CN102787107B - 嗜热脂环芽孢杆菌来源的羧酸酯酶D-1CarE5及其基因 - Google Patents
嗜热脂环芽孢杆菌来源的羧酸酯酶D-1CarE5及其基因 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种羧酸酯酶D-1CarE5及其基因。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。且本发明提供了上述羧酸酯酶的编码基因D-1CarE5,羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组载体和羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组菌株。本发明的羧酸酯酶具有以下性质:以α-乙酸萘酯为底物:最适温度40℃;最适pH7.38;终浓度1mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用,Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用;在温度35℃以下保温50min基本保持稳定;经1/15mol/LpH5.91、pH7.38和pH8.04缓冲液下处理80min,分别保持40%、90%和45%以上的活性;同时也能够水解β-乙酸萘酯;可应用于农药残留或农药污染治理方面。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体地说是一种嗜热脂环芽孢杆菌来源的羧酸酯酶D-1CarE5及其基因。
背景技术
羧酸酯酶(Carboxylesterases, E C3.1.1.1)是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶,与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员,其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三联体结构,Ser,Asp,His构成了羧酸脂酶的催化活性中心(Nardini, M, et al., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9(6):732-737.)。
羧酸脂酶广泛存在于动物、植物、微生物中(Melloney J., et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.),其中微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类,在催化酯水解、酯合成、酯交换等上有重要应用价值,具有良好的区域选择性和立体选择性(Ramos Tombo, et al., Agricultural and Biological Chemistry. 1987, 51:1833-1838.)。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景(Jaeger K.E., et al., Trends in Biotechnology. 1998, 16(9):396-403.)。
羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶,然而天然菌株产酶低、难以大量生产,生产成本高,限制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器,可以提高农药降解酶的表达量,实现其大规模工业化生产。本文从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组中克隆羧酸脂酶基因D-1CarE5与表达载体pET28a(+)连接后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对羧酸酯酶酶学性质进行了初步研究,为进一步研究羧酸酯酶对农药的降解奠定了理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧酸酯酶。
本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明所述羧酸酯酶D-1CarE5可得自嗜热脂环芽孢杆菌(thermophilic
Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)。D-1CarE5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的羧酸酯酶D-1CarE5总共含有513个氨基酸,理论分子量为58.65kDa。以α-乙酸萘酯为底物:最适温度40℃;最适pH7.38;终浓度1 mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用,Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用; 在温度35 ℃以下保温50 min基本保持稳定;经1/15 mol/L pH5.91、pH7.38和pH8.04缓冲液下处理80 min,分别保持40%、90%和45%以上的活性;在pH7.38及40 ℃下,该酶对0.6 mol/Lα-乙酸萘酯的比活力为108.65±0.01 U/mg;在pH7.0及60 ℃下,该酶对0.6 mol/Lβ-乙酸萘酯的比活力为14.78±0.01 U/mg。
本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因D-1CarE5,该基因序列如SEQ ID NO.2。
本发明通过PCR的方法克隆了羧酸酯酶D-1CarE5的编码基因D-1CarE5,其全长1542 bp,起始密码为ATG,终止密码为TGA。经BLAST 在GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比对分析,该羧酸酯酶基因D-1CarE5编码的氨基酸序列与GeneBank中Paenibacillus sp. JDR-2来源的潜在羧酸脂酶(YP_003012983.1)具有最高一致性,为68%;与Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703来源潜在脂酶(YP_909165.1)具有最高一致性,为45%,说明羧酸酯酶D-1CarE5是一种新的羧酸酯酶。
本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组载体,优选为pET-D-1CarE5。将本发明的羧酸酯酶基因***到表达载体合适的限制性内切酶位点之间,使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案,将本发明的羧酸酯酶基因***到质粒pET-28a(+)上的BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点之间,得到重组大肠杆菌表达质粒pET-D-1CarE5。
本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组菌株,优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌,优选为重组菌株BL21(DE3)/ D-1CarE5。
本发明制备羧酸酯酶D-1CarE5的方法按以下步骤进行:
1)用上述的重组载体转化宿主细胞,得重组菌株;
2)培养重组菌株,诱导重组羧酸酯酶表达;
3)回收并纯化所表达的羧酸酯酶D-1CarE5。
其中,优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞,优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)/ D-1CarE5。
本发明提供了一个新的羧酸酯酶基因,其编码的羧酸酯酶以α-乙酸萘酯为底物:最适温度40℃;最适pH7.38;终浓度1 mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用,Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用; 在温度35 ℃以下保温50 min基本保持稳定;经1/15 mol/L pH5.91、pH7.38和pH8.04缓冲液下处理80 min,分别保持40%、90%和45%以上的活性;同时也能够水解β-乙酸萘酯;可应用于农药残留或农药污染治理方面。
附图说明
图1:在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶D-1CarE5的SDS-PAGE分析,其中,M:低分子量蛋白质Marker;1:纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE5。
图2:重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适温度。
图3:重组羧酸酯酶D-1CarE5的热稳定性。
图4:重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适pH。
图5:重组羧酸酯酶D-1CarE5的pH稳定性。
图6:不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D-1CarE5活性的影响。
图7:重组羧酸酯酶D-1CarE5 1/[S]与1/V的关系。
具体实施方式
实验材料和试剂
1、菌株及载体:嗜热脂环酸芽孢杆菌(thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)为实验室筛选菌株;大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pET-28a(+)可购于Novagen公司。
2、酶类及其它生化试剂:限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司;T4连接酶购自Promega公司;坚固蓝B购自Sigma公司;其它试剂均购自国药集团。
3、培养基:
LB培养基:蛋白胨 1%,酵母粉 0.5%,氯化钠1%,pH自然(约为7.0)。固体培养基在此基础上加2.0%(w/v)琼脂。
说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1:羧酸酯酶基因D-1CarE5的克隆
嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA:CTAB裂解法,具体步骤为:将液体培养12 h的新鲜菌液离心取菌体,加入800 μL溶液Ⅰ( 20 mM Tris, pH8.0, 2 mM Na2-EDTA, 终浓度20 mg/mL溶菌酶),37 ℃保温30 min,加100 μL 10% SDS上下颠倒混匀,再加10 μL 10 mg/mL的蛋白酶K,37 ℃保温30 min,加150 μL 5 M NaCl和150 μL 10% CTAB溶液上下颠倒混匀,65 ℃保温20 min,加入等体积的酚/氯仿/异丙醇(体积比25:24:1)进行抽提,在4 ℃下12000 rpm离心10 min,取上清于氯仿/异丙醇(体积比24:1)中再次抽提除去杂蛋白,4 ℃下12000 rpm离心10 min,再取上清并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5.2 3M NaAc,-70℃沉淀1h,4 ℃下13500 rpm离心20 min,弃上清,再用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20 ℃备用。
根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因D-1CarE5并设计表达引物CarF和CarR:
上游引物CarF: 5’ CGCGGATCCATGCAAAGCATGCTGCGG 3’(划线部分为BamHⅠ酶切位点)
下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGGAAAATGTACTGTTTTTGCTTAAAG 3’ (划线部分为XhoⅠ酶切位点)
上游引物T7: 5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’
下游引物T7ter: 5’TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’为PCR检测阳性克隆子引物。
以嗜热脂环酸芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 sec;52 ℃退火30 sec;72 ℃延伸1 min30 sec;30个循环后72 ℃保温5 min。 PCR纯化产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收目的片段,再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-28a(+)连接构建质粒pET-D-1CarE5,4 ℃过夜。取10 μl连接产物pET-D-1CarE5转化到100 μl Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布于含Kan的LB固体平板上,37 ℃温箱培养13 h,从转化板上挑取几株单菌落,使用引物(T7,T7ter)进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子,从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/D-1CarE5。
实施例2:羧酸酯酶D-1CarE5的制备[a3]
取含有重组质粒pET-D-1CarE5的Escherichia coli BL21(DE3)菌株和只含有pET-28a(+)的空质粒Escherichia coli BL21(DE3)菌株,以0.1%的接种量接种于LB(含50 μg/mL Kan)培养液中,37 ℃快速振荡16 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB(含50 μg/mL Kan)培养液中,快速振荡培养约2–3 h(OD600达到0.6–1.0)后,加入终浓度0.7 mM的IPTG进行诱导,于20 ℃继续振荡培养约20 h或26 ℃振荡培养约8 h。12000 rpm离心5 min,收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后,于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后,吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图1)表明,重组羧酸酯酶在大肠杆菌中得到了表达,经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
[a4] 纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE5的性质测定
1、重组羧酸酯酶D-1CarE5的活性分析
2[a5] 纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE5的活性测定方法采用α-萘酚法:取三支10 ml试管,分别编号1、2、3,1号和2号试管为实验组,3号为对照组。分别向1号和2号试管中加入2.5 ml 1/15mol/L pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液,向3号试管中加入3 ml 1/15mol/L pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。向三支试管中加入30 μl底物α-乙酸萘酯醇溶液,置于37 ℃水浴锅中预热5 min,然后向1号和2号试管中加入0.5 ml适当稀释的酶液,反应5 min后,将三支试管取出,在冰浴条件下每支试管加入0.5 ml显色剂(1%坚固蓝B盐水溶液和5% SDS使用前2:5混合)溶液,充分摇匀后,静置5 min-10 min后,在分光光度计595 nm下测定其吸光度值。1个酶活单位(U/mL)定义为一定条件下,每分钟分解底物α-乙酸萘酯生成1 μmoL α-萘酚所需要的酶量。以β-乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力计算同α-乙酸萘酯。
2、重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适温度和热稳定性的测定:
酶的最适温度的测定:将羧酸酯酶D-1CarE5在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下,分别在20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃下进行酶促反应。温度稳定性的测定:将羧酸酯酶D-1CarE5在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下,在20 ℃、35 ℃和45 ℃三个温度下分别保温10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后进行酶促反应,以未处理的酶液作为对照。以α-乙酸萘酯为底物,反应5 min,测定纯化羧酸酯酶D-1CarE5的酶学性质。结果表明:D-1CarE5的最适温度40℃(图2);35 ℃以下保温50 min基本保持稳定(图3)。
3、重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适pH和 pH稳定性的测定:
酶的最适pH的测定:将羧酸酯酶D-1CarE5在最适温度40 ℃,分别在1/15 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液不同pH4.92、5.91、6.47、6.98、7.38、8.04和8.67条件下酶促反应。pH稳定性的测定:将羧酸酯酶D-1CarE5在最适温度40℃,在pH5.91、pH7.38和pH8.04下分别耐受20 min、40 min、60 min和80 min后进行酶促反应,以未处理的酶液作为对照。以α-乙酸萘酯为底物,反应5 min,测定纯化羧酸酯酶D-1CarE5的酶学性质。结果表明:D-1CarE5的最适pH7.38(图4);经1/15 mol/L pH5.91、pH7.38和pH8.04缓冲液下处理80 min,分别保持40%、90%和45%以上的活性(图5)。
4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D-1CarE5活性的影响:
在酶促反应体系中加入终浓度1 mM的金属离子及化学试剂,研究其对酶活性的影响。以α-乙酸萘酯为底物,在40 ℃、pH7.38条件下,反应5 min,测定纯化羧酸酯酶D-1CarE5的酶活力。结果(图6)表明,终浓度1 mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用,Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用。
5、重组羧酸酯酶D-1CarE5的动力学参数的测定:
在40 ℃、pH7.38条件下,以0.6 M α-乙酸萘酯为底物,依次在酶促反应的 1-30 min内终止反应并测定酶活性,计算出酶活性与反应时间的比值,若在一定时间内该比值保持稳定,则此时间为一级反应时间。用0.005-0.5 M α-乙酸萘酯为底物([S]),在40 ℃、pH7.38和一级反应时间下测定酶活,计算出相应的反应速度(ν),如图7,根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定,在40 ℃、pH7.38条件下,重组羧酸酯酶D-1CarE5对α-乙酸萘酯的Km和Vmax分别为0.948 mol和534.12U/mg。
6、重组羧酸酯酶D-1CarE5对底物β-乙酸萘酯的水解:
在60 ℃、pH7.0条件下,重组羧酸酯酶D-1CarE5对0.6 mol/L β-乙酸萘酯的比活力为14.78±0.01 U/mg。
序列表
SEQ ID NO.1:
MQSMLRVVKVENGFVRGLPAADPRITSFKGIPFAAPPVGENRWRAPQPAKDWDGVFDAYTFAPISMQSPIHHNESNIYGREWHVDPDTPMSEDCLYLNIWTPAHSPDEKLPVFVWYFGGGLQVGYTSEMEFDGERLARRGIVVVTVNYPLNVFGFLCHPEITAEAPEAPANFGHLDQQFATQWVKRNIAAFGGDPENITIGGQSAGGGSVLSQLTSPQNEGLVQRAIIQSGLFGRVYPGGRMPGYGRTLAEAEADGMQFFAFLGVSSLAEARQLDAFYIRDKALDYKGFWGTVVDDVFCMGDGFDLFVEGKHLQVSVLFGHTSDEFYSAPNVKDLDELKQMAVERFGDDAATYLALCEADAHDFEDVLKKATLHSLEFAIRTAVQASSNWKTQEPLYYYVFDAEIPGWDQPGAFHSVDLWFFFETLAKCWRPFVGKHYDLARQMCDYWANFIRSGDPNGKDMTGEDLPPWYPCTPDAPYAMVFDDEPKFVRQEPSPLMQFFVQEYFKQKQYIF
SEQ ID NO.2:
ATGCAAAGCATGCTGCGGGTCGTGAAGGTCGAGAACGGTTTCGTTCGGGGGCTCCCAGCAGCCGACCCTCGCATTACAAGCTTTAAGGGCATTCCCTTTGCAGCTCCGCCAGTCGGCGAAAATCGCTGGCGAGCTCCCCAGCCCGCAAAGGACTGGGACGGCGTATTCGACGCTTATACATTCGCACCGATTTCCATGCAATCACCCATACACCACAACGAAAGCAACATCTATGGTCGAGAGTGGCATGTCGATCCGGATACTCCCATGAGTGAGGATTGTCTCTATCTCAACATCTGGACGCCGGCACACAGCCCTGACGAAAAGCTTCCCGTGTTTGTTTGGTATTTCGGTGGCGGATTGCAGGTCGGTTACACATCTGAAATGGAGTTTGACGGCGAACGCCTCGCGCGCCGAGGAATCGTCGTGGTTACCGTCAACTATCCCCTCAACGTGTTTGGTTTTTTGTGTCATCCGGAGATTACCGCAGAAGCCCCCGAAGCTCCGGCTAATTTTGGACATCTCGATCAACAGTTTGCGACACAATGGGTCAAGCGCAATATCGCTGCATTCGGCGGCGATCCGGAGAACATCACGATTGGTGGCCAATCCGCTGGCGGTGGAAGTGTATTAAGCCAACTCACATCTCCCCAGAACGAAGGGCTCGTACAAAGGGCAATTATCCAAAGTGGACTGTTTGGCAGAGTTTATCCCGGCGGTCGTATGCCAGGTTATGGGAGAACACTGGCGGAAGCTGAAGCGGACGGAATGCAATTCTTTGCGTTTCTTGGCGTATCCTCCTTGGCCGAAGCCCGCCAGCTCGACGCTTTTTACATCCGTGACAAAGCGCTCGACTATAAGGGCTTCTGGGGGACTGTCGTGGATGACGTATTCTGCATGGGTGACGGATTTGATCTCTTTGTCGAGGGTAAACATTTACAGGTCTCCGTGCTTTTTGGTCACACGTCTGACGAATTTTACAGCGCCCCAAACGTCAAAGATTTAGATGAATTGAAGCAAATGGCCGTCGAACGTTTTGGTGATGATGCCGCAACATATCTTGCGCTTTGCGAAGCGGATGCACATGATTTCGAAGACGTTCTGAAAAAAGCCACACTCCATTCCTTGGAGTTTGCCATTCGCACCGCCGTGCAAGCCAGTAGCAACTGGAAGACGCAAGAACCATTGTACTATTACGTATTCGATGCAGAAATTCCGGGGTGGGATCAGCCAGGGGCCTTTCATTCGGTTGATCTGTGGTTTTTCTTCGAGACTCTGGCTAAGTGTTGGCGGCCGTTTGTCGGAAAACATTACGACTTGGCTCGCCAAATGTGCGATTACTGGGCCAACTTCATCCGTTCTGGAGATCCAAATGGGAAAGATATGACGGGTGAAGATTTGCCACCCTGGTATCCCTGCACACCCGATGCGCCATACGCCATGGTATTCGATGACGAGCCCAAATTTGTCCGACAAGAACCAAGTCCTCTTATGCAGTTCTTCGTGCAAGAGTACTTTAAGCAAAAACAGTACATTTTCTGA
Claims (4)
1.一种羧酸酯酶D-1CarE5,其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的羧酸酯酶D-1CarE5的羧酸酯酶基因D-1CarE5,其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含权利要求2所述羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组菌株。
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