CN103436621B - 一种快速检测CK19mRNA表达量的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测CK19mRNA表达量的引物、探针以及检测方法和试剂盒，其中所述引物包括碱基序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。本发明方法检测速度快、操作简单、特异性好、灵敏度高、重复性强，其能够对检测样本中的CK19mRNA表达量进行快速特异性检测，可应用于以CK19作为标记物的相关检测中，具有广泛的应用范围和良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及CK19mRNA表达量的检测，特别是涉及用于快速检测CK19mRNA表达量的引物、探针、检测方法及其试剂盒。
背景技术
细胞角蛋白（cytokeratin，CK）是角质细胞中的主要骨架蛋白，这种结构蛋白的主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。研究发现细胞角蛋白具有极高的保守性和组织分化特异性，其与上皮细胞的增殖分化密切相关，目前已得到证实的细胞角蛋白有20种，即CK1-20。细胞角蛋白作为一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物，其阳性表达多见于上皮细胞、间皮细胞、癌、间皮瘤等。
细胞角蛋白19（CK19）是分布于上皮细胞中的细胞角蛋白成分之一，其是由KERATIN19（KRT19）基因编码的分子量为40000的可溶性酸性多肽分子，主要表达于单层腺上皮及间皮细胞，其碱基序列如SEQ ID NO:7所示。CK19在正常状态下含量极低，但在癌组织中具有更为丰富的表达，目前在包括黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、食管癌、头颈癌、胃癌、***癌和肺癌在内的多种癌症中均可以发现CK19的异常表达，特别是其在乳腺癌中具有较高的表达量、敏感性和特异性。
此外，在恶性肿瘤发展过程中，常常并存着肿瘤细胞扩散于淋巴***、血液循环、骨髓、肝、肾等组织或器官中，形成微小转移灶，其无任何临床表现，在常规检查和普通病理检查中也很难发现。CK19作为乳腺癌转移的相关标记物之一，已经被广泛应用于前哨***、外周血和骨髓中乳腺癌转移检测和癌症预后诊断中。在临床上利用其对前哨***进行微转移检测，可以提高诊断准确性，从而改变对一部分患者的治疗决策。特别是在依据传统乳腺癌手术标准对病人进行腋窝***清扫时，可以避免对尚未发生腋窝***转移的病人进行不必要的传统手术，以防过度治疗对病人造成的诸多并发症等不利影响。
目前用于检测***中的肿瘤细胞及标记物的方法主要包括免疫组织化学染色法、流式细胞术、免疫放射法、Southern blot、ELISA、Real Time-PCR、RT-PCR等，其中RT-PCR法检测时间短、检测敏感性高，其利用肿瘤特异表达基因，可以从107个外周血细胞或骨髓单核细胞中检测到1个癌细胞，这一技术的检测敏感性是免疫组织化学染色法的10倍以上，特别适合在手术中进行应用。随着研究的深入，越来越多的结果表明RT-PCR也可以在正常SLN中检测到假阳性乳腺癌转移。因此，利用标志基因与内参基因相结合进行检测的多重RT-PCR技术逐渐成为利用CK19检测乳腺癌转移研究的热点。
如公开号为CN101432437A的中国发明专利公开了一种诊断乳腺癌的存在或预测乳腺癌的进程的方法，包括测量包含组织特异性基因（乳腺珠蛋白）和非组织特异性基因（CK19）的标志基因的组合在源自患者的细胞或组织样品中的表达，并且采用PBGD作为对照，此外还提供了相关的试剂盒、引物及探针序列。然而，其需要同时使用MG和CK19两种目的基因进行检测才能够获得较好的灵敏度和特异性，操作和结果判断相对复杂。
又如公开号为CN101365800A的中国发明专利公开了定量确定生物样品中的CK-19mRNA阳性细胞的方法，其在提取外周血单核细胞RNA后利用特异性引物和探针分别进行反转录和qPCR反应。然而，其采用两步法进行检测，不仅操作时间长、操作相对复杂，而且还易于产生污染。公开号为CN101054603A的中国发明专利公开了一种用于快速测定CK19mRNA的方法及其引物和探针，使用与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的第一引物和与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的第二引物扩增CK19mRNA的部分，然后使用两种类型的探针检测扩增物。此方法检测时间短，能够较好地排除人DNA或CK19假基因的干扰，然而其灵敏度和特异性还有待进一步研究。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种快速并且具有较高特异性、敏感性和重复性的用于检测CK19mRNA表达量的引物、探针及检测方法和试剂盒，本发明方法及试剂盒可以用于评估癌症患者（特别是乳腺癌患者）癌症病灶转移情况，从而可以为癌症的早期诊断、转移、复发和治疗方案的确定提供重要的参考依据。
为了达到上述目的，本发明一方面提供一种用于检测CK19mRNA表达量的第一引物，包括第一正向引物和第一反向引物，其中所述第一正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明另一方面提供一种用于检测CK19mRNA表达量的第一探针，所述第一探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，所述第一探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
特别是，所述报告荧光基团为FAM荧光基团，所述淬灭荧光基团为BHQ1荧光基团。
本发明再一方面提供一种用于检测CK19mRNA表达量的试剂盒，包括：
用于检测CK19mRNA表达量的第一引物，包括第一正向引物和第一反向引物，其中所述第一正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；以及
用于检测CK19mRNA表达量的第一探针，所述第一探针的碱基序列如SEQ IDNO:3所示，所述第一探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
其中，所述第一探针上的报告荧光基团为FAM荧光基团，淬灭荧光基团为BHQ1荧光基团。
特别是，所述试剂盒包括CK19引物探针混合液，其含有0.4μM第一正向引物，0.4μM第一反向引物和0.2μM第一探针。
其中，所述试剂盒还包括：
用于检测内参基因ACTB mRNA表达量的第二引物，其中所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:5所示；以及
用于检测内参基因ACTB mRNA表达量的第二探针，其中所述第二探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示，所述第二探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
特别是，所述第二探针上的报告荧光基团为HEX荧光基团，淬灭荧光基团为BHQ1荧光基团。
尤其是，所述试剂盒包括ACTB引物探针混合液，其含有0.4μM-10nM的第二正向引物，0.4μM-10nM的第二反向引物和0.4μM-10nM的第二探针，优选包括20nM第二正向引物，20nM第二反向引物和10nM第二探针。
其中，所述试剂盒还包括进行实时荧光定量RT-PCR所需的试剂，这些试剂均可从商业途径得到。
本发明的试剂盒也可以与RT-PCR试剂盒进行配套使用来快速检测CK19mRNA表达量，所述RT-PCR试剂盒优选为Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit。
当与RT-PCR试剂盒配套使用时，本试剂盒可以仅包括上述用于检测CK19mRNA表达量的第一引物和第一探针，还可以包括上述用于检测内参基因ACTBmRNA表达量的第二引物和第二探针。
本发明再一方面提供一种上述试剂盒在快速检测CK19mRNA表达量中的应用。
特别是，所述应用包括：利用所述试剂盒采用实时荧光定量RT-PCR检测样本CK19mRNA表达量。
本发明再一方面提供一种用于检测乳腺癌患者CK19mRNA表达量的试剂盒，包括所述第一引物和所述第一探针。
特别是，所述用于检测乳腺癌患者CK19mRNA表达量的试剂盒进一步包括所述第二引物和所述第二探针。
本发明再一方面提供一种用于检测CK19mRNA表达量的方法，包括如下步骤：
A）通过使用权利要求1所述第一引物来扩增样本的CK19mRNA，形成CK19mRNA的扩增物；
B）通过使用权利要求2或3所述的第一探针检测所述CK19mRNA的扩增物，得到CK19mRNA的表达量。
特别是，在扩增样本CK19mRNA之前，首先从样本中提取总RNA，然后以总RNA为模板来扩增样本的CK19mRNA。
其中，所述用于检测CK19mRNA表达量的方法还包括：
C）使用碱基序列如SEQ ID NO:4所示的第二正向引物和碱基序列如SEQ IDNO:5所示的第二反向引物扩增样本的内参基因ACTB mRNA，形成ACTB mRNA的扩增物；
D）使用碱基序列如SEQ ID NO:6所示的第二探针检测所述ACTB mRNA的扩增物，得到ACTB mRNA的表达量。
本发明所述方法在检测样本CK19mRNA表达量的同时以内参基因ACTB作为参照，可以有效避免假阴性的发生，从而具有更强的适用性。
特别是，本发明方法采用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪进行。
尤其是，本发明方法采用Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit试剂盒进行所述扩增，扩增反应体系为：2X Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Master Mix：12.5μL；20XCK19引物探针混合液：1.25μL；20X ACTB引物探针混合液：1.25μL；ReverseTranscriptase Mix：0.25μL；RNA：1μL；DEPC水：8.75μL；反应总体积为25μL。
其中，所述20X CK19引物探针混合液中含有0.4μM第一正向引物，0.4μM第一反向引物和0.2μM第一探针；所述20X ACTB引物探针混合液中含有20nM第二正向引物，20nM第二反向引物和10nM第二探针；
特别是，所述扩增的反应条件为：50℃反转录5min，95℃激活HotStarTaq PlusDNA Polymerase（包含在Reverse Transcriptase Mix中）30s，40个循环：95℃变性1s，60℃延伸6s（荧光信号收集）。
采用Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR仪的随机软件对本发明的数据结果进行Ct值分析，其中：CK19Ct≤30、ACTB Ct≤36为阳性样本；CK19Ct＞30、ACTB Ct≤36为阴性样本；ACTB Ct＞36为无效样本。
特别是，本发明所述样本包括所有生物来源的含有或者怀疑含有CK19的物质，如血液、骨髓、***、肿瘤细胞、乳腺组织等；所述样本优选为人前哨***、人肿瘤或人乳腺，进一步优选为人前哨***。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1、采用本发明的CK19引物及探针进行一步法多重qRT-PCR扩增，可以特异性地检测出样本中CK19mRNA的表达，其检测速度快，检测灵敏度高，并且操作简单，约40分钟即可完成整个操作，特别适合在手术中进行快速检测；
2、本发明方法同时采用内参基因ACTB作为参照，内参基因ACTB mRNA表达稳定，不仅可以有效避免假阴性的发生，而且还能够较好地对目的基因的表达量进行校正，从而提高该方法的灵敏度和重复性，检测结果更加准确可靠；
3、本发明方法特异性好，并且具有较高的准确性和灵敏度，可以检测到低至100pg/μL的CK19mRNA特异性扩增，可应用于以CK19作为标记物的相关检测中，应用范围广泛；特别是可以用于评估乳腺癌患者癌症病灶转移情况，从而可以为乳腺癌的早期诊断、转移、复发和治疗方案的确定提供重要的参考依据。
附图说明
图1是CK19mRNA的标准曲线；
图2是ACTB mRNA的标准曲线；
图3是乳腺癌患者前哨***组织样本CK19mRNA的扩增曲线；
图4是乳腺癌患者前哨***组织样本ACTB mRNA的扩增曲线；
图5是对照例1中的引物对1-6PCR扩增产物的凝胶电泳检测图；
图6是对照例1中的引物对7-10PCR扩增产物的凝胶电泳检测图；
图7是对照例1中的采用引物对1、3、5、6、8、9的CK19mRNA的扩增曲线；
图8是扩增特异性测试中CK19mRNA的扩增曲线；
图9是扩增特异性测试中ACTB mRNA的扩增曲线；
图10是扩增敏感性测试中CK19mRNA的扩增曲线；
图11是扩增敏感性测试中ACTB mRNA的扩增曲线；
图12是扩增重复性测试中CK19mRNA的扩增曲线；
图13是扩增重复性测试中ACTB mRNA的扩增曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例
一、材料
1、实验样本：四例乳腺癌患者前哨***组织，来源于北京某医院；
2、总RNA提取试剂盒：RNeasy Mini Kit购自QIAGEN（Cat.74104）；
3、一步法多重qRT-PCR试剂盒：Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit购自QIAGEN（Cat.204972）；
4、用于检测CK19mRNA表达量的第一引物和第一探针，序列如下，由QIAGEN公司合成及标记；
第一正向引物：5’-CCATTGAGAACTCCAGGATT-3’(SEQ ID No.1)
第一反向引物：5’-CCCTGCGCAGGCCGTTGATGT-3’(SEQ ID No.2)
第一探针：5’-FAM-ACAATGCCCGTCTGGCTGCAGA-BHQ1-3’(SEQ ID No.3)
5、用于检测内参基因ACTB mRNA表达量的第二引物和第二探针，序列如下，由QIAGEN公司合成及标记；
第二正向引物：5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’(SEQ ID No.4)
第二反向引物：5’-GCCGCGCTCGGTGAGGATCTT-3’(SEQ ID No.5)
第二探针：5’-HEX-TCCCCCATGCCATCCTGCGTCT-BHQ1-3’(SEQ ID No.6)
6、阳性对照品：人乳腺癌细胞总RNA，Breast adenocarcinoma（MCF-7）total RNA，购自Ambion（Cat.AM7846），其浓度为50ng/μL。
7、阴性对照品：人脾总RNA，Human spleen total RNA，购自Ambion（Cat.AM7970），其浓度为50ng/μL。
二、CK19mRNA表达量测定方法
在Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪中采用Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit试剂盒进行一步法多重qRT-PCR扩增，其中扩增反应体系为：
2X Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Master Mix：12.5μL；20X CK19引物探针混合液：1.25μL；20X ACTB引物探针混合液：1.25μL；Reverse Transcriptase Mix：0.25μL；RNA：1μL；DEPC水：8.75μL；反应总体积为25μL；其中，20X CK19引物探针混合液中含有0.4μM第一正向引物，0.4μM第一反向引物和0.2μM第一探针；20XACTB引物探针混合液中含有20nM第二正向引物，20nM第二反向引物和10nM第二探针；
扩增反应条件为：50℃反转录5min，95℃激活HotStar Taq Plus DNA Polymerase（包含在Reverse Transcriptase Mix中）30s，40个循环：95℃变性1s，60℃延伸6s（荧光信号收集）；
采用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪的随机软件对数据结果进行分析。
三、测定人前哨***样本CK19mRNA表达量
1、制作标准曲线
将阳性对照品（MCF-7总RNA）与阴性对照品（人脾总RNA）按表3比例进行混合，制得试样1-7，然后分别取1μL按照上述方法进行一步法qRT-PCR扩增，制作的标准曲线见图1、图2，其中横坐标表示RNA浓度，纵坐标表示Ct值。
表1标准曲线试样组成成分及含量
| 试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| MCF-7总RNA（%） | 100 | 90 | 70 | 50 | 30 | 10 | 0 |
| 人脾总RNA（%） | 0 | 10 | 30 | 50 | 70 | 90 | 100 |
2、测定CK19mRNA表达量
取四例人乳腺癌患者前哨***组织临床样本1-4各30mg，采用常规方法利用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，分别制得人乳腺癌患者前哨***组织临床样本1-4的总RNA，采用BioPhotometer核酸蛋白测定仪检测其浓度，结果见表4；
按照上述方法以人乳腺癌患者前哨***组织临床样本1-4的总RNA为模板进行一步法多重qRT-PCR扩增，同时以阳性对照品和阴性对照品作为对照，测定结果见表4和图3、图4。
表2人乳腺癌患者前哨***组织临床样本中CK19mRNA表达量
| 样品名称 | 总RNA浓度（ng/μl） | CK19Ct值 | ACTBCt值 |
| 阳性对照品 | 50 | 18.13 | 12.38 |
| 样品1 | 164.7 | 22.33 | 15.14 |
| 样品2 | 148.1 | 22.87 | 15.49 |
| 样品3 | 39.6 | 21.32 | 14.76 |
| 样品4 | 24.3 | 23.13 | 15.33 |
| 阴性对照品 | 50 | 31.69 | 18.80 |
由表2结果可知：采用本发明方法对四例人乳腺癌患者的前哨***组织样本进行CK19mRNA表达量检测，检测结果根据Ct值分析表明：四例乳腺癌患者结果均为阳性样本，此外阳性对照品检测结果为阳性，阴性对照品检测结果为阴性，说明本发明方法能够检测出人乳腺癌患者的前哨***组织中CK19mRNA的特异性表达，并且特异性好、准确度高，可应用于以CK19作为标记物的相关检测中，特别是应用于在术中快速地对乳腺癌患者的CK19mRNA表达量进行检测，从而评估乳腺癌患者癌症病灶转移，为乳腺癌的早期诊断、转移、复发和治疗方案的确定提供重要的参考依据。
对照例1 10种对照引物扩增性能比较
1.采用一步法RT-PCR进行引物筛选
10种用于检测CK19mRNA表达量的引物及其探针，由Life-Tech公司合成，其碱基序列如下：
引物对1及探针：
正向引物F(5'-3')：AGATGAGCAGGTCCGAGGTTA(SEQ ID No.8)
反向引物R(5'-3')：CCTGATTCTGCCGCTCACTATCA(SEQ ID No.9)
探针(5'-3')：ACCCTTCAGGGTCTTGAGATT(SEQ ID No.10)
引物对2及探针：
正向引物F(5'-3')：TCGACAACGCCCGTCTG(SEQ ID No.11)
反向引物R(5'-3')：CCACGCTCATGCGCAG(SEQ ID No.12)
探针(5'-3')：CCGAACCAAGTTTGAGACGGAACAGG(SEQ ID No.13)
引物对3及探针：
正向引物F(5'-3')：CCCGCGACTACAGCCACTA(SEQ ID No.14)
反向引物R(5'-3')：CTCATGCGCAGAGCCTGTT(SEQ ID No.15)
探针(5'-3')：ACCATTGAGAACTCCAGGATTGTCC(SEQ ID No.16)
引物对4及探针：
正向引物F(5'-3')：AGATCGACAACGCCCGT(SEQ ID No.17)
反向引物R(5'-3')：AGAGCCTGTTCCGTCTCAAA(SEQ ID No.18)
探针(5'-3')：TGGCTGCAGATGACTTCCGAACC(SEQ ID No.19)
引物对5及探针：
正向引物F(5'-3')：CAGATCGAAGGCCTGAAGGA(SEQ ID No.20)
反向引物R(5'-3')：CTTGGCCCCTCAGCGTACT(SEQ ID No.21)
探针(5'-3')：GCCTACCTGAAGAAGAACCATGA(SEQ ID No.22)
引物对6及探针：即本发明所使用的第一引物及探针
第一正向引物：5’-CCATTGAGAACTCCAGGATT-3’(SEQ ID No.1)
第一反向引物：5’-CCCTGCGCAGGCCGTTGATGT-3’(SEQ ID No.2)
第一探针：5’-FAM-ACAATGCCCGTCTGGCTGCAGA-BHQ1-3’(SEQ ID No.3)
引物对7及探针：
正向引物F(5'-3')：ACCATTGAGAACTCCAGGATTGTC(SEQ ID No.23)
反向引物R(5'-3')：CTCATGCGCAGAGCCTGTT(SEQ ID No.24)
探针(5'-3')：CAGATGACTTCCGAACCAAGTTTG(SEQ ID No.25)
引物对8及探针：
正向引物F(5'-3')：ATTCCGCTCCGGGCACC(SEQ ID No.26)
反向引物R(5'-3')：GCAGCTCAATCTCAAGACCC(SEQ ID No.27)
探针(5'-3')：GGATGCTGAAGCCTGGTTCA(SEQ ID No.28)
引物对9及探针：
正向引物F(5'-3')：CATGAAAGCTGCCTTGGAAGA(SEQ ID No.29)
反向引物R(5'-3')：TGATTCTGCCGCTCACTATCAG(SEQ ID No.30)
探针(5'-3')：GCATATCCAGGCGCTGATCA(SEQ ID No.31)
引物对10及探针：
正向引物F(5'-3')：ATTCCGCTCCGGGCACC(SEQ ID No.32)
反向引物R(5'-3')：CGCTGATCAGCGCCTG(SEQ ID No.33)
探针(5'-3')：GGATGCTGAAGCCTGGTTCA(SEQ ID No.34)
将上述10种引物及其探针，使用ABI9700PCR仪，采用Rotor-Gene MultiplexRT-PCR Kit试剂盒进行一步法RT-PCR扩增，其中扩增反应体系为：
2X Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Master Mix：12.5μL；Reverse Transcriptase Mix：0.25μL；终浓度为0.4uM的正向引物F，终浓度为0.4uM的反向引物R；MCF-7总RNA1uL；DEPC水补足反应总体积至25μL。
扩增程序为：50℃反转录5min，95℃激活HotStar Taq Plus DNA Polymerase（包含在Reverse Transcriptase Mix中）30s，40个循环：（94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s)；72℃延伸10min；
每对引物对均做复管。
表3
| 图5和图6中编号 | 引物对 | 结果 |
| 1 | 引物对1 | 有扩增 |
| 2 | 引物对1 | 有扩增 |
| 3 | 引物对2 | 无扩增 |
| 4 | 引物对2 | 无扩增 |
| 5 | 引物对3 | 有扩增 |
| 6 | 引物对3 | 有扩增 |
| 7 | 引物对4 | 无扩增 |
| 8 | 引物对4 | 无扩增 |
| 9 | 引物对5 | 有扩增（弱） |
| 10 | 引物对5 | 有扩增（弱） |
| 11 | 引物对6 | 有扩增 |
| 12 | 引物对6 | 有扩增 |
| 13 | 引物对7 | 无扩增 |
| 14 | 引物对7 | 无扩增 |
| 15 | 引物对8 | 有扩增 |
| 16 | 引物对8 | 有扩增 |
| 17 | 引物对9 | 有扩增 |
| 18 | 引物对9 | 有扩增 |
| 19 | 引物对10 | 无扩增 |
| 20 | 引物对10 | 无扩增 |
将扩增产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图5、图6和表3所示，其中图5和图6中M所示为100bp DNA Ladder Marker（购自TaKaRa公司，货号3422A）。结果表明：通过上述扩增，仅引物对1、3、5、6、8、9有扩增，其余引物对无扩增。
二、对一步法反转录PCR筛选出的6对引物进行一步法RT-qPCR筛选
在Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪中采用Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit试剂盒进行一步法RT-qPCR扩增，其中扩增反应体系为：
2X Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Master Mix：12.5μL；20X CK19引物探针混合液：1.25μL；Reverse Transcriptase Mix：0.25μL；MCF-7总RNA1uL；DEPC水补足反应总体积至25μL；其中，20X CK19引物探针混合液中含有0.4μM第一正向引物，0.4μM第一反向引物和0.2μM第一探针。
扩增反应条件为：50℃反转录5min，95℃激活HotStarTaq Plus DNA Polymerase（包含在Reverse Transcriptase Mix中）30s，40个循环：95℃变性1s，60℃延伸6s（荧光信号收集）；
采用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪的随机软件对数据结果进行分析，检测结果如图7所示。
如图7所示，上述6条扩增曲线依次对应引物对及探针为6、3、1、8、9、5，其Ct值依次变大。所以从检测效率的角度，本发明选定的引物对6是最理想的选择。在专利文件中对引物对6及其探针的敏感、特异等方面进行了详细的描述。
试验例1扩增特异性测试
试样1为100%MCF-7总RNA样本，试样2为70%MCF-7总RNA和30%人脾总RNA的混合样本，试样3为30%MCF-7总RNA和70%人脾总RNA的混合样本，试样4为100%人脾总RNA样本；
将试样1-4按照上述方法进行一步法多重qRT-PCR扩增，扩增曲线如图8、图9所示，扩增结果表明：使用本发明的引物和探针，可以准确在肿瘤组织提取物中检测CK19基因的特异性扩增，而在非肿瘤组织中不会出现该基因的显著扩增，由此说明本发明的引物和探针能够对CK19基因进行特异性扩增，并且特异性好。
试验例2扩增敏感性测试
对阳性对照品MCF-7总RNA进行稀释，分别制得浓度为50ng/μL、10ng/μL、1000pg/μL、100pg/μL和50pg/μL的试样1-5，按照上述方法进行一步法多重qRT-PCR扩增，测试结果见表4，扩增曲线见图10、图11，结果表明：使用本发明的引物和探针可以检测到低至100pg/μL的CK19mRNA特异性扩增，说明本发明方法敏感性好，灵敏度高。
表4扩增敏感性结果
| 试样编号 | 样品浓度 | CK19Ct值 | ACTB Ct值 |
| 1 | 50ng/μL | 17.11 | 21.04 |
| 2 | 10ng/μL | 18.01 | 21.52 |
| 3 | 1000pg/μL | 19.97 | 22.09 |
| 4 | 100pg/μL | 20.50 | 22.25 |
| 5 | 50pg/μL | 29.13 | 23.38 |
试验例3扩增重复性测试
将试样1（50ng/μL的MCF-7总RNA）和试样2（100pg/μL的MCF-7总RNA）按照上述方法进行一步法多重qRT-PCR扩增，每个试样重复测试三次，测试结果见表5，扩增曲线见图12、图13，结果表明：本发明方法准确性好，重复度高。
表5扩增重复性结果
Claims (4)
1.一种用于检测CK19mRNA表达量的试剂盒，其特征在于，包括：
用于检测CK19mRNA表达量的第一引物，其中所述第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；
用于检测CK19mRNA表达量的第一探针，其中所述第一探针的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，所述第一探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；
以及反转录酶混合液，其中所述反转录酶混合液包括反转录酶Reverse Transcriptase和热启动DNA聚合酶HotStarTaq Plus DNA Polymerase。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一探针的报告荧光基团为FAM荧光基团，所述第一探针的淬灭荧光基团为BHQ1荧光基团。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：
用于检测内参基因ACTB mRNA表达量的第二引物，其中所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:5所示；以及
用于检测内参基因ACTB mRNA表达量的第二探针，其中所述第二探针的碱基序列如SEQ ID NO:6所示，所述第二探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二探针的报告荧光基团为HEX荧光基团，所述第二探针的淬灭荧光基团为BHQ1荧光基团。
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