CN105603069A - 一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒 - Google Patents

一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒，属于分子生物学检测领域。本发明引物及探针包括：正向引物：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’，荧光探针:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，所述试剂盒除包含引物及探针外，还包含PCR反应液预混液、阳性对照样品A。利用本发明检测引物及探针、检测试剂盒进行Bim基因缺失突变的检测，简便易行、准确率高、灵敏度高，尤其是适用于临床样本检测，通过检测BIM缺失突变，便于指导机体的个性化治疗。

Description

一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒。
背景技术
目前，肺癌在欧美等发达国家及我国恶性肿瘤中病死率最高，且其发病率逐年上升，其中NSCLC占80％～85％。近年来，肺癌的靶向治疗已取得重大进展，多类高效低毒的靶向药物相继问世，并应用于临床，主要有以EGFR为靶点的靶向治疗、以血管生成为靶点的靶向治疗、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、以法基尼转移酶为靶点的靶向治疗、肺癌反义寡核苷酸靶向治疗和肺癌靶向疫苗等；吉非替尼为靶向治疗的代表性药物，为信号传导通路酪氨酸激酶抑制剂。此外，以腺病毒为载体的基因治疗在临床中有着广泛的应用前景。目前多数研究证实，吉非替尼等EGFR-TKI可通过增加细胞内Bim数量诱导细胞内源性凋亡。Bim重组腺病毒转染对EGFR突变NSCLC细胞凋亡具有诱导作用，可能机制为上调细胞内Bim蛋白表达；此为NSCLC的基因治疗提供了依据，但关于Bim肿瘤抑制因子在肿瘤基因治疗方面的研究甚少。
Bim作为重要的凋亡调节蛋白，不仅在消除自身免疫，维持造血细胞内环境的稳定中起着重要的调节作用，而且对病理损伤(如神经退行性变、肿瘤、癫痫等)细胞具有强大的杀伤功能。有关细胞凋亡的研究使人们意识到，诱导细胞凋亡可作为***的新途径。Bim为近年来研究比较热门的一种凋亡调节蛋白，已有研究报道人类Bim基因定位的染色体区域位于很多肿瘤的染色体区域内，且主要是造血***来源的肿瘤。Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生，其中多为造血***肿瘤，从而强有力地证明Bim是一种肿瘤抑制因子。王等用免疫组织化学方法研究发现在正常增殖期子宫内膜、非典型增生子宫内膜、子宫内膜癌这一过程中Bim蛋白的表达量逐渐降低。Bim的促调亡功能，使其成为肿瘤基因治疗中的一个理想靶目标。
Bim(Bcl-2interactingmediatorofcelldeath)是Bcl-2家族中BH3-only亚家族成员，是一种重要的凋亡调节蛋白，是O’connoretall于1998年发现的，人类Bim基因位于2q12或2q13，由6个外显子和3个内含子组成。Bim异构体的形成是由Bim前体mRNA的选择性剪接而产生。由于各异构体mRNA保留了不同的外显子序列，从而使得Bim各异构体具有不同的结构域，促凋亡活性也有所不同。目前已发现Bim存在11种异构体。Bim蛋白属于Bcl-2家族，仅含Bcl-2家族4个同源结构域(BHl-4)中的BH3结构域，而BH3域被认为是细胞凋亡起始的必需因子，可通过拮抗抗凋亡因子的作用或直接与Bax等相互作用并共同转位到线粒体膜上引起细胞色素c释放而诱导细胞凋亡。Bim在多种正常细胞中均有表达，其中包括造血细胞、上皮细胞、神经细胞及生殖细胞等。最近的研究发现，Bim基因作为抑癌基因，其表达缺失可促使多种肿瘤的发生，包括***癌，乳腺癌，子宫内膜癌等。而且Bim也是许多抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的重要介质之一。Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生，其中多为造血***肿瘤。Bim在酪氨酸激酶抑制剂诱导表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌细胞株凋亡过程中起重要作用，也与白血病细胞对糖皮质激素的耐药性相关，用Bim基因表达载体转染肿瘤细胞有可能成为肿瘤基因治疗的新途径。
目前常用于检测Bim基因缺失的方法主要有：直接测序法、荧光原位杂交(florescenceinsituhybridization，FISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerisechainreaction，RT-PCR)。直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在检测周期长、操作过程复杂，易被污染，测序结果的判读较复杂、费时，费用较高等缺点，此外，对于检测异质性较高的临床肿瘤组织样本是，直接测序法假阴性率高。荧光原位杂交可以对染色体或特定基因的数目异常，特定片段的缺失、易位和重排进行诊断研究，但工作量大而复杂，效率较低。免疫组织化学的检测成本较低，大部分医院的病理科都可以开展，但IHC检测取决于Bim基因的表达量和相应抗体的特异性与敏感性，在未发现理想的抗体之前，IHC检测的准确性和重复性尚难保证。RT-PCR的基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将RNA逆转录为单链的CDNA，再通过PCR将CDNA扩增，电泳后确证结果，具有敏感特异、所需组织量极少等优点，但对组织中RNA的质量有较高要求，若组织中的RNA降解严重，则可能影响最终的检测结果，且费时，检出率较低，难以在常规工作或基层实验室推广普及应用。然而现有检测方法存在无法同时兼顾适用于临床样本、检测方法简便易行、准确率高、灵敏度高、结果判定简洁快速准确的缺点。
实时荧光定量PCR技术(rea1-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，然而应用于BIM缺失突变的检测引物及探针或试剂盒未见报道。
综上所述，为了临床上实现治疗肺癌的目标，本领域内需要开发简便易行的、准确率高、灵敏度高的检测方法和/试剂盒，尤其是适用于临床样本检测的方法和/试剂盒，以用于检测BIM缺失突变，便于指导机体的个性化治疗。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测Bim基因缺失突变的检测引物及探针、检测试剂盒。
本发明的目的之一是提供一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针，正向引物序列为ForwardPrimer：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引物序列为ReversePrimer:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’，荧光探针序列为Taqman-Probe:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。
本发明基于荧光定量PCR方法，实时荧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基因型之间无差异。全自动的荧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最有前景的定量检测技术。
Bim基因缺失荧光定量PCR检测的原理为：采用荧光定量PCR方法对Bim基因缺失进行定量检测。分别针对Bim基因的保守序列特异设计TaqMan探针及引物一对，当遇到Bim基因缺失相应变体特定基因序列时，TaqMan探针可与之完全结合，PCR扩增时，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测Bim基因缺失的目的。
首先，对于Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物的设计，现有技术中荧光定量PCR引物的设计往往需要考虑众多因素，包括：采用保守区序列进行引物设计、引物自身或引物之间不能形成互补、扩增产物避免形成二级结构、G+C含量的控制(40％～60％)、引物长度的控制(通常在17-25碱基之间)、荧光定量PCR扩增产物长度限制(80-150bp，最长300bp)等。
发明人设计引物过程当中，在满足上述基本条件的基础上，进一步通过设计提升引物及探针的特异性和扩增效率。通常，引物越长，其特异性越高(每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍)，然而由于引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小，即扩增效率越低。发明人经过多组引物对比筛选，最终筛选到本发明所述上游引物和下游引物，其同时具备较高的特异性和良好的扩增效率；此外，发明人设计下游引物为Bim缺失序列(2903bp)上游5bp和缺失序列(2903bp)下游20bp序列的组合，其有效的避免了单纯采用Bim缺失序列下游基因组序列作为引物扩增时基因组碎片或mRNA造成干扰的问题，同时下游引物中仅包括Bim缺失序列(2903bp)上游5bp碱基，不会产生5bp碱基配对引起的扩增，极大的提高了荧光定量PCR扩增的特异性和准确性。
尤其是，临床样本多样化，尤其对于样本组织蜡块，对引物和探针的特异性和适用性要求较高。本发明所述检测引物及探针采用荧光定量PCR扩增，具有极高的特异性和准确性。
本发明所获得的上游引物Tm61.1℃、G+C含量为45.8％，ΔG为-41.7kcal/mol，下游引物Tm60.7℃、G+C含量为44.0％，ΔG为-43.2kcal/mol。
其次，对于Bim基因缺失荧光定量PCR检测探针的设计，为了进一步增加荧光定量PCR扩增的特异性，本发明采用的TaqMan-MGB探针，与传统的TaqMan-TAMRA探针相比较，MGB探针具有提高TM值，使探针的长度缩短，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异；同时提高信噪比，与特异性和引物配合使用，进一步提高检测的准确性和特异性，使实验结果更精确，分辨率更高；更简化实验，MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高等优势。
同时发明人对于荧光报告基团也进行了选择性优化，现有的荧光报告基团包括6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro-6-methylfluorescein，HEX)、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein，TET)、羧基-X-罗丹明(Carboxy-x-rhodamine，ROX)、6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、磺酰罗丹明(Sulforhodamine101，TexasRed)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-Carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein，JOE)、花菁3(cyanine3，Cy3)、花菁3.5(cyanine3.5，Cy3.5)、花菁5(cyanine5，Cy5)和花菁5.5(cyanine5.5，Cy5.5)等多种，发明人通过对探针5’端报告基团的选择，发现5’端标记FAM荧光报告基团与MGB型探针，其淬灭过程中荧光共振能量转移更好，荧光定量PCR过程中，荧光曲线效果更明显。
本发明提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5’-3’外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
本发明的另一目的包括上述引物及探针在制备针对Bim基因缺失突变检测的试剂盒、芯片或其他检测试剂中的应用。
本发明的另一目的是提供一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述检测引物及探针。
优选的，本发明所述试剂盒进一步包括阳性对照样品A：包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒。
更优选的，本发明提供一种快速、准确检测Bim基因缺失的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCRMasterMix)、荧光定量反应液A、阳性对照样品A；
荧光定量反应液A：检测的是Bim基因缺失，反应体系包括：检测Bim基因缺失的引物和探针序列：正向引物序列为ForwardPrimer：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引物序列为ReversePrimer:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’、荧光探针序列为Taqman-Probe:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，荧光探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
阳性对照样品A：包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒。
所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒
本发明的另一目的是提供一种Bim基因缺失突变的检测方法，包括：
从样品组织中提取基因组DNA；
利用上述引物及探针进行荧光定量PCR反应；
根据荧光定量PCR扩增曲线检测Bim基因缺失突变。
优选的，样品组织为临床组织蜡块。
优选的，荧光定量PCR的条件为:反应体系为25μL，正、反引物各0.2μL，探针各0.2μL，样品模板DNA2μL,2×TaqmanuniversalPCRMasterMix15μL,ddH2O7.4μL，PCR反应条件：95℃预变性30秒；并按95℃5秒，58℃33秒，扩增反应45个循环。
需要说明的是，本发明所述检测方法并不能直接诊断个体的患病情况，不属于疾病的诊断方法。
本发明具有以下有益效果：
与现有检测方法比较，本技术采用荧光定量PCR技术检测Bim基因缺失具有以下优势：
1.检测灵敏度高，特异性好：本发明分别针对Bim基因保守序列设计了特异性引物和荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低；本发明适用于临床组织样本的检测，甚至对于组织蜡块都可以有效的检测。
2.线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；
3.操作简单，自动化程度高，FQ-PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率；
4.结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读：在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观；
5.检测的样本量大，一次最多可检测384例；
6.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害；
7.没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。
附图说明
图1Bim基因缺失的FQ-PCR图
图2Bim基因缺失的测序结果图
具体实施方式
实施例一Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针的设计与筛选
依据常规荧光定量PCR引物设计因素，设计20组正向引物、反向引物及荧光探针，根据引物筛选设计原则，筛选获得相对得分较高的三组，部分引物及探针序列参见表1，引物设计因素包括：1、引物于核酸保守区内设计并具有特异性；2.扩增产物避免形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)；3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大；4.G+C含量在40％～60％之间，45-55％最佳；5.碱基要随机分布，尽量均匀；6.引物自身不能有连续4个碱基的互补；7.引物之间不能有连续4个碱基的互补；8.引物5’端可以修饰；9.3’端不可修饰，而且要避开AT,GCrich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)；10.引物3′端要避开密码子的第3位；11.引物整体设计自由能分布5’端大于3’端，且3’端自由能最好小于9KJ/mol；12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp；13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区；14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源；15.查看有无假基因的存在；16.TM值在58-62度之间。
表1Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针的设计与筛选序列
采用阳性对照样品A(包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒)进行荧光定量PCR扩增，其中引物及探针组二S型曲线效果良好，且扩增效率较高，引物及探针组三及引物及探针组一扩增不明显。因此，选取引物及探针组二进行临床样本检测。
实施例二Bim基因缺失样本的检测
该实施例中所用阳性样本收集自中山大学附属肿瘤医院病理科临床病理诊断为Bim基因缺失的蜡块组织，阴性样本为野生纯合子(BIM未缺失)个体蜡块组织，其中阳性样本83例，阴性样本9例。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。
探针及引物为：
ForwardPrimer：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、
ReversePrimer:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’、
Taqman-Probe:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’；
然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测：反应体系为25μL，正、反引物各0.2μL(20μΜ)，探针各0.2μL(20μΜ)，样品模板DNA2μL(100-300ng/μl),2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O7.4μL。PCR反应条件：95℃预变性30sec；并按95℃5秒，58℃33秒，扩增反应45个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性(阴性对照未检出)，如图1所示，为Bim基因缺失阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将实施例2中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出Bim基因缺失，如图2所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因缺失，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。阳性样本检出率100％，阴性样本未发现有扩增。以此发现采用本发明的Bim基因缺失荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定缺失基因突变情况。
由上可知：利用上述试剂盒进行FQ-PCR法进行检测，不仅是快速、高效、灵敏，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针，正向引物序列为ForwardPrimer：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引物序列为ReversePrimer:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’，荧光探针序列为Taqman-Probe:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。
2.权利要求1所述引物及探针在制备针对Bim基因缺失突变检测的试剂盒、芯片或其他检测试剂中的应用。
3.一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述检测引物及探针。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括阳性对照样品A：包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒。
5.一种快速、准确检测Bim基因缺失的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液A、阳性对照样品A；
荧光定量反应液A：检测Bim基因缺失的引物和探针序列，正向引物序列为ForwardPrimer：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引物序列为ReversePrimer:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’、荧光探针序列为Taqman-Probe:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
阳性对照样品A：包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒。
6.一种Bim基因缺失突变的检测方法，包括：
从样品组织中提取基因组DNA；
利用权利要求1所述引物及探针或权利要求3-5任一项所述试剂盒进行荧光定量PCR反应；
根据荧光定量PCR扩增曲线检测Bim基因缺失突变。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，样品组织为临床组织蜡块。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR的条件为:反应体系为25μL，正、反引物各0.2μL，探针各0.2μL，样品模板DNA2μL,2×TaqmanuniversalPCRMasterMix15μL,ddH2O7.4μL，PCR反应条件：95℃预变性30秒；并按95℃5秒，58℃33秒，扩增反应45个循环。
CN201610040898.4A 2016-01-20 2016-01-20 一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒 Pending CN105603069A (zh)

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