CN107602666A - 一种硫酯订书肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硫酯订书肽，其特征在于，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，

Description

一种硫酯订书肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，具体涉及一种硫酯订书肽及其制备方法与应用。

背景技术

α-螺旋结构是自然界中存在的一种重要的蛋白质表位，生物体内许多重要的蛋白-蛋白相互作用以及蛋白的识别都是由α-螺旋结构介导的。α-螺旋构象锁定多肽(一般为通过化学手段锁定α-螺旋构象的多肽)是调控细胞内的PPIs的重要工具分子，发展α-螺旋构象锁定多肽策略不仅能为以PPIs为靶点药物设计提供新的活性分子，还能为某一蛋白的功能和结构研究提供分子探针。一方面，构象锁定多肽能够通过非天然化学键绑定多肽抵御蛋白酶的降解，达到提高体内稳定性的效果。另一方面，多肽药物的一大软肋是很难直接透过细胞膜与胞内靶蛋白发生作用，而构象锁定多肽通过稳定α-螺旋以及引入部分疏水侧链(两大透膜关键因素)来提高多肽自身的透膜能力，从而达到靶向治疗的目的。目前α-螺旋构象锁定多肽的主流方法为侧链引入连接臂合成策略，包括烯烃复分解法、Click法、硫醚法、酰胺键法、光控法等等。然而，产物异构化、水溶性差及依赖固相环合等问题限制了这些策略在实践中的应用，为解决这些问题，我们急需开发更具实用性和普适性的α-螺旋构象锁定策略。

许多重要的生物过程的调节都通过蛋白-蛋白相互作用来实现的。一般，蛋白-蛋白作用的界面太大而不能被小分子药物选择性靶向，因此小分子药物很难高效特异性地阻断该类型的相互作用。此外，由于蛋白质药物很难透过细胞膜，它们也不能直接靶向细胞内的相互作用。由于当前药物分子的限制，发展下一代既能进入细胞膜又能特异性靶向蛋白-蛋白相互作用的分子成为新的研究热点。为了克服上述药物分子的缺点，Verdine等发展了一种全碳支架的具有α-螺旋结构的新型多肽，这种多肽被称作订书肽(stapledpeptides)。相比于天然多肽，订书肽有更高的酶解稳定性并且可以进入细胞膜，从而提高了它的药理性能。

二硫代氨基甲酸酯类化合物(dithiocarbamates，DTCs)作为一类广泛存在的有机分子，具有多种官能团和杂原子，从而拥有较强的金属键合能力，能够有效地螯合重金属和清除体内NO自由基，还可以作为单功能性诱导物，选择性增强二相酶活性，对生物***产生深远的影响。因此，不同的DTCs衍生物表现出诸多生物学和药学等方面的特性，有些不仅具有优秀的抗炎抗菌抗氧化抑制心脏过度肥大等活性，最近还被报道为有效的抗癌药物和细胞凋亡的抑制剂。由于DTCs类化合物高效、低毒及易合成等优点使其已成为当前药物化学领域研究的热点，但是DTCs在α-螺旋构象锁定多肽中的应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术中多肽构象锁定策略中的缺点，本发明的目的在于公开一种硫酯订书肽，以及制备硫酯订书肽的方法或者说是一种多肽构象锁定策略。

本发明的硫酯订书肽，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，

式(I)和式(II)中，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。

本发明中，式(I)和式(II)分别简化表示为：

优选的，本发明的硫酯订书肽则可表示为：

其中，n、m为整数，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。

较佳的，n为0～20的整数，m为0～20的整数。

进一步的，n+m＝3～20。

更进一步的，n+m＝3～10。

优选的，本发明的硫酯订书肽为下列各式中的一种，

本发明的硫脂订书肽侧链形成二硫代氨基甲酸酯链接臂，可稳定多肽的α-螺旋构象。

本发明的制备硫酯订书肽的方法包括步骤：

(a)以含有赖氨酸且离赖氨酸四位含有丝氨酸或半胱氨酸的直链肽为原料，在2,5-二溴己二酰胺的作用下，直链肽上的半胱氨酸发生消除反应转化为脱氢丙氨酸；

(b)经步骤(a)转化后的直链肽在碱的作用下与CS₂反应得到α-螺旋构象锁定的硫酯订书肽。

较佳的，步骤(a)可具体为：将直链肽溶于缓冲液B中，然后缓慢滴入溶解有1.3～2倍直链肽重量的2,5-二溴己二酰胺的缓冲液A中，室温反应完全后，分离纯化得到转化后的直链肽；其中缓冲液A含有4～8M盐酸胍，100～200mM Na₂HPO₄，pH＝8.5；缓冲液B含有4～8M盐酸胍，100～200mMNaH₂PO₄，pH＝2.5；缓冲液A与缓冲液B体积比为10～20：1。

较佳的，步骤(b)可具体为：将经步骤(a)转化后的直链肽溶解于甲醇中，加入有机碱Et₃N和CS₂，室温反应完全后，分离纯化得到α-螺旋构象锁定的硫酯订书肽。

本发明制备硫酯订书肽的过程(多肽构象锁定策略)如图1所示，其中直链肽可通过多肽固相合成法(SPPS)高产率地得，随后在液相中实现半胱氨酸(Cys)到脱氢丙氨酸(Dha)的高效率转化，最终利用DTC反应实现液相中的环化，高效绿色地获得α-螺旋构象锁定多肽。

在研究硫酯订书肽的制备方法(多肽构象锁定策略)的过程中，本发明首先选择表1所示的不同长度的多肽序列进行多肽侧链DTC反应的条件摸索，其中G为甘氨酸，X为脱氢丙氨酸(Dha)，Y为赖氨酸(Lys)或鸟氨酸(Orn)。其中，多肽1a用来考察在i，i+4环合策略，1b用以考察i，i+7环合策略。通过对氨基酸的替换和反应条件的优化，最终确立了在多肽侧链进行DTC反应制备i，i+4硫脂订书肽的方法学。

表1

建立了i，i+4硫脂订书肽的方法学之后，我们尝试将该策略应用到^17-28p53(QETFSDLWKLLP)上，利用该序列中本身包含的Lys，我们将距离Lys四位的Ser残基突变为Dha，便于进行液相中的环化。为了考察环合侧链的长度问题，我们以表2所示的多肽进行DTC反应，分别尝试了Lys，Orn，Dap，Dab四个不同长度的带有氨基侧链的氨基酸。

表2

通过液相中的反应结果分析，只有p53-SP-1成功地进行了基于DTC反应的环化，得到下式所示的α-螺旋构象锁定多肽，相应的MS和HPLC分析验证进一步验证了我们设立的方法学的可行性。

分子式：C₇₃H₁₀₆N₁₆O₁₉S₂；

相对分子量理论值：1574.7262；测定MS:[M+H]⁺1575.7306。

随后，本发明以PMI(TSFAEYWNLLSP)为修饰对象，对除Phe-3，Trp-7，Leu-10三个关键残基之外的9个残基进行i,i+4的基于DTC反应的构象锁定，设计了前述的PS1-1-3到PS5-2-3等多种新型硫脂订书肽。

本发明的有益效果在于：

本发明首次将DTC合成反应引入到α-螺旋构象锁定多肽的制备中，通过在肽段侧链形成二硫代氨基甲酸酯链接臂以稳定多肽的α-螺旋构象，达到构象锁定的目的。该多肽构象锁定策略可有效避免产物异构化、水溶性差及依赖固相环合等问题。

基于DTC反应的硫脂订书肽首先能够稳定α-螺旋构象，即在与MDM2和MDMX的结合能力上与母肽相比能有明显的提升。其次，该类硫脂订书肽与直链肽相比能够在酶稳定性上得到改善，进而提高MDM2和MDMX的多肽类拮抗剂的生物利用度。最后，该硫脂订书策略的应用能够改善多肽药物的透膜能力，体现在这个案例中即为得到的硫脂订书肽能够透过肿瘤细胞膜，从而靶向作用于MDM2和MDMX，达到抑制肿瘤的作用。

附图说明

图1为制备硫酯订书肽的过程(多肽构象锁定策略)示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1硫酯订书肽合成

原料

缓冲液A：6M盐酸胍，100mM Na₂HPO₄，pH＝8.5；

缓冲液B：6M盐酸胍，100mM NaH₂PO₄，pH＝2.5；

表3直链肽

表3所示各直链肽可通过多肽固相合成法(SPPS)制备。

下面以直链肽PS1-1-1制备硫酯订书肽为例进行具体描述，其余直链肽制备硫酯订书肽的操作相同。

合成路线：

合成步骤：

(a)Cys脱除为Dha

将直链肽PS1-1-1(50mg)溶于缓冲液B(3mL)中，然后缓慢滴入溶解有2,5-二溴己二酰胺(75mg)的缓冲液A(47mL)中，室温搅拌过夜，HPLC检测反应完全后，经制备液相纯化后冻干得到Cys脱除为Dha的直链肽PS1-1-2。

(b)基于DTC反应的二硫代氨基甲酸酯侧链的引入

称量步骤(a)中Cys脱除为Dha的直链肽(30mg)溶解于甲醇(30mL)中，加入Et₃N(1mL)和CS₂(1mL)，室温搅拌过夜，HPLC检测反应完全后，经制备液相纯化后冻干得到目标产物硫酯订书肽PS1-1-3(10mg，产率多少33％)。(MS 1512)

通过上述步骤由表3中的各直链肽可分别制备下列硫酯订书肽

上述各硫酯订书肽可看成是以PMI(TSFAEYWNLLSP)的修饰产物，对除Phe-3，Trp-7，Leu-10三个关键残基之外的9个残基进行i,i+4的基于DTC反应的构象锁定。

实施例2荧光偏振结合实验

首先将TAMRA-NHS(四甲基罗丹明-N-羟基硫代琥珀酰亚胺)通过共价键链接到PMI(TSFAEYWNLLSP)的N端氨基上，得到了一个以TAMRA为荧光基团的荧光标记肽PMI-TAMRA，随后测定PMI-TAMRA与MDM2和MDMX的结合常数分别为0.62nM和0.72nM。为了验证该方法的特异性，测定未用荧光标记的PMI对PMI-TAMRA和MDM2或MDMX的复合体系的竞争性结合常数K_i。此外，作为对照，同时测定Nutlin-3对MDM2或MDMX的竞争结合常数K_i，分别为5.1nM和1.54μM，这与文献报道的K_i数值基本一致。K_i越小，说明结合能力越高，也说明本发明修饰后的多肽PMI比Nutlin-3的结合能力要好。

竞争结合常数K_i的测定具体为：将溶解于DMSO中的不同浓度的化合物(25μL)加入到盛有50μL的MDM2或MDMX(50nM)的96孔板中，随后加入50μL PMI-TAMRA(10nM)。检测终体积为125μL，测量缓冲液为PBS(pH＝7.4)，96孔板为Corning-3993平底黑孔板。孵育半个小时后在Tecan M-1000多孔板酶标仪中测定偏振值(FP)读数，激发波长为530nM，发射波长为580nM。使用GraphPad Prism软件进行曲线拟合并计算K_i值。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种硫酯订书肽，其特征在于，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，

式(I)和式(II)中，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。

2.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，其为：

其中，n为0～20的整数，m为0～20的整数，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。

3.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，n+m＝3～20。

4.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，n+m＝3～10。

5.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，其为下列各式中的一种：

6.一种制备硫酯订书肽的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)以含有赖氨酸且离赖氨酸四位含有丝氨酸或半胱氨酸的直链肽为原料，在2,5-二溴己二酰胺的作用下，直链肽上的半胱氨酸发生消除反应转化为脱氢丙氨酸；

(b)经步骤(a)转化后的直链肽在碱的作用下与CS₂反应得到α-螺旋构象锁定的硫酯订书肽。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)具体为：将直链肽溶于缓冲液B中，然后缓慢滴入溶解有1.3～2倍直链肽重量的2,5-二溴己二酰胺的缓冲液A中，室温反应完全后，分离纯化得到转化后的直链肽；其中缓冲液A含有4～8M盐酸胍，100～200mM Na₂HPO₄，pH＝8.5；缓冲液B含有4～8M盐酸胍，100～200mM NaH₂PO₄，pH＝2.5；缓冲液A与缓冲液B体积比为10～20：1。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(b)具体为：将经步骤(a)转化后的直链肽溶解于甲醇中，加入有机碱Et₃N和CS₂，室温反应完全后，分离纯化得到α-螺旋构象锁定的硫酯订书肽。

9.如权利要求1所述的硫酯订书肽在药物中的应用。

10.如权利要求1所述的硫酯订书肽在抗肿瘤药物中的应用。