CN109438424B - 利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。所述利巴韦林半抗原的结构如式(I)或式(II)所示：
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
利巴韦林(Ribavirin，RBV)，又称病毒唑、三氮唑核苷，是一种合成的嘌呤核苷类似物。1972年由美国ICN公司研究开发，1974年于墨西哥首次上市，1980年我国正式批准投产。利巴韦林是一种广谱抗病毒药，对多种RNA病毒和DNA病毒有抑制作用，甲型、乙型流感病毒最敏感，作用机制是其在体内代谢为利巴韦林基团(1,2,4-***-3-羧酰胺)，该产物可以抑制病毒聚合酶，干扰病毒RNA的合成，从而阻断病毒的复制。此外，利巴韦林还可以诱导T细胞表型转化，从而增强T细胞介导的体液免疫反应。
利巴韦林在发挥广泛的抗病毒作用同时，其毒副作用也日益受到关注，长期以来，为了预防畜禽流感，利巴韦林也被广泛应用于畜禽养殖过程中。为了保证人类用药安全和动物防疫安全，2005年农业部发布第560号公告，禁止利巴韦林、金刚烷胺、吗啉胍等抗病毒药物在动物养殖中使用。然而利巴韦林在畜禽养殖过程违规使用的现象仍然普遍存在，畜禽产品质量安全受到一定的威胁。
目前，利巴韦林的检测手段主要为液相色谱(LC)、液质联用(LC-MS/MS)方法，但由于大型仪器价格昂贵、操作复杂、便携性差，难以实现生产一线的检测，严重制约了对于利巴韦林使用的有效监管。基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析技术，具有检测速度快，成本低的优点，因此设计免疫半抗原分子，开发一种简单、快捷、用于检测利巴韦林的抗体显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供利巴韦林半抗原，其结构如式(I)或式(II)所示：
第二方面，本发明提供所述半抗原的制备方法，当所述利巴韦林半抗原为式(I)所示化合物时，制备方法包括如下步骤：
1)将48.0g利巴韦林、6.17g对甲苯磺酸和39.2mL 2,2-二甲氧基丙烷溶于500mL丙酮中，混合液在60℃反应3h；加入1mL 5％的碳酸氢钠终止反应；清除沉淀后，收集和浓缩滤液，经柱层析纯化后得到式(III)化合物；
2)将35.0g对氟苯甲酸、15.0g二甲氨基吡啶溶于500mL叔丁醇中冷却至0℃；向混合液中添加107.50g二碳酸二叔丁酯，然后在室温下搅拌16h，得到无色油状产物，将该无色油状产物与15.0g式(III)化合物和60.0g碳酸铯溶于300mL二甲基亚砜中，110℃持续加热16h；二甲基亚砜通过减压蒸馏除去；向残余物中加入200mL水，使用二氯甲烷萃取，并用硫酸钠干燥后浓缩，残余物通过柱层析进行净化，将得到的6.0g白色固体状产物在室温下溶解于盐酸和四氢呋喃的混合液100mL中，搅拌16h，用碳酸氢钠调pH至7-9，过滤混合物后得到粗产物；粗产物进一步与甲醇结晶，即得。
其中，步骤2)进行柱层析所用流动相由甲醇和二氯甲烷按50:1体积比混合而成，所用固定相为200-300目的硅胶。
所述盐酸和四氢呋喃的混合液是由四氢呋喃和浓度12mol/L的盐酸按9:1体积比混合而成。
当所述利巴韦林半抗原为式(II)所示化合物时，制备方法如下：
将1.0g利巴韦林放入100mL二颈瓶中，加入丙酮20mL，室温搅拌10min，投入50mg对甲苯磺酸，60℃反应4h，将反应体系旋干后,残余物用柱层析进行净化，得到白色固体状产物加入微波管中，加入3mL吡啶，室温搅拌10min，投入丁二酸酐426mg，120℃反应20min，将反应体系旋干后柱层析纯化后得到的产物转移至100mL烧瓶中，加入15mL吡啶，室温搅拌10min，投入5mL三氟乙酸，50℃反应12h，将反应体系旋干，即得。
其中，进行柱层析所用流动相是由甲醇和二氯甲烷按1:20体积比混合而成，所用固定相为200-300目的硅胶。
第三方面，本发明提供利巴韦林人工抗原，是由所述利巴韦林半抗原与载体蛋白偶联后得到。所述利巴韦林人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白。
第四方面，本发明提供所述人工抗原的制备方法，采用活化酯法将载体蛋白偶联于权利要求1所述半抗原的羧基碳上。
优选地，式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为9.6:1。式(II)所示化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为7.0:1。
第五方面，本发明提供由所述利巴韦林人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。所述多克隆抗体可通过利巴韦林人工抗原免疫实验动物(如新西兰大白兔)，收集血清纯化获得。
第六方面，本发明提供所述利巴韦林半抗原或所述利巴韦林人工抗原的以下任一应用：
①在制备抗利巴韦林特异性抗体中的应用；
②在检测抗利巴韦林特异性抗体中的应用。
第七方面，本发明提供由所述特异性抗体制备的利巴韦林检测试剂或试剂盒。
第八方面，本发明提供所述特异性抗体的以下任一应用：
(1)在检测利巴韦林中的应用；
(2)在制备利巴韦林的免疫层析试纸条中的应用；
(3)在制备利巴韦林的胶体金检测试纸条中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次公开了两种新的利巴韦林半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述利巴韦林人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的利巴韦林半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的利巴韦林检测方法提供了新手段。
利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备利巴韦林抗体(多抗)，制备过程简单、经济，抗体的检测灵敏度可达0.31ng/mL、实用价值高。本发明在兽药残留检测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中式(I)所示利巴韦林半抗原制备的流程图。
图2为本发明实施例1中式(II)所示利巴韦林半抗原制备的流程图。
图3为本发明实施例1中式(I)所示利巴韦林半抗原的质谱图。
图4为本发明实施例1中式(II)所示利巴韦林半抗原的质谱图。
图5为本发明实施例1中式(I)所示利巴韦林半抗原的核磁谱图。
图6为本发明实施例1中式(II)所示利巴韦林半抗原的核磁谱图。
图7为本发明实施例2中式(I)所示利巴韦林半抗原制备的人工抗原结构图。
图8为本发明实施例2中式(II)所示利巴韦林半抗原制备的人工抗原结构图。
图9为本发明实施例2中RBV①-BSA的MALDI-TOF-MS图。
图10为本发明实施例2中RBV②-BSA的MALDI-TOF-MS图。
图11为本发明实施例4中利用多克隆抗体检测利巴韦林的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写。DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写。NHS、EDC、牛血清白蛋白(Albuminfrombovine serum,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。柱层析所用固定相均为200-300目的硅胶。
实施例1利巴韦林半抗原的制备和表征
一、利巴韦林半抗原的制备
1、式(I)所示利巴韦林半抗原的制备
将48.0g利巴韦林、6.17g对甲苯磺酸和39.2mL 2,2-二甲氧基丙烷溶于500mL丙酮中，混合液在60℃反应3h。加入1mL 5％的碳酸氢钠终止反应。清除沉淀后，收集和浓缩滤液。柱层析纯化后得到式(III)所示中间产物。
将35.0g对氟苯甲酸、15.0g二甲氨基吡啶溶于500mL叔丁醇中冷却至0℃。在混合液中添加107.50g二碳酸二叔丁酯，然后在室温下搅拌16h。用柱层析法净化，得到一种无色油状产物，将油状产物与15.0g式(III)所示中间产物和60.0g碳酸铯溶于300mL二甲基亚砜中，110℃持续加热16h。二甲基亚砜通过减压蒸馏除去。在残余物中加入200mL水，使用二氯甲烷萃取，并用硫酸钠干燥后浓缩，残余物通过流动相为甲醇/二氯甲烷(体积比50:1)的柱层析进行净化，将得到6.0g白色固体状产物在室温下与盐酸/四氢呋喃(12mol/L浓盐酸10ml和四氢呋喃90ml)的混合液搅拌16h。用碳酸氢钠调pH＝9，过滤混合物后得到粗产物。粗产物进一步与甲醇结晶3次，得到2.6g白色固体状的纯产物，即为式(I)所示的利巴韦林半抗原，收率55％。具体合成路线见图1。
2、式(II)所示利巴韦林半抗原的制备
称取1.0g利巴韦林放入100ml二颈瓶中，加入丙酮20mL，室温搅拌10min，投入50mg对甲苯磺酸，60℃反应4h，将反应体系旋干后,残余物通过流动相为甲醇/二氯甲烷(体积比1:20)的柱层析进行净化，得到白色固体状产物加入微波管中，加入3mL吡啶，室温搅拌10min，投入丁二酸酐426mg，120℃反应20min，将反应体系旋干后柱层析纯化后得到的产物加于100mL烧瓶中，加入15mL吡啶，室温搅拌10min，投入5mL三氟乙酸，50℃反应12h，将反应体系旋干得到目标产物即为式(II)所示的利巴韦林半抗原。具体合成路线见图2。
二、利巴韦林半抗原的表征
1、质谱鉴定
步骤一的式(I)所示利巴韦林半抗原(分子式为C15H16N4O7)的质谱鉴定结果:MS m/z[M+H]+理论值:364.3；实测值:365.0，与目标产物的分子量相吻合，质谱见图3。
步骤一的式(II)所示利巴韦林半抗原(分子式为C12H16N4O8)的质谱鉴定结果:MSm/z[M+H]+理论值:344.3；实测值:343.1，与目标产物的分子量相吻合，质谱见图4。
2、核磁共振鉴定
步骤一的式(I)所示利巴韦林半抗原的核磁鉴定结果:1H NMR(400MHz,CDCl3),1.35(s,3H),1.52(s,9H),1.53(s,3H).4.16-4.27(m,2H),4.60-4.63(m,1H),5.08-5.10(m,1H),5.30(d,J＝2H,1H),6.33(s,1H),6.91(d,J＝7.2Hz,2H),7.70(s,br,1H),7.79(d,J＝8.8Hz,2H),8.01(s,br,1H),8.79(s,1H).核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，磁共振鉴定结果见图5。
步骤一的式(II)所示利巴韦林半抗原的核磁鉴定结果:1H NMR(400MHz,CD3OD)，δ8.68(s,1H),5.93(s,4H),4.55-4.54(m,1H),4.46-4.39(m,2H),4.26-4.25(m,2H),2.59(brs,4H).核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，磁共振鉴定结果见图6。
实施例2利巴韦林人工抗原的制备和表征
所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，所述免疫原载体蛋白主要采用KLH，所述包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为活泼酯法。由式(I)和式(II)所示利巴韦林半抗原制备的人工抗原结构见图7、图8。
一、利巴韦林包被原的合成和鉴定
1、利巴韦林包被原的制备
(1)将20mg实施例1制备得到的(I)所示化合物溶于2mL DMF中，加入10mg NHS和10mg DCC，室温下搅拌过夜，得到溶液I。
(2)将7mg BSA加入7mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II。
(3)将溶液I缓慢滴加至溶液II中，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，得到利巴韦林包被原溶液，-20℃保存。式(I)所示化合物合成的利巴韦林包被原简称RBV①-BSA。
(4)使用上述三步同样的方法制备式(II)所示化合物合成的利巴韦林包被原，简称RBV②-BSA。
2、利巴韦林包被原的鉴定
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)法分别测定RBV①-BSA溶液和RBV②-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图9、图10。
结合比＝{M(偶联物)-M(蛋白质)}/M(半抗原)
BSA的分子量为65700.3，式(I)半抗原的分子量为364.3，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为69212.9，经计算得出BSA与半抗原的结合比为9.6，即RBV①-BSA中一个BSA分子上平均偶联9.6个半抗原。
式(II)半抗原的分子量为344.3，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为68119.3，经计算得出BSA与半抗原的结合比为7.0，即RBV②-BSA中一个BSA分子上平均偶联7.0个半抗原。
二、利巴韦林免疫原的合成
1、利巴韦林免疫原的制备
用KLH代替BSA，其它同步骤二的1。
式(I)和式(II)所示化合物合成利巴韦林免疫原分别简称RBV①-KLH，RBV②-KLH。
实施例3利巴韦林抗血清的制备
将实施例2制备的RBV①-KLH，RBV②-KLH溶液分别免疫2组3-4月龄，体重1.5-2.0kg的雌性新西兰大白兔，每组2只。将各免疫原用生理盐水稀释至1mg/mL，与等量弗氏佐剂乳化。首免采用弗氏完全佐剂，颈背部皮内多点注射，免疫剂量为1mg/只。4周后进行加强免疫，每隔4周加免1次，共加免3次，佐剂改为弗氏不完全佐剂，免疫剂量不变，改为颈背部皮下多点注射。第4次免疫1周后，用心脏采血的方法大量采血。取血后，将血液37℃静置2h，然后4℃静置过夜，然后3000rpm离心20min，收集上清液，即为抗血清，-20℃分装保存。
实施例4利巴韦林抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测抗血清效价，具体操作步骤如下：
1)包被：将实施例2中的抗原用0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始进行倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
2)洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
4)加样：将抗血清从1:1000开始进行倍比稀释，并加入到各种稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
6)终止和测定:每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
7)结果判读：以OD450值≥阴性对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
1)用上述的间接ELISA方法确定以RBV①-BSA作为包被原，以RBV①-KLH免疫兔子获得的血清作为抗体，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
2)包被：将包被原用包被缓冲液稀释20000倍，100μL/孔，37℃反应2h。
3)洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。
4)配利巴韦林标准溶液：将利巴韦林标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成5mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度(RBV的浓度分别为0.005ng/mL、0.05ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、50ng/mL)。
5)加样：每孔加入50μL倍比稀释的利巴韦林各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
6)显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
7)终止和测定:每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
8)数据处理：以利巴韦林各浓度的对数为横坐标，以利巴韦林各浓度对应的OD值为纵坐标，使用Origin 8.5软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线，如图11所示，通过计算IC50值(半数抑制浓度)判定抗血清对利巴韦林是否具有特异性。
结果显示，四免后，兔子抗血清效价可达50000，检测限为0.02ng/mL，IC50值为0.31ng/mL，线性检测范围为0.06-1.67ng/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (11)
1.利巴韦林半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：
2.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将48.0g利巴韦林、6.17g对甲苯磺酸和39.2mL 2,2-二甲氧基丙烷溶于500mL丙酮中，混合液在60℃反应3h；加入1mL 5％的碳酸氢钠终止反应；清除沉淀后，收集和浓缩滤液，经柱层析纯化后得到式(III)化合物；
2)将35.0g对氟苯甲酸、15.0g二甲氨基吡啶溶于500mL叔丁醇中冷却至0℃；向混合液中添加107.50g二碳酸二叔丁酯，然后在室温下搅拌16h，得到无色油状产物，将该无色油状产物与15.0g式(III)化合物和60.0g碳酸铯溶于300mL二甲基亚砜中，110℃持续加热16h；二甲基亚砜通过减压蒸馏除去；向残余物中加入200mL水，使用二氯甲烷萃取，并用硫酸钠干燥后浓缩，残余物通过柱层析进行净化，将得到的6.0g白色固体状产物在室温下溶解于盐酸和四氢呋喃的混合液100mL中，搅拌16h，用碳酸氢钠调pH至7-9，过滤混合物后得到粗产物；粗产物进一步与甲醇结晶，即得；
其中，步骤2)进行柱层析所用流动相由甲醇和二氯甲烷按50:1体积比混合而成，所用固定相为200-300目的硅胶；所述盐酸和四氢呋喃的混合液是由四氢呋喃和浓度12mol/L的盐酸按9:1体积比混合而成。
3.利巴韦林人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述利巴韦林半抗原与载体蛋白偶联后得到；
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
4.根据权利要求3所述的利巴韦林人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
5.权利要求3或4所述人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活化酯法将载体蛋白偶联于权利要求1所述半抗原的羧基碳上。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为9.6:1。
7.权利要求1所述半抗原或权利要求3或4所述人工抗原的以下任一应用：
①在制备抗利巴韦林特异性抗体中的应用；
②在检测抗利巴韦林特异性抗体中的应用。
8.由权利要求3或4所述人工抗原制备的特异性抗体，所述特异性抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体为多克隆抗体。
10.由权利要求8或9所述特异性抗体制备的利巴韦林检测试剂或试剂盒。
11.权利要求8或9所述特异性抗体的以下任一应用：
(1)在检测利巴韦林中的应用；
(2)在制备利巴韦林的免疫层析试纸条中的应用；
(3)在制备利巴韦林的胶体金检测试纸条中的应用。
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