CN105012288B - 一种组合物及其治疗肝癌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种组合物，包括维生素A或其前药，和海兔素；所述两个组分摩尔比为：维生素A或其前药：海兔素＝1:0.1～3；所述维生素A或其前药优选为β‑胡萝卜素。本发明还提供所述组合物以及包括维生素A或其前药，和海兔素的组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明所述的组合物通过活性组分之间的协同作用，能够有效抑制肝癌细胞的增殖。

Description

一种组合物及其治疗肝癌的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种包括海兔素和维生素A或其前药的组合物及其在治疗肝癌方面的医药用途。

背景技术

肝细胞癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，具有发病隐匿，转移率高，预后较差等特点。手术虽然是治疗肝癌的首选、也是最有效的方法，但是对于无法手术的患者，化疗是治疗的主要方法之一。有些患者因为化疗还可以获得手术的机会，延长了生命，提高了生活质量。但是，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对机体正常细胞造成严重损害。因此寻找一种高效、低毒的抗癌药物成为近年来人们关注的焦点。

海兔素是从三列凹顶藻提取物中分离纯化得到的一种溴代倍半萜脂溶性化合物，分子量为295，结构式如1所示。研究发现，海兔素具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性，对乳腺癌、胃癌和S180肉瘤均具有抑制作用(1.海兔素对人乳腺癌SK-BR-3细胞的抑制作用及机制研究[J]；马文龙，梁惠，等；天然产物研究与开发，2012，24(9)：120l-1205。2.海兔素对人胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响[J]；刘颖，梁惠，等；中国药理学通报，2010，26(3)：333-337。3.海兔素对S180荷瘤小鼠的抑瘤活性及其免疫作用的实验观察[J]；刘颖，梁惠，等；中国药理学通报，2006，22(11)：1403-1405。)

β-胡萝卜素(β-Carotene)是类胡萝卜素之一，分子量为537，结构式如2所示，具有抗氧化、保护视力、促进骨骼生长发育等作用。β-胡萝卜素是维生素A的前药；但是只有当有需要时，人体才会将β-胡萝卜素转换成维他命A。这一个特征使β-胡萝卜素成为维生素A的一个安全来源，不会有因过量摄食而造成维生素A累积中毒现象。

迄今还未见有海兔素和β-胡萝卜素对肝癌具有协同作用的研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种包括海兔素和维生素A或其前药，尤其是海兔素和β-胡萝卜素的组合物。该组合物中的两种活性组分协同发挥作用，具有显著的抗肝癌活性，有望开发出抗肝癌的新药，为医生和患者提供一种新的治疗选择。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种组合物，包括维生素A或其前药，和海兔素；所述两个组分摩尔比为：

维生素A或其前药：海兔素＝1:0.1～3。

优选的，所述组合物中，两个组分摩尔比为：

维生素A或其前药：海兔素＝1:0.15～2.6。

更优选的，所述组合物中，两个组分摩尔比为：

维生素A或其前药：海兔素＝1:0.2～2。

上述组合物中，所述维生素A或其前药优选为β-胡萝卜素。

本发明的另一目的在于上述组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明还提供一种包括维生素A或其前药，和海兔素的组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

所述维生素A或其前药优选为β-胡萝卜素。

上述应用中，所述肝癌是指原发性肝癌或继发性肝癌。

本发明还有一个目的在于提供一种治疗肝癌的药物，包括上述的组合物。

优选的，所述药物还可以包括药学上可以接受的辅料。

优选的，所述药物为口服制剂，选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂和口服液中的一种。

本发明还有一个目的在于提供上述治疗肝癌的药物的制备方法，包括将所述组合物和药学上可以接受的辅料混合，按照本领域常规的方法制备成临床上可以接受的制剂。

本发明所述药学上可以接受的辅料，包括(1)稀释剂，例如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等；(2)粘合剂，例如蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等；(3)崩解剂，例如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等；(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等。(5)矫味剂，如蔗糖、甜菊素等。

在用于治疗肝癌时，本发明所述的组合物的施用对象为人或哺乳动物。出于此目的，本发明所述组合物的摄入的质量或给予的质量，根据组合物中所述组分的纯度、服用对象的年龄、体重等不同而不同。作为治疗肝癌用，按照成人体重70kg计算，通常每人每天摄入150-200mg，更优选的每人每天摄入160-180mg。

β-胡萝卜素是维生素A的前药，其生理活性与维生素A基本一致。因此，本发明关于所述组合物的活性研究，都以β-胡萝卜素为所述“维生素A或其前药”的代表。

研究发现，β-胡萝卜素和海兔素联合应用时，无论时体外还是体内，都表现出了协同的抑制肝癌细胞增殖的作用。

在体外通过CCK-8法检测β-胡萝卜素和海兔素对人肝癌HepG2细胞株增殖活性的影响时，β-胡萝卜素或海兔素单独作用HepG2细胞24h的IC₅₀值分别为(86.50±6.98)μmol/L和(100.05±8.24)mg/L。海兔素合用β-胡萝卜素20、40、60μmol/L时，IC₅₀分别为A(80.97±7.25)mg/L、B(21.46±1.88)mg/L和C(18.91±1.42)mg/L。随着β-胡萝卜素剂量的增加，海兔素IC₅₀逐渐降低。在图1所示的β-胡萝卜素和海兔素体外作用关系图中，A点的95％可信区间与相加线相交，表明两药产生相加作用，而B点和C点，95％可信区间与相加线未重叠且在左侧，表明两药产生协同效应，且B点(40μmol/L β-胡萝卜素与21.5mg/L海兔素联用)协同效应最强。说明本发明的组合物具有体外抑制肝癌细胞增殖的协同作用。

本发明的β-胡萝卜素与海兔素的组合物还表现出良好的体内抗肿瘤协同作用。β-胡萝卜素或海兔素单独作用于荷瘤鼠(肝癌瘤株H₂₂)，IC₅₀值分别为(312.2±38.3)mg/kg和(146.5±16.7)mg/kg。海兔素合用β-胡萝卜素100、150、200mg/kg时，IC₅₀分别为A(108.1±12.0)mg/kg、B(35.0±3.6)mg/kg和C(28.7±1.8)mg/kg。随着β-胡萝卜素剂量的增加，海兔素IC₅₀逐渐降低。在图2所示的β-胡萝卜素和海兔素体内作用关系图中，联合用药组三点，A点的95％可信区间与相加线相交，表明两药产生相加作用，而B点和C点，95％可信区间与相加线未重叠且在左侧，表明两药产生协同效应，且B点(150mg/kg β-胡萝卜素与35.0mg/kg海兔素联用)协同效应最强。说明本发明的组合物具有显著的体内抗肝癌的协同作用。

上述体内外试验都证明，海兔素和以β-胡萝卜素为代表的维生素A或其前药具有明确的抗肝癌作用，而且相互之间有协同作用，可以以比较小的剂量发挥显著的抗肿瘤作用。初步的机理研究也表明，本发明的组合物可以明显下调肿瘤组织中MMP-9，VEGF和PCNA的表达，显著升高荷瘤小鼠血清中IL-6和TNF-α水平，提示β-胡萝卜素与海兔素可能通过抑制新生血管生成及转移，以及可促进免疫炎性因子的分泌，增强机体免疫功能，从而发挥协同的抗肝癌作用。因此，本发明所述组合物有望开发成一种有效、低毒的抗肝癌药物，从而使患者受益。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示的是试验例1中的β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图，其中的实斜线为两者作用相加线，虚线之间的部分为A点的95％可信区间。A点为β-胡萝卜素20μmol/L时，海兔素的ED₅₀；B点为β-胡萝卜素40μmol/L时，海兔素的ED₅₀；C点为β-胡萝卜素60μmol/L时，海兔素的ED₅₀。

图2显示的是试验例2中各处理组对HepG2细胞凋亡的影响，其中，

A：对照组；B：21.5mg/L海兔素；C：40μmol/L β-胡萝卜素；D：40μmol/L β-胡萝卜素与21.5mg/L海兔素联用。

图3显示的是试验例3中的β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图，其中的实斜线为两者作用相加线，虚线之间的部分为A点的95％可信区间。A点为β-胡萝卜素100mg/kg时，海兔素的ED₅₀；B点为β-胡萝卜素150mg/kg时，海兔素的ED₅₀；C点为β-胡萝卜素200mg/kg时，海兔素的ED₅₀。

图4的照片是光学显微镜放大200倍的经染色的肿瘤组织切片，显示的是试验例4中药物对小鼠H₂₂肿瘤组织中MMP-9表达的影响，其中，

A：模型组；B：150mg/kg β-胡萝卜素干预组；C：35.0mg/kg海兔素干预组；D：150mg/kg β-胡萝卜素与35.0mg/kg海兔素联合干预组。

图5的照片是光学显微镜放大200倍的经染色的肿瘤组织切片，显示的是试验例4中药物对小鼠H₂₂肿瘤组织中VEGF表达的影响，其中，

A：模型组；B：150mg/kg β-胡萝卜素干预组；C：35.0mg/kg海兔素干预组；D：150mg/kg β-胡萝卜素与35.0mg/kg海兔素联合干预组。

图6的照片是光学显微镜放大200倍的经染色的肿瘤组织切片，显示的是试验例4中药物对小鼠H₂₂肿瘤组织中PCNA表达的影响，其中，

A：模型组；B：150mg/kg β-胡萝卜素干预组；C：35.0mg/kg海兔素干预组；D：150mg/kg β-胡萝卜素与35.0mg/kg海兔素联合干预组。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

其中，海兔素由青岛大学医学院医学营养研究所从三列凹顶藻中提取纯化，由中国科学院海洋研究所鉴定，其分子式为C₁₅H₁₉OBr，分子量为295。

实施例1一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:3

实施例2一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:2.6

实施例3一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:2

实施例4一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:1.69

实施例5一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:0.43

实施例6一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:0.15

实施例7一种组合物

原料(摩尔比)：

β-胡萝卜素：海兔素＝1:0.1

实施例8一种片剂

取实施例4所述的组合物与适量淀粉混合均匀，压片，即得。

实施例9一种胶囊剂

取实施例7所述的组合物与适量淀粉混合均匀，湿法造粒，整粒，装胶囊，即得

试验例1CCK-8法检测β-胡萝卜素和海兔素体外对肝癌细胞株增殖活性的影响

1.实验方法

1.1细胞培养

人肝癌HepG2细胞用DMEM高糖全培养基(含10％的胎牛血清)于37℃，5％CO₂培养箱中培养，隔天换液一次，三天传代一次，收集对数生长期细胞进行实验。β-胡萝卜素与海兔素均以二甲亚砜(DMSO)助溶，使用时用DMEM高糖全培养液稀释至终浓度，所有处理组DMSO终浓度均为0.1％(实验证实该浓度对细胞无明显损害)。

1.2IC₅₀的测定

将对数生长期的肝癌HepG2细胞，按5×10³/孔接种于96孔板中，培养24h后，分为以下几个实验组：

A组：加入终浓度分别为20、40、60、80、100、120μmol/L的β-胡萝卜素培养液；

B组：加入终浓度分别为20、40、60、80、100、120mg/L的海兔素培养液；

C组：加入终浓度为20μmol/L的β-胡萝卜素及终浓度分别为70、80、90mg/L的海兔素培养液；

D组：加入终浓度为40μmol/L的β-胡萝卜素及终浓度分别为10、20、30mg/L的海兔素培养液；

E组：加入终浓度为60μmol/L的β-胡萝卜素及终浓度分别为5、10、20mg/L的海兔素培养液；

F组：对照组，加入含等体积PBS和0.1％DMSO的培养液。

每组设6个复孔。加入药液后继续培养24h，吸弃上清，每孔加入100μl新鲜培养液及10μl CCK-8溶液，继续培养2h，于酶标仪450nm处测定各孔OD值，OD值的大小与细胞活性呈正相关。计算IC₅₀。实验重复三次。

2.相关标准

2.1抑瘤效应有效标准的确立

实验组与对照组比较，肿瘤细胞抑制率﹥50％，作为药物抗肿瘤效应有效的标准。

2.2β-胡萝卜素与海兔素联合应用抗肿瘤效应判定标准

计算单用β-胡萝卜素或海兔素的肿瘤细胞50％抑制率(IC₅₀)。以β-胡萝卜素的IC₅₀值为横坐标，海兔素的IC₅₀值为纵坐标，绘制β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图：将计算出的β-胡萝卜素单用的IC₅₀标在X轴上，海兔素单用的IC₅₀标在Y轴上，两点相连即为作用相加线。将不同剂量的β-胡萝卜素与海兔素联合应用的IC₅₀标在坐标轴上，同时标上其95％可信区间，如IC₅₀落在相加线左侧，则两药为协同效应，如落在相加线右侧则两药为拮抗作用，如落在相加线上，则为相加作用。

3.结果与讨论

3.1药物对HepG2细胞增殖的影响及β-胡萝卜素与海兔素抗肿瘤效应的相互作用

CCK-8结果显示，以不同剂量β-胡萝卜素或海兔素单独作用于HepG2细胞24h后，与对照组比较，各组肿瘤细胞生长增殖均受到明显抑制，且呈剂量依赖性(P<0.05)。β-胡萝卜素或海兔素作用HepG2细胞24h的IC₅₀值分别为(86.50±6.98)μmol/L和(100.05±8.24)mg/L。海兔素合用β-胡萝卜素20、40、60μmol/L时，IC₅₀分别为A(80.97±7.25)mg/L、B(21.46±1.88)mg/L和C(18.91±1.42)mg/L。随着β-胡萝卜素剂量的增加，海兔素IC₅₀逐渐降低。具体结果见表1。

在图2所示的β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图中，联合用药组三点，A点的95％可信区间与相加线相交，表明两药产生相加作用，而B点和C点，95％可信区间与相加线未重叠且在左侧，表明两药产生协同效应，且B点(40μmol/L β-胡萝卜素与21.5mg/L海兔素联用)协同效应最强。

表1 β-胡萝卜素和海兔素对HepG2细胞增殖的影响

*：与对照组比较，P<0.05。

试验例2β-胡萝卜素与海兔素协同对HepG2细胞凋亡的影响

1.实验方法

1.1细胞培养

同试验例1的1.1项下的“细胞培养”。

1.2药物对HepG2细胞凋亡的影响

指数生长期的肝癌HepG2细胞分别经1)对照组(含等体积PBS和0.1％DMSO的培养液)、2)40μmol/L β-胡萝卜素、3)21.5mg/L海兔素、4)40μmol/L β-胡萝卜素与21.5mg/L海兔素联用，处理24h后，分别采用胰酶消化、收集细胞，PBS洗涤细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml。分别吸取各处理组的100μl细胞悬液于流式细胞仪专用分析试管中，加入5μl FITCAnnexin V和5μl PI溶液，轻轻吹打均匀，置于室温避光孵育15min。加入400μl 1×缓冲液，通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况。以正常未染色细胞对仪器进行调试，分别以FITCAnnextin V和PI单染细胞进行荧光补偿调节和正常与凋亡细胞象限的界定，数据经WinMDI2.9软件分析，总凋亡细胞百分数等于中晚期凋亡细胞(FITC Annexin V⁺/PI⁺)与早期凋亡细胞(FITC Annexin V⁺/PI^－)百分数之和。实验重复三次。

2.结果与讨论

图2示出了各处理组的对HepG2细胞凋亡的影响。

结果显示，HepG2细胞经40μmol/L β-胡萝卜素、21.5mg/L海兔素及40μmol/L β-胡萝卜素与21.5mg/L海兔素联用处理24h后，40μmol/L β-胡萝卜素和21.5mg/L海兔素组HepG2细胞凋亡率分别为(13.8±1.6)％和(3.0±0.1)％，而40μmol/L β-胡萝卜素与21.5mg/kg海兔素联用组，HepG2细胞凋亡率为(58.2±1.6)％，明显高于对照组凋亡率(0±0.2)％及单用40μmol/L β-胡萝卜素或21.5mg/kg海兔素组，经统计学处理，有显著性差异(P<0.05)。

试验例3β-胡萝卜素和海兔素对H₂₂移植瘤小鼠的作用

1.实验方法

1.1H₂₂瘤细胞悬液制备

脱颈处死H₂₂腹水型肝癌种鼠，抽取腹水，调整细胞悬液密度为2×10⁶/mL，台盼蓝检查活细胞率>95％时用于实验。

1.2动物分组及处理

昆明小鼠适应性喂养1周后，将H₂₂瘤细胞悬液接种于小鼠左前肢腋窝皮下，剂量为0.2mL，整个操作要求半小时内完成。24h后，将所有小鼠按体重随机分为6大组，分别为：

1)模型组：下设1个小组，大豆油灌胃；

2)β-胡萝卜素干预组：下设3个小组，分别以200、300、400mg·kg^-1·d^-1β-胡萝卜素灌胃；

3)海兔素干预组：下设3个小组，分别以50、100、150mg·kg^-1·d^-1海兔素灌胃；

4)药物联合应用干预1组：下设3个小组，分别以β-胡萝卜素100mg·kg^-1·d^-1+海兔素90、110、130mg·kg^-1·d^-1灌胃；

5)药物联合应用干预2组：下设3个小组，分别以β-胡萝卜素150mg·kg^-1·d^-1+海兔素20、40、60mg·kg^-1·d^-1灌胃；

6)药物联合应用干预3组：下设3个小组，分别以β-胡萝卜素200mg/kg·bw+海兔素10、20、30mg·kg^-1·d^-1灌胃。

每小组10只动物，各组小鼠均从移植瘤24h开始持续灌胃14天，末次灌胃后，禁食不禁水24h，称体质量。采用颈椎脱臼法处死小鼠，并于无菌条件下进行解剖，完整剥离肿瘤组织，准确称重。

2.肿瘤模型成立及药物抗肿瘤效应有效标准

将模型组小鼠左前肢腋窝皮下有肿瘤组织生长作为肿瘤模型成立标准。药物组与模型组比较，抑瘤率﹥50％(IC₅₀)，作为药物抗肿瘤效应有效的标准。

3.β-胡萝卜素与海兔素联合应用抗肿瘤效应判定标准

计算单用β-胡萝卜素或海兔素的肿瘤细胞50％抑制率(IC₅₀)。以β-胡萝卜素的IC₅₀值为横坐标，海兔素的IC₅₀值为纵坐标，绘制β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图：将β-胡萝卜素单用的IC₅₀标在X轴上，海兔素单用的IC₅₀标在Y轴上，两点相连即为作用相加线。将不同剂量的β-胡萝卜素与海兔素联合应用的IC₅₀标在坐标轴上，同时标上其95％可信区间，如IC₅₀落在相加线左侧，则两药为协同效应，如落在相加线右侧则两药为拮抗作用，如落在相加线上，则为相加作用。

4.结果与讨论

4.1药物对H₂₂肝癌移植瘤抑制作用及β-胡萝卜素与海兔素抗肿瘤效应相互作用

模型组荷瘤鼠瘤块质量增长明显，而各药物干预组小鼠肿瘤增长均受到抑制，且随着用药剂量的增加，肿瘤质量逐渐减轻，呈剂量效应关系，与模型组比较，差异均具有显著性(P<0.05)。β-胡萝卜素或海兔素单独作用于荷瘤鼠，IC₅₀值分别为(312.2±38.3)mg/kg和(146.5±16.7)mg/kg。海兔素合用β-胡萝卜素100、150、200mg/kg时，IC₅₀分别为A(108.1±12.0)mg/kg、B(35.0±3.6)mg/kg和C(28.7±1.8)mg/kg。随着β-胡萝卜素剂量的增加，海兔素IC₅₀逐渐降低。具体数据见表2。

表2 不同剂量β-胡萝卜素和海兔素对H₂₂肿瘤的抑瘤作用(n＝10)

*：与模型组比较，P<0.05。

在图3所示的β-胡萝卜素和海兔素相互作用关系图中，联合用药组三点，A点的95％可信区间与相加线相交，表明两药产生相加作用，而B点和C点，95％可信区间与相加线未重叠且在左侧，表明两药产生协同效应，且B点(150mg/kg β-胡萝卜素与35.0mg/kg海兔素联用)协同效应最强。

试验例4β-胡萝卜素与海兔素协同对H₂₂移植瘤小鼠的影响

1.实验方法

1.1H₂₂瘤细胞悬液制备

按照试验例3的“1.1”项下所述方法进行H₂₂瘤细胞悬液制备。

1.2动物分组及处理

昆明小鼠适应性喂养1周后，将H₂₂瘤细胞悬液接种于小鼠左前肢腋窝皮下，剂量为0.2mL，整个操作要求半小时内完成。24h后，将所有小鼠按体重随机分为4组，分别为：

1)模型组：大豆油灌胃，持续14天；

2)β-胡萝卜素干预组：β-胡萝卜素150mg/kg，灌胃；

3)海兔素干预组：海兔素35.0mg/kg，灌胃；

4)协同干预组：β-胡萝卜素150mg/kg和海兔素35.0mg/kg，灌胃。

每组10只动物，各组小鼠均持续灌胃14天，末次灌胃后，禁食不禁水24h，称体质量，从眼球采取小鼠全血，分离血清用于细胞因子检测。采用颈椎脱臼法处死小鼠，并于无菌条件下进行解剖，完整剥离肿瘤组织，准确称重。采用10％中性甲醛缓冲液固定肿瘤组织块，用于组织切片。

1.3免疫组化法检测肿瘤组织中MMP-9、VEGF和PCNA表达

将肿瘤组织于10％中性甲醛中固定、脱水；二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为4nm。切片分别经二甲苯脱蜡，乙醇梯度漂洗后，以蒸馏水洗涤2次，每次5min。于3％过氧化氢溶液浸泡10min后，蒸馏水洗涤3次，每次2min。将切片置于EDTA抗原修复液(0.01M，PH＝8.0)中，微波加热至95℃，持续20min后，冷却至室温。0.01M PBS洗涤3次，每次2min。于切片上分别滴加相应的一抗，置于37℃恒温箱中孵育70min，然后用含有0.05％Tween-20的PBS清洗3次，每次2min。滴加PV6000二抗，于37℃孵育20min后，用含0.05％Tween-20的PBS清洗3次，每次2min。用新鲜配制的DAB溶液显色5min，镜下观察显色结果。蒸馏水冲洗后，用苏木素复染，然后将复染后的切片经乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。每组随机选取5张切片，每张切片随机选取10个视野，光学显微镜(×400)下观察。阳性判断标准：MMP-9和VEGF以细胞质染色呈棕黄色为阳性细胞；而PCNA则以细胞核内出现棕黄色颗粒状染色为阳性判定标准。

1.4ELISA实验检测荷瘤小鼠血清中IL-6和TNF-α浓度

分离小鼠血清，置-80℃保存备用。试剂盒于2-8℃保存，使用前室温下平衡20min。分别设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔加入不同浓度的标准品，样本孔先后加入待测样本和样本稀释液，空白孔不加。除空白孔外，其余各孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体100μl，37℃恒温水浴锅温育60min。吸弃液体，向各孔加满洗涤液，室温静置1min，弃洗涤液，吸水纸上拍干，如此反复洗板5次。每孔加入底物A、B，37℃避光孵育15min。各孔加入终止液终止反应，15min内在450nm波长处测定各孔吸光度(OD值)，计算各样本浓度。

2.结果与讨论

2.1β-胡萝卜素与海兔素协同对小鼠H₂₂肿瘤组织中MMP-9、VEGF和PCNA表达的影响

从图4-图6示出的染色后肿瘤组织切片的显微照片可以看出，与模型组、β-胡萝卜素干预组组及海兔素干预组组比较，β-胡萝卜素与海兔素协同干预组，肿瘤组织中MMP-9，VEGF和PCNA的表达均明显减少。提示β-胡萝卜素与海兔素协同作用，可能通过抑制新生血管生成及转移，从而抑制肿瘤组织生长。

2.2β-胡萝卜素与海兔素协同对H₂₂荷瘤小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影响

结果见表3。与模型组、β-胡萝卜素干预组及海兔素干预组比较，β-胡萝卜素与海兔素协同干预组，荷瘤小鼠血清中IL-6和TNF-α水平均显著升高，提示β-胡萝卜素与海兔素协同作用，可能通过促进免疫炎性因子的分泌，增强机体免疫功能，从而发挥抗肿瘤作用。

表3药物对H₂₂小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影响(n＝10)

^*：与模型组比较，P＜0.05；^#：与β-胡萝卜素干预组比较，P＜0.05；^▲：与海兔干预素组比较，P＜0.05。

上述体内和体外试验证明，本发明提供的包括β-胡萝卜素和海兔素的组合物具有明确的抑制肝癌细胞增殖的活性；而且两者之间存在协同作用，相较单独应用时，两个活性组分可以在较小的剂量即产生显著的抗肿瘤活性。β-胡萝卜素是安全的食用色素和维生素A的来源，海兔素的毒性也较低。它们构成的组合物是一种肝癌细胞增殖抑制剂。上述研究结果还提示可以以本发明所述的组合物为活性成分开发出安全、低毒、有效的抗肝癌药物。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种治疗肝癌的组合物，由β-胡萝卜素和海兔素组成；所述两个组分摩尔比为：

β-胡萝卜素：海兔素=1:0.1~3。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，两个组分摩尔比为：

β-胡萝卜素：海兔素=1:0.15~2.6。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，两个组分摩尔比为：

β-胡萝卜素：海兔素=1:0.2~2。

4.权利要求1至3中任一项所述组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝癌是指原发性肝癌或继发性肝癌。

6.一种治疗肝癌的药物，包括权利要求1至3中任一项所述的组合物。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还可以包括药学上可以接受的辅料。

8.根据权利要求6或7所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂，选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂和口服液中的一种。

9.权利要求6至8中任一项所述的治疗肝癌的药物的制备方法，包括将权利要求1至3中任一项所述的组合物和药学上可以接受的辅料混合，按照本领域常规的方法制备成临床上可以接受的制剂。