CN111624333A - 一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，所述方法包括如下步骤：将链霉亲和素磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到多组生物素溶液中进行亲和吸附，形成一种较稳定的络合物，用清洗液清洗多组络合产物；加入生物素标记的辣根过氧化物(Biotin‑HRP)吸附；在标记后的产物中加入显色液进行显色反应；测定显色反应后溶液的OD(optical density，光密度)值；根据获取的多组OD值计算得到该种链霉亲和素磁性纳米微球结合游离生物素载量检测的方法，能够更为准确、快捷的检测出链霉亲和素结合游离生物素的载量，为下游链霉亲和素磁性纳米微球的使用量提供依据，该方法操作简便、成本低、灵敏性高。
Description
技术领域
本发明涉及纳米微球检测及分子生物学应用技术领域，具体涉及一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法。
背景技术：
生物素又称为维生素H,是水溶性维生素，属于B族维生素，是含硫的一种维生素，也是生物体内羧基转化酶作用的一种辅酶，故又称为辅酶R。
链霉亲和素磁性纳米微球由超顺磁性微球与高纯度链霉亲和素共价结合而成。链霉亲和素-生物素(SA-Biotin)***具有极高的结合亲和力(Kd＝10^-15)，在生物领域具有广泛的应用。链霉亲和素磁性纳米微球可简便快捷、有效地与许多生物素化复合物结合，如：小分子，肽类，蛋白，抗体，糖类，凝集素，寡合核苷酸，DNA/RNA等。
链霉亲和素磁性纳米微球的应用越来越广，通常有几种指标可反映微球的载量，如游离生物素载量、生物素化抗体载量、生物素化核酸载量，由于抗体或核酸分子量较大，测试它们的载量时，存在较大空间位阻，导致有一部分链霉亲和素的结合位点不能够被充分占据，所以反映出来的微球载量并不充分。游离生物素由于分子量小，能够充分的与链霉亲和素上的结合位点亲和作用，所以游离生物素载量能够最直观反映链霉亲和素磁性纳米微球的结合能力。
那么如何测定其结合游离生物素的载量就需要一种简便高效灵敏的方法来确定，市场上现能查阅检测链霉亲和素磁性纳米微球结合生物素载量的方法很少，未有具体的检测方法公开。有外国厂商通过生物素标记的荧光分子来测定游离生物素载量指标，通过荧光计来测定微球对生物素化荧光分子的吸附量，但是该方法中的生物素化的荧光分子和检测设备价格均较高。本发明提供了一种简单易行、成本更低，试剂及设备价格也相对较低的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，以解决现有技术中链霉亲和素磁性纳米微球结合生物素载量的检测方法复杂、检测数据准确度低的缺陷。
一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，所述方法包括如下步骤：
将磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到多组生物素溶液中进行络合，得到多组混合液；
对多组混合液分别清洗并进行标记反应；
在标记后的产物中加入显色液进行显色反应；
测定显色反应后溶液的OD值；
根据获取的多组OD值计算得到生物素结合载量。
进一步的，对磁性纳米微球溶液进行预处理的方法包括如下步骤：
对磁性纳米微球溶液进行磁性分离，去除上清；
通过PBST(磷酸盐吐温缓冲液)对磁性纳米微球进行重悬，进行至少两次磁性分离后去除上清。
进一步的，将磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到多组生物素溶液中进行络合的方法包括如下步骤：
根据生物素的含量分成多组不同浓度的生物素溶液，
在生物素溶液中加入磁性纳米微球溶液得到多组混合液；
将混合液进行恒温震荡络合，震荡时间为30-70min，温度设定为20-40℃，震荡时的转速为800-1200r/min。
进一步的，所述生物素溶液包括D-Biotin(D-生物素)工作液。
进一步的，对多组混合液分别清洗并进行标记反应的方法包括如下步骤：
在混合液中加入PBST，并进行恒温震荡；
震荡后进行磁吸分离并去除上清；
加入标记液，恒温震荡进行标记反应。
进一步的，所述标记液包括Biotin-HRP以及Biotin-AP(生物素标记的碱性磷酸酶)中的一种或多种。
进一步的，在标记后的产物中加入显色液进行显色反应的方法包括如下步骤：
在产物中分别加入PBST洗涤，并进行恒温震荡，磁吸分离后去除上清；
加入显色液混合均匀后进行避光显色；
显色后再次加入显色液终止反应。
进一步的，所述显色液包括TMB显色液、OPD、ABTS、p-NPP、中的一种或多种。
进一步的，所述OD值的测定方法包括如下步骤：
当使用TMB显色时，通过酶标仪测量OD450的值；
当使用OPD显色时，通过酶标仪测量OD492的值；
当使用ABTS显色时，通过酶标仪测量OD405的值；
当使用p-NPP显色时，通过酶标仪测量OD405的值。
进一步的，根据获取的多组OD值计算得到生物素结合载量的方法包括如下步骤：
根据生物素的含量值以及OD值绘制散点折线图；
结合散点折线图计算得到生物素结合容量饱和点的OD值；
根据OD值计算得到链霉亲和素磁性微球的生物素载量。
本发明的优点在于：该种链霉亲和素磁性纳米微球结合游离生物素载量检测的方法，限定了具体的检测条件等参数，能够更为准确、快捷的检测出链霉亲和素结合游离生物素的载量，为下游链霉亲和素磁性纳米微球的使用量提供依据，该方法操作简便灵敏性高且成本相对低廉。
附图说明
图1为本发明中方法流程示意图。
图2为本发明方法中的络合示意图。
图3为本发明实施例1中散点折线曲线的示意图。
图4为本发明实施例2中散点折线曲线的示意图。
图5为本发明实施例3中散点折线曲线的示意图。
图6为本发明实施例4中散点折线曲线的示意图。
图7为本发明实施例5中散点折线曲线的示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
准备检测所需的试剂：
(1)1×PBS
称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4 1.44g加入到1L的蓝口瓶中，用量筒量取950mL超纯水到上述蓝口瓶中，待固体粉末完全溶解后(可以超声溶解)滴加1M的NaOH调pH至7.4，将蓝口瓶中的液体转移到1L量筒中，定容到1L，抽滤后转移到1L蓝口瓶中备用；
(2)1×PBST
往上述装有1×PBS的蓝口瓶中加入2mL的Tween-20，充分混匀，置于4℃冰箱保存；
(3)0.448mg/mL(2mM)D-Biotin溶液
取4.48mg D-Biotin至15mL EP管中，加入10mL DMSO，震荡溶解备用；
(4)100ng/100μL D-Biotin溶液
取10μL 0.448mg/mL的D-Biotin溶液，加入4.470mL 1×PBST中，混匀备用；
(5)1％BSA溶液
取0.15g BSA于15mL离心管中，用15mL 1×PBST溶解。混合均匀备用；
(6)生物素化的酶溶液
6.1、Biotin-HRP溶液：取1μL的Biotin-HRP到15mL离心管中，加入10mL的1％的BSA即稀释10000倍，混匀备用；
6.2、Biotin-AP溶液：取1μL的Biotin-AP到15mL离心管中，加入10mL的1％的BSA即稀释10000倍，混匀备用。
(7)显色液
TMB显色液：商业化单组份TMB显色液
OPD显色液：取0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100ml)6.1ml，0.2mol/L Na2HPO4.12H2O(7.163g/100ml)6.4ml，加入12.5ml蒸馏水，将10mg OPD溶于其中，待溶解后，临用前加30％H2O2 40μL。
ABTS显色液：商业化ABTS单组份显色液
p-NPP显色液：商业化p-NPP显色液
(8)反应终止液
TMB反应终止液：取5.45mL 98％硫酸溶液，逐滴加入到装有35mL超纯水的烧杯中，缓慢滴加浓硫酸(由于浓硫酸遇水释放大量的热量，请务必缓慢滴加)，边滴加边搅拌，滴加结束后定容至50mL；
OPD反应终止液：取5.45mL 98％硫酸溶液，逐滴加入到装有35mL超纯水的烧杯中，缓慢滴加浓硫酸(由于浓硫酸遇水释放大量的热量，请务必缓慢滴加)，边滴加边搅拌，滴加结束后定容至50mL；
ABTS反应终止液：称取1.0g SDS(十二烷基硫酸钠)置于烧杯中，加入100mL超纯水，搅拌至完全澄清。
p-NPP反应终止液：称取12.0g NaOH置于烧杯中，加入80mL超纯水，搅拌至完全溶解，定容至100mL。
(9)不同梯度浓度的D-Biotin工作液
用1×PBST对100ng/100μL D-Biotin溶液进行梯度稀释，获得不同浓度梯度的D-Biotin工作液，配置的梯度浓度(ng/100μL)为0、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60。
如图1至图3所示，一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将50-3000nm磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到上述配置的0-60ng/100uL多组梯度生物素溶液中进行络合；
对磁性纳米微球溶液进行预处理的方法包括如下步骤：
对磁性纳米微球溶液进行磁性分离，去除上清；
通过PBST对磁性纳米微球进行重悬，进行至少两次磁性分离后去除上清；
具体步骤为：
(1.1)取1个1.5mL的EP管，加入75μL(0.75mg)涡旋混匀的SA磁性纳米微球，于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液；
(1.2)往EP管中加入1mL 1×PBST，重悬磁性纳米微球，磁分离去上清。重复此步骤一次，再加入1.5mL 1×PBST重悬磁性纳米微球，此时微球浓度为0.5μg/μL；
(1.3)取一块96孔酶标板板，在孔位依次加入50μL混匀的上述SA磁性纳米微球。将96孔板置于96孔酶标板磁性分离器上，磁性分离，去上清；
将磁性纳米微球溶液预处理后加入到多组生物素溶液中进行络合的方法包括如下步骤：
将D-Biotin工作液加入到磁性纳米微球溶液中得到混合液；
将混合液进行恒温震荡实现络合，震荡时间为30-70min，温度设定为20-40℃，震荡时的转速为800-1200r/min；
具体步骤为：
在酶标板内依次加入梯度浓度的D-Biotin工作液，每孔加入100μL，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
步骤二：清洗络合得到的多组产物并分别进行Biotin-HRP结合；
清洗络合得到的多组产物并分别进行生物素标记的方法包括如下步骤：
在络合后的产物中加入PBST，并进行恒温震荡；
震荡后进行磁吸分离并去除上清；
加入Biotin-HRP工作液，恒温震荡后实现结合；
具体步骤为：
反应结束后磁吸分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，带上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复1次；
每孔加入100μL Biotin-HRP工作液，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
步骤三：在结合后的产物中加入显色液进行显色反应；
在结合后的产物中加入显色液进行显色反应的方法包括如下步骤：
将结合后的产物分别加入PBST洗涤，并进行恒温震荡，磁吸分离后去除上清；
加入TMB显色液混合均匀后避光显色；
显色后加入反应终止液终止反应；
显色液包括TMB(四甲基联苯胺)显色液、OPD(领苯二胺)、ABTS(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)中的一种或功能结构相似的衍生物，使用Biotin-AP作为标记液时，显色剂为p-NPP(硝基苯磷酸酯)或功能结构相似的衍生物；
具体步骤为：
反应结束后磁分离去上清。每孔加入100μL 1×PBST洗涤磁性纳米微球，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，待上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复3次；
用排枪向每孔加入200μL TMB显色液，吹打混匀后37℃恒温避光显色10min。反应完全后每孔加入50μL TMB反应终止液，吹打混匀；
步骤四：测定显色反应后溶液的OD值；
当使用TMB显色时，通过酶标仪测量OD450的值；
当使用OPD显色时，通过酶标仪测量OD492的值；
当使用ABTS显色时，通过酶标仪测量OD405的值；
当使用p-NPP显色时，通过酶标仪测量OD405的值；
检测完毕保留记录的数值；
步骤五：根据获取的多组OD值计算得到生物素结合载量；
根据获取的多组OD值计算得到生物素结合载量的方法包括如下步骤：
根据生物素的含量值以及OD450的值绘制散点折线图；
结合散点折线图计算得到生物素结合容量饱和点的OD450值；
根据OD450值计算得到游离生物素的量；
方法包括如下步骤：
在散点折线图上获取生物素结合容量饱和点，记录饱和点的对应的横坐标数值；
将生物素结合容量饱和点的OD450值代入方程组得到生物素结具体步骤为：
用酶标仪测定OD450值，计算每毫克磁性纳米微球结合的游离生物素结合量；
(5.1)以生物素加入量为横坐标，以对应的OD450值为纵坐标做散点折线图，曲线会逐渐下降然后趋于平稳，处在平稳线上的第一个点即为饱和抑制点，记为B点；
(5.2)计算每毫克磁性纳米微球的游离生物素结合量:
每孔磁性纳米微球用量为50uL,浓度为0.5mg/mL，即0.025mg；根据饱和抑制点对应的横坐标m(B)的数值，计算微球游离生物素载量如下：
B(nmol/0.025mg)＝m(B)/244.3
将单位换算为nmol/mg，公式可变形为：
B(pmol/mg)＝m(B)/244.3×1000×40。
244.3——为D-Biotin的分子量；
本示例饱和抑制点横坐标数值为35，计算得
B＝35/244.3×1000×40＝5370.66pmol/mg。
下面结合实施例进一步阐述本发明的方法：
实施例1
步骤一：将50nm磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到上述配置的0-60ng/100uL多组梯度生物素溶液中进行络合；
(1.1)取1个1.5mL的EP管，加入75μL(0.75mg)涡旋混匀的SA磁性纳米微球，于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液；
(1.2)往EP管中加入1mL 1×PBST，重悬磁性纳米微球，磁分离去上清。重复此步骤一次，再加入1.5mL 1×PBST重悬磁性纳米微球，此时微球浓度为0.5μg/μL；
(1.3)取一块96孔酶标板板，在孔位依次加入50μL混匀的上述SA磁性纳米微球。将96孔板置于96孔酶标板磁性分离器上，磁性分离，去上清；
在酶标板内依次加入梯度浓度的D-Biotin工作液，每孔加入100μL，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁吸分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，带上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复1次；
每孔加入100μL Biotin-HRP工作液，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST洗涤磁性纳米微球，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，待上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复3次；
用排枪向每孔加入200μL TMB显色液，吹打混匀后37℃恒温避光显色10min。反应完全后每孔加入50μL TMB反应终止液，吹打混匀；
在酶标仪上再进行OD450检测并保留记录数值；
如图3所示，计算每毫克磁性纳米微球结合的游离生物素结合量；
(5.1)以生物素加入量为横坐标，以对应的OD450值为纵坐标做散点折线图，曲线会逐渐下降然后趋于平稳，处在平稳线上的第一个点即为饱和抑制点，记为B点；
(5.2)计算每毫克磁性纳米微球的游离生物素结合量:
每孔磁性纳米微球用量为50uL,浓度为0.5mg/mL，即0.025mg；根据饱和抑制点对应的横坐标m(B)的数值，计算微球游离生物素载量如下：
B(nmol/0.025mg)＝m(B)/244.3
将单位换算为nmol/mg，公式可变形为：
B(pmol/mg)＝m(B)/244.3×1000×40。
244.3——为D-Biotin的分子量；
本示例饱和抑制点横坐标数值为38，计算得
B＝38/244.3×1000×40＝6221.86pmol/mg。
实施例2
步骤一：将300nm磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到上述配置的0-60ng/100uL多组梯度生物素溶液中进行络合；
(1.1)取1个1.5mL的EP管，加入75μL(0.75mg)涡旋混匀的SA磁性纳米微球，于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液；
(1.2)往EP管中加入1mL 1×PBST，重悬磁性纳米微球，磁分离去上清。重复此步骤一次，再加入1.5mL 1×PBST重悬磁性纳米微球，此时微球浓度为0.5μg/μL；
(1.3)取一块96孔酶标板板，在孔位依次加入50μL混匀的上述SA磁性纳米微球。将96孔板置于96孔酶标板磁性分离器上，磁性分离，去上清；
在酶标板内依次加入梯度浓度的D-Biotin工作液，每孔加入100μL，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁吸分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，带上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复1次；
每孔加入100μL Biotin-HRP工作液，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST洗涤磁性纳米微球，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，待上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复3次；
用排枪向每孔加入200μL TMB显色液，吹打混匀后37℃恒温避光显色10min。反应完全后每孔加入50μL TMB反应终止液，吹打混匀；
在酶标仪上再进行OD450检测并保留记录数值；
如图4所示，计算每毫克磁性纳米微球结合的游离生物素结合量；
(5.1)以生物素加入量为横坐标，以对应的OD450值为纵坐标做散点折线图，曲线会逐渐下降然后趋于平稳，处在平稳线上的第一个点即为饱和抑制点，记为B点；
(5.2)计算每毫克磁性纳米微球的游离生物素结合量:
每孔磁性纳米微球用量为50uL,浓度为0.5mg/mL，即0.025mg；根据饱和抑制点对应的横坐标m(B)的数值，计算微球游离生物素载量如下：
B(nmol/0.025mg)＝m(B)/244.3
将单位换算为nmol/mg，公式可变形为：
B(pmol/mg)＝m(B)/244.3×1000×40。
244.3——为D-Biotin的分子量；
本示例饱和抑制点横坐标数值为35，计算得
B＝35/244.3×1000×40＝5370.66pmol/mg。
实施例3
步骤一：将1000nm磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到上述配置的0-60ng/100uL多组梯度生物素溶液中进行络合；
(1.1)取1个1.5mL的EP管，加入75μL(0.75mg)涡旋混匀的SA磁性纳米微球，于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液；
(1.2)往EP管中加入1mL 1×PBST，重悬磁性纳米微球，磁分离去上清。重复此步骤一次，再加入1.5mL 1×PBST重悬磁性纳米微球，此时微球浓度为0.5μg/μL；
(1.3)取一块96孔酶标板板，在孔位依次加入50μL混匀的上述SA磁性纳米微球。将96孔板置于96孔酶标板磁性分离器上，磁性分离，去上清；
在酶标板内依次加入梯度浓度的D-Biotin工作液，每孔加入100μL，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁吸分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，带上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复1次；
每孔加入100μL Biotin-HRP工作液，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST洗涤磁性纳米微球，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，待上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复3次；
用排枪向每孔加入200μL TMB显色液，吹打混匀后37℃恒温避光显色10min。反应完全后每孔加入50μL TMB反应终止液，吹打混匀；
在酶标仪上再进行OD450检测并保留记录数值；
如图5所示，计算每毫克磁性纳米微球结合的游离生物素结合量；
(5.1)以生物素加入量为横坐标，以对应的OD450值为纵坐标做散点折线图，曲线会逐渐下降然后趋于平稳，处在平稳线上的第一个点即为饱和抑制点，记为B点；
(5.2)计算每毫克磁性纳米微球的游离生物素结合量:
每孔磁性纳米微球用量为50uL,浓度为0.5mg/mL，即0.025mg；根据饱和抑制点对应的横坐标m(B)的数值，计算微球游离生物素载量如下：
B(nmol/0.025mg)＝m(B)/244.3
将单位换算为nmol/mg，公式可变形为：
B(pmol/mg)＝m(B)/244.3×1000×40。
244.3——为D-Biotin的分子量；
本示例饱和抑制点横坐标数值为29，计算得
B＝29/244.3×1000×40＝4748.26pmol/mg。
实施例4
步骤一：将2000nm磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到上述配置的0-60ng/100uL多组梯度生物素溶液中进行络合；
(1.1)取1个1.5mL的EP管，加入75μL(0.75mg)涡旋混匀的SA磁性纳米微球，于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液；
(1.2)往EP管中加入1mL 1×PBST，重悬磁性纳米微球，磁分离去上清。重复此步骤一次，再加入1.5mL 1×PBST重悬磁性纳米微球，此时微球浓度为0.5μg/μL；
(1.3)取一块96孔酶标板板，在孔位依次加入50μL混匀的上述SA磁性纳米微球。将96孔板置于96孔酶标板磁性分离器上，磁性分离，去上清；
在酶标板内依次加入梯度浓度的D-Biotin工作液，每孔加入100μL，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁吸分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，带上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复1次；
每孔加入100μL Biotin-HRP工作液，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST洗涤磁性纳米微球，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，待上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复3次；
用排枪向每孔加入200μL TMB显色液，吹打混匀后37℃恒温避光显色10min。反应完全后每孔加入50μL TMB反应终止液，吹打混匀；
在酶标仪上再进行OD450检测并保留记录数值；
如图6所示，计算每毫克磁性纳米微球结合的游离生物素结合量；
(5.1)以生物素加入量为横坐标，以对应的OD450值为纵坐标做散点折线图，曲线会逐渐下降然后趋于平稳，处在平稳线上的第一个点即为饱和抑制点，记为B点；
(5.2)计算每毫克磁性纳米微球的游离生物素结合量:
每孔磁性纳米微球用量为50uL,浓度为0.5mg/mL，即0.025mg；根据饱和抑制点对应的横坐标m(B)的数值，计算微球游离生物素载量如下：
B(nmol/0.025mg)＝m(B)/244.3
将单位换算为nmol/mg，公式可变形为：
B(pmol/mg)＝m(B)/244.3×1000×40。
244.3——为D-Biotin的分子量；
本示例饱和抑制点横坐标数值为22，计算得
B＝25/244.3×1000×40＝3602.13pmol/mg。
实施例5
步骤一：将3000nm磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到上述配置的0-60ng/100uL多组梯度生物素溶液中进行络合；
(1.1)取1个1.5mL的EP管，加入75μL(0.75mg)涡旋混匀的SA磁性纳米微球，于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液；
(1.2)往EP管中加入1mL 1×PBST，重悬磁性纳米微球，磁分离去上清。重复此步骤一次，再加入1.5mL 1×PBST重悬磁性纳米微球，此时微球浓度为0.5μg/μL；
(1.3)取一块96孔酶标板板，在孔位依次加入50μL混匀的上述SA磁性纳米微球。将96孔板置于96孔酶标板磁性分离器上，磁性分离，去上清；
在酶标板内依次加入梯度浓度的D-Biotin工作液，每孔加入100μL，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁吸分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，带上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复1次；
每孔加入100μL Biotin-HRP工作液，将96孔板置于恒温震荡仪上，37℃，1100r/min，50min；
反应结束后磁分离去上清，每孔加入100μL 1×PBST洗涤磁性纳米微球，将96孔板置于恒温震荡仪上，1100r/min，混匀30秒，然后将96孔板置于磁力架上进行磁性分离，待上清澄清后，吸弃去上清液；该步骤再重复3次；
用排枪向每孔加入200μL TMB显色液，吹打混匀后37℃恒温避光显色10min。反应完全后每孔加入50μL TMB反应终止液，吹打混匀；
在酶标仪上再进行OD450检测并保留记录数值；
如图7所示，计算每毫克磁性纳米微球结合的游离生物素结合量；
(5.1)以生物素加入量为横坐标，以对应的OD450值为纵坐标做散点折线图，曲线会逐渐下降然后趋于平稳，处在平稳线上的第一个点即为饱和抑制点，记为B点；
(5.2)计算每毫克磁性纳米微球的游离生物素结合量:
每孔磁性纳米微球用量为50uL,浓度为0.5mg/mL，即0.025mg；根据饱和抑制点对应的横坐标m(B)的数值，计算微球游离生物素载量如下：
B(nmol/0.025mg)＝m(B)/244.3
将单位换算为nmol/mg，公式可变形为：
B(pmol/mg)＝m(B)/244.3×1000×40。
244.3——为D-Biotin的分子量；
本示例饱和抑制点横坐标数值为15，计算得
B＝15/244.3×1000×40＝2456.00pmol/mg。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。
Claims (10)
1.一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到多组生物素溶液中进行络合，得到多组混合液；
对多组混合液分别清洗并进行标记反应；
在标记后的产物中加入显色液进行显色反应；
测定显色反应后溶液的OD值；
根据获取的多组OD值计算得到生物素结合载量。
2.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：对磁性纳米微球溶液进行预处理的方法包括如下步骤：
对磁性纳米微球溶液进行磁性分离，去除上清；
通过PBST对磁性纳米微球进行重悬，进行至少两次磁性分离后去除上清。
3.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：将磁性纳米微球溶液预处理后分别加入到多组生物素溶液中进行络合的方法包括如下步骤：
根据生物素的含量分成多组不同浓度的生物素溶液，
在生物素溶液中加入磁性纳米微球溶液得到多组混合液；
将混合液进行恒温震荡络合，震荡时间为30-70min，温度设定为20-40℃，震荡时的转速为800-1200r/min。
4.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：所述生物素溶液包括D-Biotin(D-生物素)工作液。
5.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：对多组混合液分别清洗并进行标记反应的方法包括如下步骤：
在混合液中加入PBST，并进行恒温震荡；
震荡后进行磁吸分离并去除上清；
加入标记液，恒温震荡进行标记反应。
6.根据权利要求5所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：所述标记液包括Biotin-HRP以及Biotin-AP中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：在标记后的产物中加入显色液进行显色反应的方法包括如下步骤：
在产物中分别加入PBST洗涤，并进行恒温震荡，磁吸分离后去除上清；
加入显色液混合均匀后进行避光显色；
显色后再次加入显色液终止反应。
8.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：所述显色液包括TMB显色液、OPD、ABTS、p-NPP中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：所述OD值的测定方法包括如下步骤：
当使用TMB显色时，通过酶标仪测量OD450的值；
当使用OPD显色时，通过酶标仪测量OD492的值；
当使用ABTS显色时，通过酶标仪测量OD405的值；
当使用p-NPP显色时，通过酶标仪测量OD405的值。
10.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素磁性微球结合游离生物素载量的检测方法，其特征在于：根据获取的多组OD值计算得到生物素结合载量的方法包括如下步骤：
根据生物素的含量值以及OD值绘制散点折线图；
结合散点折线图计算得到生物素结合容量饱和点的OD值；
根据OD值计算得到链霉亲和素磁性微球的生物素载量。
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