT发现随海兔素浓度的增加，对C6细胞的抑制率升高，但80μg/ml以上浓度虽增加，对细胞抑制率却没有明显的增高，说明海兔素最有效的抑瘤浓度为80μg/ml；从作用时间效果看，48h为最佳作用时间，时间再延长，细胞抑制率却没有明显提升。

2.3流式细胞仪分析细胞周期

取对数生长期的C6细胞，PBS悬浮成1×10⁶/ml，接种于6孔板中，用不同浓度海兔素（20、40、80μg/ml）共同培养48h，收集细胞，离心，弃上清，ＰＢＳ洗2次，加入70％乙醇1ｍＬ，-20℃过夜。检测前离心，弃上清，PBS洗2次，酶消化30min，加入PI染液（50mg／L），每管400μl，室温避光30min，流式细胞仪检测各细胞周期。

用不同浓度海兔素（20、40、80μg/ml）分别作用48h后C6细胞周期的变化的实验结果如图1A-图1D所示：与对照组细胞相比，处于G₀／G₁期的细胞显著增多，而处于S期、G2/M期的细胞则逐渐减少，B组与对照组间差异不显著，无统计学意义（P>0.05）；C、D组与对照组差异显著，具有统计学意义（P<0.05）。C组与D组间差异不显著，无统计学意义（P>0.05）。

诱导细胞凋亡是抗肿瘤药物的主要作用机制之一。本发明中流式细胞术结果证实海兔素可以有效诱导C6细胞的凋亡，随着海兔素浓度的增加，细胞凋亡率明显增高，处于G₀/G₁期细胞数增加，而处于S期和G₂/M期细胞减少，细胞受阻滞于G₀/G₁期，阻止其向ＤＮＡ复制加倍的Ｓ期及Ｍ期转化，从而造成胶质瘤细胞的生长缓慢和增殖活性降低。

2.4流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期的C6细胞，以1×10⁶/ml密度接种，用不同浓度海兔素（0、20、40、80μg/ml）共同培养48h，收集各组细胞数，磷酸缓冲液洗2次，弃上清，加1ml碘化丙啶（PI）避光30min，细网过滤，流式细胞仪上进行荧光检测，分析细胞凋亡情况。

用不同浓度海兔素（20、40、80μg/ml）分别作用48h后C6细胞凋亡的变化的实验结果如图2A-图2D所示：随海兔素浓度的增高，C6凋亡细胞比例增高，应用海兔素各组与对照组相比，差异均有统计学意义，P<0.05。与此同时死亡细胞也逐渐增多。说明海兔素能明显引起C6胶质瘤细胞的凋亡，随浓度增高，凋亡增多。

2.5Western blot检测C6中Ras、ERK、Bcl-2、Bax、EGFR、PI3K、AKT的蛋白表达变化

60μg/ml海兔素处理48h后，收集C6细胞，设空白对照组。加裂解缓冲液,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，4℃过夜；洗膜，加入一抗，4℃过夜。加二抗，室温1h。GAPDH作为内参对照，凝胶成像***观察照相。ECL检测，图像分析软件进行分析。

C6细胞经80μg/ml海兔素处理后的实验结果见图3A-图3B，从图中可以看出：(1)Ras、ERK、Bcl-2、EGFR、蛋白表达较对照组明显减少；

(2)Bax蛋白表达增多；

(3)PI3K、AKT变化不明显。

EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt通路。

Ras/Raf/ERK-MAPK通路调控细胞生长和分化，将胞外的生长和神经营养信号传到核内的蛋白激酶级联反应的重要组成部分。癌基因Bcl-2为ERK蛋白的下游底物。Bcl-2基因家族是目前广泛研究的一类细胞凋亡相关基因，其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白（如Bax和Bak）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）。Bcl-2家族成员中Bax/Bcl-2比值增加可以诱导线粒体释放细胞色素C，细胞色素C进入细胞质后与凋亡蛋白激活因子-1和Caspase-9的前体组合，形成凋亡小体，诱导细胞凋亡。本发明通过实验发现海兔素可引起Ras、ERK、Bcl-2、EGFR、蛋白表达较对照组明显减少，而促凋亡基因Bax蛋白表达增多，PI3K、AKT蛋白表达变化不明显。说明海兔素主要通过抑制Ras/Raf/ERK-MAPK通路，而非PI3K/Akt通路，从而下调Ras/Raf/ERK-MAPK通路的下游信号癌基因Bcl-2蛋白表达，使Bax/Bcl-2比值增加，启动线粒体凋亡程序，促使C6细胞凋亡。

2.6动物实验

将大鼠按体重随机分为4组，每组10只。A、B、C三组分别以20mg/kg·bw、40mg/kg·bw、80mg/kg·bw海兔素灌胃。D组为模型对照组，每日以等量生理盐水灌胃。绘制大鼠生存曲线。

(1)大鼠脑胶质瘤模型的制备：水合氯醛麻醉大鼠，切开头皮，暴露前囟，于右侧冠状缝上距中线4mm处注射C6胶质瘤细胞。于术后第7天磁共振筛选成功模型。

(2)样品采集：40d时处死存活大鼠，每只大鼠均完整剥离颅内肿瘤，并称重。计算抑瘤率：抑瘤率%=(对照组平均瘤重—实验组平均瘤重)／对照组平均瘤重×100%。

(3)病理学检查：所有荷瘤大鼠死后颅内肿瘤均进行病理学检查。行HE染色及免疫组化检测CD8+T淋巴细胞浸润情况。

动物实验结果见图4所示：

(1)大鼠生存曲线：

中位生存时间：对照组：(15±1.414)d，A组：为(19±1.621)d，B组为(21±1.491)d，C组为(21±3.162)d。

Log-rank检验（又叫对数秩检验）：4组生存曲线差异总体比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；A组与对照组相比差异不显著，无统计学意义（P＞0.05）。B组和C组分别与对照组相比较差异显著，均有统计学意义（P＜0.05）；B组与C组相比差异不显著，无统计学意义（P＞0.05）。说明随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间不断延长，海兔素有明显抗肿瘤作用，但剂量大于40mg/kg·bw时生存时间则不再明显延长，可见40mg/kg·bw为最佳剂量。

2）不同剂量组海兔素对颅内胶质瘤的抑瘤率

与对照组相比^b、cp<0.05与对照组相比^ap＞0.05

各组称重后A组与对照组瘤重差异不显著，无统计学意义（p＞0.05），B、C组与对照组差异显著，有统计学意义（p<0.05），B组与C组比较差异不显著，无统计学意义（p＞0.05）。说明随海兔素剂量的增加，大鼠胶质瘤重量不断减轻，海兔素有明显抑瘤作用，但剂量大于40mg/kg·bw时胶质瘤重量减轻不再明显，可见40mg/kg·bw为最佳剂量。

3）大鼠颅内胶质瘤HE染色，见图5，有不同数量的核***相，部分可见新生血管，瘤内坏死，说明胶质瘤模型成功建立。

大鼠颅内胶质瘤取出后，经HE染色，可见明显肿瘤组织。各组肿瘤称重后B组与C组肿瘤明显缩小，与对照组相比差异有统计学意义（p<0.05）。应用海兔素后，大鼠B组与C组生存时间明显延长（p<0.05），可见海兔素能明显延长荷瘤大鼠的生存时间，具有良好的抗肿瘤作用。

4）CD8⁺免疫组化染色

A组：未见CD8⁺T淋巴细胞浸润。B组：散在少量CD8⁺T淋巴细胞浸润C、D组见较多CD8⁺T淋巴细胞浸润，两者无明显差异。

细胞免疫是肿瘤免疫的重要组成部分，CD8⁺T淋巴细胞是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，可导致肿瘤细胞变性坏死或体积缩小。动物实验发现随着海兔素剂量的增加，CD8⁺T淋巴细胞浸润胶质瘤的数量增多，但当剂量大于40mg/kg·bw时，海兔素剂量增加，细胞浸润数量也不再明显增多，说明海兔素增强了机体细胞免疫杀伤肿瘤细胞功能，最佳剂量为40mg/kg·bw，剂量再增加，细胞免疫不再增强。

本发明通过动物实验发现，随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间延长，胶质瘤重量减轻，CD8⁺T淋巴细胞浸润增多，但剂量大于40mg/kg·bw时变化不再明显，说明40mg/kg·bw为最佳作用剂量。

2.7统计学分析方法:采用SPSS19.0医学统计学软件处理和分析。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，生存分析采用Kaplan-Meier方法，生存率比较采用Log-rank检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

综上，胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，目前的治疗方法仍以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等。虽然新的治疗方法如基因治疗、免疫治疗等也有应用，但都未获得突破性进展。目前的对症治疗手段都无法有效控制脑胶质瘤的发展，因此，寻找天然有效的化疗药物，延缓病程的进展具有不可估量的临床应用价值和广阔的经济社会效益。

海兔素是从海洋三列凹顶藻中提取的脂溶性化合物，具有天然活性，毒副作用少，前期试验已经证明对多种肿瘤具有良好的抗瘤作用。本发明研究海兔素对胶质瘤的抗瘤活性，本发明中MTT发现，随海兔素浓度的增加，对C6细胞的抑制率升高，但80μg/ml以上浓度虽增加，对细胞抑制率却没有明显的增高，说明海兔素最有效的抑瘤浓度为80μg/ml；从作用时间效果看，48h为最佳作用时间，时间再延长，细胞抑制率却没有明显提升。动物实验发现，随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间延长，胶质瘤重量减轻，CD8⁺T淋巴细胞浸润增多，但剂量大于40mg/kg·bw时变化不再明显，说明40mg/kg·bw为最佳作用剂量。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于：所述海兔素的作用浓度为80 μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于：所述海兔素的作用时间为48h。

4.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于：在20-80 μg/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，细胞凋亡率明显增高。

5.根据权利要求1或4所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于：在20-80 μg/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，处于G0/G1期细胞数增加。

6.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于：所述海兔素通过抑制Ras/ Raf/ERK-MAPK通路，启动线粒体凋亡程序，促使C6细胞凋亡。

7.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于：在动物实验中，海兔素的作用剂量为40 mg/kg·bw。