CN104764782A - 一种用于检测miRNA-20a的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域，涉及一种用于检测miRNA-20a的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的制备及其应用。向铂电极滴加纳米金和BGQDs-DNA，使其在电极表面的体积为2-8μL/mm2和2-6μL/mm2。室温干燥，将电极浸入含有不同浓度待测miRNA-20a的缓冲液中，在37℃下反应0.5-3h，用PBS缓冲溶液清洗电极。用多通道化学发光检测***检测电极电化学发光信号，电解液为0.1M PBS含0.1M KCl及0.05M K2S2O8，电压0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压600V。本发明的电化学发光检测方法比传统分析方法成本低、操作简单、实用性强。
Description
技术领域
本发明属于环境分析领域，涉及一种用于检测miRNA-20a的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的制备及其应用。
背景技术
miRNAs是一类长约20-25个核苷酸的内源性非蛋白质编码的RNA分子，能够参与调控多种生物学行为，如细胞分化，发育进程，细胞凋亡，疾病，肿瘤等。有研究表明，50％的miRNAs位于肿瘤相关基因组的区域或者脆弱的位点，并且不同类型的miRNAs的表达也相应的表示不同肿瘤疾病，miRNA-20a的表达已被证明至少与三种实体肿瘤相关。因此，miRNA-20a的定量检测对于肿瘤的临床诊断和药物效果评估有着至关重要的作用。
传统的miRNAs检测方法主要包括聚合酶链反应，杂交印迹法，微阵列芯片这几种方法。虽然这些方法的检测结果比较准确，但是它们的操作都很复杂，检测费用较高，耗时，灵敏度低。近年来电化学传感技术也被用于检测miRNAs。然而这些方法基本上都是用酶，磁性纳米材料等作为信号放大技术。这些物质不但价格较高，而且酶的使用寿命较短，对检测环境的pH、温度等要求严格，这都不利于传感器的推广应用。因此，开发适用性广、操作简单、绿色高效的、高选择性高灵敏度的miRNAs检测方法具有非常重要的现实意义。
电化学发光传感器，由于其本身的特点近几年来较受关注。这种技术所需设备简单、检测速度快、反应可控，而且可实现实时原位分析。电化学发光物质是电化学发光传感器的重要部件，电化学发光物质性能的好坏，直接决定了电化学发光传感器的检测效果。传统的电化学发光物质，钌化合物、鲁米诺，均有一定的生物毒性，如果用于检测miRNAs，难免会对检测结果产生影响。石墨烯量子点近年来也被用做电化学发光物质。但是其本身根据制备方法的不同，发光稳定性也不同。因此提高电化学发光物质的性能，并将电化学发光传感用于检测miRNAs，成为了亟待解决的问题。
本发明通过电化学方法制备了硼掺杂石墨烯量子点，利用高导电性、高发光稳定性，高生物兼容性、环保友好的硼掺杂石墨烯量子点作为电化学发光物质，以与miRNA-20a互补的发夹状DNA作为识别探针，构建了对miRNA-20a具有高选择性高灵敏度的硼掺杂石墨烯量子点基电化学发光传感器。解决了传统方法操作复杂、繁琐耗时、成本高、实用性差等缺点，应用前景非常广阔。
发明内容
本发明解决了现有miRNA-20a检测方法操作复杂、繁琐耗时、成本高、实用性差等不足，提供了一种简便、快捷、实用的miRNA-20a的定量分析方法。
将硼酸与石墨氧化物按一定比例混合，倒入玻璃管中，在加热的条件下生成棒状的硼掺杂石墨烯。以此硼掺杂石墨烯棒为工作电极，石墨棒为对电极，通过电化学方法制备硼掺杂石墨烯量子点(BGQDs)。以巯基标记的发夹状DNA为探针捕捉miRNA-20a。将硼掺杂石墨烯量子点标记在发夹状DNA的一端，形成电化学发光探针(记为BGQDs-DNA)。铂电极通过纳米金(AuNPs)修饰后，电化学发光探针可以通过巯基与纳米金的结合作用固定在的电极表面，此时硼掺杂石墨烯量子点贴近电极表面，能够获得较高的电化学发光信号。当体系中存在目标miRNA-20时，发夹状DNA的折叠结构打开，形成直链，使得硼掺杂石墨烯量子点远离电极表面，电化学发光信号降低。体系的电化学发光信号在一定范围内与目标物miRNA-20的浓度呈线性反相关，从而为miRNA-20的定量检测提供依据。
本发明提供了一种用于检测miRNA-20a的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的制备，具体步骤如下：
(1)在冰浴状态下将浓硫酸加入到石墨粉中并搅拌，然后将高锰酸钾加入到上述的混合物中，持续搅拌20-48小时；加入H2O并静止10-60分钟，随后加入H2O和H2O2终止反应；将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗，得到石墨氧化物；其中所用的各物质的摩尔比为浓硫酸：石墨粉：高锰酸钾：H2O：H2O2＝1：0.3：0.02：10：0.2。
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入H3BO3，混合物至60-100℃保温6-12小时；将产物用水清洗，真空冷冻干燥，得到硼掺杂的石墨烯棒。其中石墨氧化物与H3BO3的质量比为250-5000。
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法制备硼掺杂石墨烯量子点，电解液为含有25-50mM NaOH的无水乙醇和水的混合液，无水乙醇和水的体积比＝99:1-99.5:0.5，电流密度180-300mA/cm2，反应1-3小时，离心分离去除石墨杂质；将得到的离心液透析24-48小时，透析孔径小于5000Da，得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液。
(4)向步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入NaOH和ClCH2COOH，超声。再加入150mg/ml的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，反应10-60分钟；然后再加入100μM巯基标记的发夹状DNA，缓慢搅拌。最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA。将电化学发光探针BGQDs-DNA分散在0.1M Tris-EDTA(TE)pH＝8.0缓冲溶液中，储存于4℃备用。其中NaOH与ClCH2COOH的质量比为0.25-0.5；NHS与EDC的体积比1-3；硼掺杂的石墨烯量子点水溶液与巯基标记的发夹状DNA的体积比120-1200。
(5)将AuNPs水溶液滴在铂电极表面，记为Pt/Au，AuNPs水溶液在铂电极表面的体积2-8μL/mm2，室温干燥，再将步骤(4)制得的BGQDs-DNA滴加到Pt/Au表面，BGQDs-DNA在Pt/Au表面的体积2-6μL/mm2，1-3小时后用0.1M磷酸盐(PBS)pH＝7.4缓冲溶液冲洗电极表面，即得硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器。
步骤(4)中巯基标记的发夹状DNA总碱基数为31-39，其主体部位，对应识别miRNA-20a碱基序列为5’-CTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3’。
步骤(5)中铂电极在使用前需要清洁，具体方法如下：
将铂电极在0.05-1μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中研磨，研磨后依次用无水乙醇和高纯水超声清洗，在N2保护下干燥。
硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器浸入到含有的miRNA-20a的TE缓冲液中(miRNA-20a的浓度范围为1-50000pM)，37℃水浴条件下杂交0.5-3小时，然后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面。最后得到的电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，利用多通道化学发光测试***检测电化学发光信号，检测是在含有0.1M KCl及0.05M K2S2O8的0.1M PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中进行，电压范围为0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压为600V。
本发明具有如下效果：
(1)灵敏度高，检测限可达0.05pM(S/N＝3)。
(2)相对于传统的电化学发光材料，硼掺杂石墨烯量子点生物毒性低，发光稳定，生命周期长，不会造成环境污染。
(3)该电化学发光传感器操作简单，检测快，不需要复杂昂贵的大型设备，实用性强。
附图说明
图1是本发明所述的miRNA-20a的定量检测示意图。
图2是本方法制备的硼掺杂石墨烯量子点的TEM图片。
图3是本发明的方法获得的定量检测miRNA-20a的标准工作曲线。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1
电化学发光探针BGQDs-DNA的制备，包括如下步骤：
(1)在冰浴状态下将23ml浓硫酸加入到1g高纯石墨粉中并搅拌，然后将3g高锰酸钾分多次加入到上述混合物中，持续搅拌24小时。加入50ml水并静止15分钟，随后加入150ml水和10ml H2O2终止反应。将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗沉淀，最终获得石墨氧化物。
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入0.002g H3BO3，超声10分钟使其混合均匀。然后将混合物转移至玻璃管中，在鼓风干燥箱中加热至80℃保温12小时。将产物用水清洗几次，然后真空冷冻干燥，最后得到硼掺杂的石墨烯棒。
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法来制备硼掺杂石墨烯量子点。电解液为含有0.01g NaOH的10ml无水乙醇和水的混合液(体积比＝99.5:0.5)，电流密度范围200-250mA/cm2。反应2小时后，通过离心分离去除石墨杂质。将得到的离心液放入透析袋(1000Da)中，用纯水透析24小时，最终得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液。
(4)向10ml步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入0.015gNaOH和0.025g ClCH2COOH，超声3小时(频率:40KHZ,功率:200W)。将400μL N-羟基丁二酰亚胺(NHS，150mg/ml)和250μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC，10mg/ml)加入到上述混合物中反应30分钟。然后将50μL巯基标记的发夹状DNA(100μM)加入到上述混合物中，并缓慢搅拌过夜。最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA。将电化学发光探针分散在0.1M Tris-EDTA(TE)缓冲溶液(pH 8.0)储存于4℃备用。
实施例2
电化学发光探针BGQDs-DNA的制备，包括如下步骤：
(1)在冰浴状态下将30ml浓硫酸加入到1.2g高纯石墨粉中并搅拌，然后将1.8g高锰酸钾分多次加入到上述混合物中，持续搅拌24小时。加入100ml水并静止15分钟，随后加入180ml水和15ml H2O2终止反应。将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗沉淀，最终获得石墨氧化物。
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入0.0025g H3BO3，超声10分钟使其混合均匀。然后将混合物转移至玻璃管中，在鼓风干燥箱中加热至80℃保温12小时。将产物用水清洗几次，然后真空冷冻干燥，最后得到硼掺杂的石墨烯棒。
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法来制备硼掺杂石墨烯量子点。电解液为含有0.015g NaOH的10ml无水乙醇和水的混合液(体积比＝99.5:0.5)，电流密度范围200-230mA/cm2。反应2小时后，通过离心分离去除石墨杂质。将得到的离心液放入透析袋(1000Da)中，用纯水透析24小时，最终得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液。
(4)向10ml步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入0.018gNaOH和0.028g ClCH2COOH，超声3小时(频率:40KHZ,功率:200W)。将500μL N-羟基丁二酰亚胺(NHS，150mg/ml)和300μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC，10mg/ml)加入到上述混合物中反应30分钟。然后将80μL巯基标记的发夹状DNA(100μM)加入到上述混合物中，并缓慢搅拌过夜。最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA。将电化学发光探针分散在0.1M Tris-EDTA(TE)缓冲溶液(pH 8.0)储存于4℃备用。
实施例3
配置样品中miRNA-20a含量的测定：
(1)在冰浴状态下将25ml浓硫酸加入到1.2g高纯石墨粉中并搅拌，然后将1.5g高锰酸钾分多次加入到上述混合物中，持续搅拌24小时。加入45ml水并静止15分钟，随后加入200ml水和15ml H2O2终止反应。将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗沉淀，最终获得石墨氧化物。
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入0.0045g H3BO3，超声10分钟使其混合均匀。然后将混合物转移至玻璃管中，在鼓风干燥箱中加热至80℃保温12小时。将产物用水清洗几次，然后真空冷冻干燥，最后得到硼掺杂的石墨烯棒。
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法来制备硼掺杂石墨烯量子点。电解液为含有0.015g NaOH的10ml无水乙醇和水的混合液(体积比＝99:1)，电流密度范围180-220mA/cm2。反应2小时后，通过离心分离去除石墨杂质。将得到的离心液放入透析袋(1000Da)中，用纯水透析24小时，最终得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液。
(4)向10ml步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入0.02gNaOH和0.035g ClCH2COOH，超声3小时(频率:40KHZ,功率:200W)。将450μL N-羟基丁二酰亚胺(NHS，150mg/ml)和300μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC，10mg/ml)加入到上述混合物中反应30分钟。然后将150μL巯基标记的发夹状DNA(100μM)加入到上述混合物中，并缓慢搅拌过夜。最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA。将电化学发光探针分散在0.1M Tris-EDTA(TE)缓冲溶液(pH 8.0)储存于4℃备用。
(5)将3μL的AuNPs水溶液滴在铂电极表面(记为Pt/Au)，室温自然干燥后，再滴加2μL步骤(4)制得的BGQDs-DNA滴加到Pt/Au表面，2小时后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面，即得硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器.
(6)步骤(5)得到的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器浸入到含有不同浓度的miRNA-20a的TE缓冲液中，37℃水浴条件下杂交1小时，然后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面。以最后得到的电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，利用多通道化学发光测试***检测电化学发光信号，检测是在含有0.1M KCl及0.05M K2S2O8的0.1M PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中进行，电压范围为0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压为600V。
(7)步骤(6)中随着样品中miRNA-20a浓度的增加，体系的电化学发光信号不断下降，在5～10000pM范围内，电化学发光与miRNA-20a浓度有良好的线性关系，线性相关系数R＝0.982。
(8)配置样品中miRNA-20a浓度的测定：
用工作缓冲液(0.1M PBS含有0.1M KCl和0.05M K2S2O8，pH 7.4)配置活性为7pM的miRNA-20a待测样品，用步骤(6)的方法进行检测，检测结果与步骤(7)得到的标准工作曲线对比，计算出miRNA-20a的浓度值。实验结果测出miRNA-20a的浓度为7.5pM，回收率为107.1％，相对标准偏差RSD为2.34％(n＝3)。
实施例3的miRNA-20a序列和DNA序列如表1所示。
表1miRNA-20a序列和DNA序列
实施例4
配置样品中miRNA-20a含量的测定：
(1)在冰浴状态下将11.5ml浓硫酸加入到0.5g高纯石墨粉中并搅拌，然后将1.5g高锰酸钾分多次加入到上述混合物中，持续搅拌24小时。加入23ml水并静止15分钟，随后加入70ml水和5ml H2O2终止反应。将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗沉淀，最终获得石墨氧化物。
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入0.002g H3BO3，超声10分钟使其混合均匀。然后将混合物转移至玻璃管中，在鼓风干燥箱中加热至80℃保温12小时。将产物用水清洗几次，然后真空冷冻干燥，最后得到硼掺杂的石墨烯棒。
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法来制备硼掺杂石墨烯量子点。电解液为含有0.01g NaOH的10ml无水乙醇和水的混合液(体积比＝99:1)，电流密度范围200-250mA/cm2。反应2小时后，通过离心分离去除石墨杂质。将得到的离心液放入透析袋(1000Da)中，用纯水透析24小时，最终得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液。
(4)向15ml步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入0.02gNaOH和0.03g ClCH2COOH，超声3小时(频率:40KHZ,功率:200W)。将400μL N-羟基丁二酰亚胺(NHS，150mg/ml)和250μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC，10mg/ml)加入到上述混合物中反应30分钟。然后将75μL巯基标记的发夹状DNA(100μM)加入到上述混合物中，并缓慢搅拌过夜。最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA。将电化学发光探针分散在0.1M Tris-EDTA(TE)缓冲溶液(pH 8.0)储存于4℃备用。
(5)将4μL的AuNPs水溶液滴在铂电极表面(记为Pt/Au)，室温自然干燥后，再滴加4μL步骤(4)制得的BGQDs-DNA滴加到Pt/Au表面，2小时后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面，即得硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器.
(6)步骤(5)得到的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器浸入到含有不同浓度的miRNA-20a的TE缓冲液中，37℃水浴条件下杂交1.5小时，然后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面。以最后得到的电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，利用多通道化学发光测试***检测电化学发光信号，检测是在含有0.1M KCl及0.05M K2S2O8的0.1M PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中进行，电压范围为0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压为600V。
(7)步骤(6)中随着样品中miRNA-20a浓度的增加，体系的电化学发光信号不断下降，在10～10000pM范围内，电化学发光与miRNA-20a浓度有良好的线性关系，线性相关系数R＝0.987。
(8)配置样品中miRNA-20a浓度的测定：
用工作缓冲液(0.1M PBS含有0.1M KCl和0.05M K2S2O8，pH 7.4)配置活性为20pM的miRNA-20a待测样品，用步骤(6)的方法进行检测，检测结果与步骤(7)得到的标准工作曲线对比，计算出miRNA-20a的浓度值。实验结果测出miRNA-20a的浓度为19.7pM，回收率为98.5％，相对标准偏差RSD为5.49％(n＝3)。
实施例4的miRNA-20a序列和DNA序列如表2所示。
表2miRNA-20a序列和DNA序列
实施例5
配置样品中miRNA-20a含量的测定：
(1)在冰浴状态下将60ml浓硫酸加入到2g高纯石墨粉中并搅拌，然后将6g高锰酸钾分多次加入到上述混合物中，持续搅拌24小时。加入92ml水并静止15分钟，随后加入280ml水和20ml H2O2终止反应。将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗沉淀，最终获得石墨氧化物。
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入0.008g H3BO3，超声10分钟使其混合均匀。然后将混合物转移至玻璃管中，在鼓风干燥箱中加热至80℃保温12小时。将产物用水清洗几次，然后真空冷冻干燥，最后得到硼掺杂的石墨烯棒。
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法来制备硼掺杂石墨烯量子点。电解液为含有0.01g NaOH的20ml无水乙醇和水的混合液(体积比＝99.5:0.5)，电流密度范围260-300mA/cm2。反应1.5小时后，通过离心分离去除石墨杂质。将得到的离心液放入透析袋(1000Da)中，用纯水透析48小时，最终得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液。
(4)向20ml步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入0.025gNaOH和0.035g ClCH2COOH，超声3小时(频率:40KHZ,功率:200W)。将500μL N-羟基丁二酰亚胺(NHS，150mg/ml)和350μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC，10mg/ml)加入到上述混合物中反应30分钟。然后将100μL巯基标记的发夹状DNA(100μM)加入到上述混合物中，并缓慢搅拌过夜。最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA。将电化学发光探针分散在0.1M Tris-EDTA(TE)缓冲溶液(pH 8.0)储存于4℃备用。
(5)将6μL的AuNPs水溶液滴在铂电极表面(记为Pt/Au)，室温自然干燥后，再滴加6μL步骤(4)制得的BGQDs-DNA滴加到Pt/Au表面，2小时后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面，即得硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器.
(6)步骤(5)得到的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器浸入到含有不同浓度的miRNA-20a的TE缓冲液中，37℃水浴条件下杂交2小时，然后用0.1M磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)冲洗电极表面。以最后得到的电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，利用多通道化学发光测试***检测电化学发光信号，检测是在含有0.1M KCl及0.05M K2S2O8的0.1M PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中进行，电压范围为0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压为600V。
(7)步骤(6)中随着样品中miRNA-20a浓度的增加，体系的电化学发光信号不断下降，在20～1000pM范围内，电化学发光与miRNA-20a浓度有良好的线性关系，线性相关系数R＝0.991。
(8)配置样品中miRNA-20a浓度的测定：
用工作缓冲液(0.1M PBS含有0.1M KCl和0.05M K2S2O8，pH 7.4)配置活性为100pM的miRNA-20a待测样品，用步骤(6)的方法进行检测，检测结果与步骤(7)得到的标准工作曲线对比，计算出miRNA-20a的浓度值。实验结果测出miRNA-20a的浓度为112.7pM，回收率为112.7％，相对标准偏差RSD为2.34％(n＝3)。
实施例5的miRNA-20a序列和DNA序列如表3所示。
表3miRNA-20a序列和DNA序列
Claims (5)
1.一种用于检测miRNA-20a的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)在冰浴状态下将浓硫酸加入到石墨粉中并搅拌，然后将高锰酸钾加入到上述的混合物中，持续搅拌20-48小时；加入H2O并静止10-60分钟，随后加入H2O和H2O2终止反应；将混合物离心分离，并用浓度为5％的盐酸和水分别清洗，得到石墨氧化物；其中所用的各物质的摩尔比为浓硫酸：石墨粉：高锰酸钾：H2O：H2O2＝1：0.3：0.02：10：0.2；
(2)向步骤(1)获得的石墨氧化物中加入H3BO3，混合物至60-100℃保温6-12小时；将产物用水清洗，真空冷冻干燥，得到硼掺杂的石墨烯棒；其中石墨氧化物与H3BO3的质量比为250-5000；
(3)以步骤(2)获得的硼掺杂的石墨烯棒为工作电极，以石墨棒为对电极通过电化学方法制备硼掺杂石墨烯量子点，电解液为含有25-50mM NaOH的无水乙醇和水的混合液，无水乙醇和水的体积比＝99:1-99.5:0.5，电流密度180-300mA/cm2，反应1-3小时，离心分离去除石墨杂质；将得到的离心液透析24-48小时，透析孔径小于5000Da，得到硼掺杂的石墨烯量子点水溶液；
(4)向步骤(3)获得的硼掺杂的石墨烯量子点水溶液中加入NaOH和ClCH2COOH，超声；再加入150mg/ml的N-羟基丁二酰亚胺和10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，反应10-60分钟；然后再加入100μM巯基标记的发夹状DNA，缓慢搅拌；最后将混合物离心，沉淀即为电化学发光探针BGQDs-DNA；将电化学发光探针BGQDs-DNA分散在0.1MTris-EDTApH＝8.0缓冲溶液中，储存于4℃备用；其中NaOH与ClCH2COOH的质量比为0.25-0.5，NHS与EDC的体积比1-3，硼掺杂的石墨烯量子点水溶液与巯基标记的发夹状DNA的体积比120-1200；
(5)将AuNPs水溶液滴在铂电极表面，记为Pt/Au，AuNPs水溶液在铂电极表面的体积2-8μL/mm2，室温干燥，再将步骤(4)制得的BGQDs-DNA滴加到Pt/Au表面，BGQDs-DNA在Pt/Au表面的体积2-6μL/mm2，1-3小时后用0.1M磷酸盐pH＝7.4缓冲溶液冲洗电极表面，即得硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中巯基标记的发夹状DNA总碱基数为31-39，其主体部位，对应识别miRNA-20a碱基序列为5’-CTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中的铂电极在使用前清洁方法如下：将铂电极在0.05-1μm粒径的氧化铝抛光粉的悬浮液中研磨，研磨后依次用无水乙醇和高纯水超声清洗，在N2保护下干燥。
4.权利要求1或2所述的制备方法得到的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的应用，其特征在于，硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器浸入到含有的miRNA-20a的TE缓冲液中，miRNA-20a的浓度为1-50000pM，37℃水浴条件下杂交0.5-3小时，然后用0.1M磷酸盐pH＝7.4缓冲溶液冲洗电极表面，得到的电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，利用多通道化学发光测试***检测电化学发光信号，检测是在含有0.1M KCl和0.05MK2S2O8的0.1M PBS pH＝7.4缓冲溶液中，电压范围为0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压为600V。
5.权利要求3所述的制备方法得到的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的应用，其特征在于，硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器浸入到含有的miRNA-20a的TE缓冲液中，miRNA-20a的浓度为1-50000pM，37℃水浴条件下杂交0.5-3小时，然后用0.1M磷酸盐pH＝7.4缓冲溶液冲洗电极表面，得到的电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，利用多通道化学发光测试***检测电化学发光信号，检测是在含有0.1M KCl和0.05MK2S2O8的0.1M PBS pH＝7.4缓冲溶液中，电压范围为0.7～1.15V，扫描速率0.1V/s，光电倍增管高压为600V。
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