CN103408641B - ***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。本试剂盒使用化学合成VP1抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在***病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。

Description

***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是***病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
***(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是世界范围内广泛分布，在国际间传播蔓延的全球性流行性传染病。国际兽医局(OIE)在1984年修订的动物传染病分类中将***列为A类传染病之首。***是由***病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）感染引起偶蹄动物的一种高度接触性人畜共患传染病。其特点是发病急、传播快、传染率高，造成畜群生产性能迅速下降，给畜牧业生产造成巨大经济损失，严重制约经济发展。***发病的主要症状为：口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、***等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后导致繁殖力降低；猪则以破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。***传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。同时会引发流行国家或地区动物及动物产品的市场流通，并使其国际贸易受到及大的封锁和限制，给流行国家和地区的畜牧业生产造成了巨大经济的损失。因此***历来受到各国政府的高度重视。
***病毒属于小核糖核酸病毒科，***病毒属。由“假”20面体对称的衣壳和病毒核酸构成，该病毒粒子的整个外形是球形，不是严格的正20面体。完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，衣壳由VP1,VP2，VP3和VP4等4种结构蛋白各60个分子组成。研究表明，结构蛋白VP1是诱导产生中和抗体的主要成分，它暴露在病毒粒子的表面。
目前，***的防治主要依靠疫苗免疫。我国对***施行强制性免疫，每年春秋进行一次集中免疫，两次之间对新补栏家畜及时进行补免。在实际生产中如何鉴别诊断易感动物是进行了疫苗免疫还是感染了***病毒对***防疫体系的建立、检验检疫都是十分重要的。世界各国也在该领域开展了广泛的研究。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测易感动物猪、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常规方法之一。
***是关系到国家经济安全的重大动物疫病，相关关键技术应该牢牢掌握在自己手里。一旦我们拥有自主知识产权，将利于保障我国的经济安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的用于诊断***易感动物猪是否感染***病毒的***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。
本发明还提供提供***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为由序列表中序列1所示的多肽或者序列表中序列2所示的多肽。
本发明的***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。
所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽的质量比为0.5-2.0：1，优选为1:1。所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有***病毒结构蛋白VP1的主要抗原位点，可与***病毒感染后产生的结构蛋白VP1抗体特异结合。
所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG；所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，更优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体）。
所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。
所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的板的最佳制备条件是：将所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH9.4的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37℃放置2-4小时，再4-8℃下放置过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1%（g/ml）牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理1-2小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.05%(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.02%(g/ml)的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无***抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清；
所涉及的阳性对照血清是具体是已上述人工化学合成的包被抗原作为免疫原，免疫25-35日龄无特定病源体（SPF）猪，制备高免血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。
所涉及的阴性对照血清是用无***抗体的正常猪血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。
所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有3%(g/ml)BSA的0.15M、pH为7.4的PBS缓冲液（过0.45μm滤膜）；浓缩洗涤液：0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％(ml/ml)Tween-20和0.05％（g/ml）叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液（经过0.2μm滤膜除菌）。
所述试剂盒还包括说明书，所述说明书可以记载如下内容：
本发明试剂盒的检测程序为：
1、平衡：将保存在4℃的试剂盒取出，平衡至室温备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加100μl样本稀释液，分别加入5μl待测样本。
5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl步骤2中得到的洗涤缓冲液，浸泡15秒，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100μl辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。
9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15秒，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
11、显色每孔分别加入100μl的底物显色液（其中溶液I和溶液II的以体积比为1：1的比例混合）。加盖，37℃恒温箱里反应15min；
12、每孔分别加入50μl终止液终止反应，混匀；
13、测定每孔的OD450值（加终止液的反应板应在15分钟内读取OD450值）。
上述说明书中也可以记载如下内容：
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450平均值应该≤0.2，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在0.6-1.8之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值=0.23×阳性对照OD450值平均值。
样品OD450值＜临界值，则初步检测为FMDV阴性；样品OD值≥临界值，则初步检测为FMDV阳性，需重新检测。重检时每重检样品平行2次。重检后若两孔均为FMDV阴性，则判断为FMDV阴性；若任一孔为阳性，则判断为FMDV阳性。
上述试剂盒在制备检测是否感染动物***病毒病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；其中，动物***病毒病为猪***病毒病；具体为猪O型***病毒引起的猪***病毒病；更具体为猪***OR/80病毒引起的猪***病毒病。
本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从VP1蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板以及制备试剂盒中的阳性对照血清。由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，特异性强，灵敏度高，因此可以有效地检测***结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染***病毒。实验结果表明，试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。
本检测试剂用猪***病毒VP1结构蛋白合成肽抗原包被聚苯乙烯微孔板，配以辣根酶标记的兔抗猪IgG抗体和TMB底物液等试剂，应用间接法检测血清样本中猪***病毒VP1结构蛋白抗体，与猪***病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒联用，可区分***病毒感染动物及疫苗免疫动物。
采用人工合成结构蛋白VP1主要抗原位点的肽段作为包被抗原包被酶联反应板。显著不同于现有的利用基因工程方法取得的结构蛋白包被抗原，不含其它杂蛋白，抗原纯度高，特异性强，灵敏度高。可以有效地检测***病毒感染后产生的结构蛋白VP1抗体，以判断被检动物是否感染***病毒。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
本试剂盒内含有用人工化学合成的多肽***病毒结构蛋白VP1包被的聚苯乙烯微孔板，羊抗猪IgG抗体辣根酶结合物，血清样品稀释液，浓缩洗涤液，阴性对照血清，阳性对照血清，显色底物A,显色底物B，显色终止液，血清稀释板，和等组分。本试剂盒使用化学合成VP1抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在***病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。
本发明所涉及的***病毒结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于检测动物是否感染***病毒，有利于减少我国***爆发所带来的损失，也有利于我国***防控体系的建立。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备
本试验针对国内***流行毒株的不同，采用生物信息学方法对***病毒O型VP1结构蛋白多个亚型进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出根据流行毒株序列设计的2条肽，序列分别为序列表中序列1和序列中序列2所示，制成纯度约90%的更新更全的包被抗原，能够适应***病毒不断突变的特性，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的两个多肽，作为本发明试剂盒的包被原。
本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用RinkAmide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
一、包被抗原固相合成
1、合成试剂的准备
合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸（购自NOVA公司），加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM（已酰咪唑）、35％的PIP（哌啶）、100％的MeOH（甲醇）等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，***表压是否正常（433A正常表压10.2psi）。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、ModuleA）—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求（具体检测要求见下表1）。
表1.多肽合成仪流速检测标准表
试剂 瓶号 Module 标准范围
35％Piperidine 1 A 1.0-1.2ml
3％AIM 4 D 1.0-1.2ml
100％MeOH 9 I 3.5-4.0ml
DIC 8 I 0.45-0.55g
100％NMP 10 A 2.6-2.8ml
3、包被抗原合成开始
在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc1.0Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc1.0Sol DIC90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。
4、包被抗原合成进行
Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶（PIP）进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并***（1-hydroxybenzotriazole，HOBT）至反应器内。
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤（合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2）。期间观察记录试剂用量及运行情况。
表2.包被抗原合成循环步骤
5、包被抗原合成结束
包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂（肽现在还连接在树脂上）基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100%甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、包被抗原的裂解及鉴定
1、多肽抗原的裂解
经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：
从冰箱内取出合成的多肽树酯（指肽还连接在树脂上），放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸（Trifluoroacetic acid,TFA）、10ml的三丙基硅烷（TIS）和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1小时至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30至120分钟除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨（DMF）多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。
2、包被抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法（MODAL-TOF）和反相高压液相色谱法（RP-HPLC）进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。
3、包被抗原纯化
将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤（用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵），多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
4、包被抗原冷冻干燥
为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制备
***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：
（1）包被有***病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
（2）辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体（购自sigma公司，货号A5670），2瓶（各12ml）。
（3）阳性对照血清：是以实施例1中人工化学合成的包被抗原作为免疫原，免疫25-35日龄无特定病源体（SPF）猪制备的高免血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。1管（1ml）。
（4）阴性对照血清：是用无***抗体的正常猪血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。1管（1.5ml）。
（5）底物显色液：由两种溶液混合组成，溶液I为0.02mg/ml的四甲基联苯胺（TMB）溶液（1瓶（12ml））；溶液II为含0.05%过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液（1瓶（12ml）），使用时两者以体积比为1：1的比例混合。
（6）浓缩洗涤液（20×）：0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％（ml/ml）Tween-20和0.05％（g/ml）叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液，pH为7.4，后经过0.2μm滤膜除菌。50ml/瓶，2瓶。
（7）终止液：2mol/L的硫酸溶液。1瓶（12ml）
（8）样品稀释液：含有3%（g/ml）BSA的0.15M、pH为7.4的PBS缓冲液，过0.45μm滤膜。2瓶（各12ml）。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板1块（96孔），用于血清样品的梯度稀释。
其中，包被有***病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将实施例1制备的多肽抗原溶于pH9.4的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原（其中序列表中序列1所示的多肽为25ng，序列表中序列2所示的多肽为25ng。），在37℃放置2-4小时，再4-8℃下放置过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔加入含1%（g/ml）牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液（pH=7.4），37℃封闭1-2小时，用洗涤缓冲液（浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液）洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
实施例3、***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的符合率试验
一、***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法
1、平衡：将保存在4℃的试剂盒取出，平衡至室温备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加100μl样本稀释液，分别加入5μl待测样本。
5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl步骤2中得到的洗涤缓冲液，浸泡15秒，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100μl辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG
多克隆抗体。
9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15秒，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
11、显色：每孔分别加入100μl的底物显色液（其中溶液I和溶液II以体积比为1：1的比例混合）。加盖，37℃恒温箱里反应15分钟；
12、每孔分别加入100μl终止液终止反应，混匀；
13、测定每孔的OD450值（加终止液的反应板应在15分钟内读取OD450值）。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450平均值应该≤0.2，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在0.6-1.8之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值=0.23×阳性对照OD450值平均值。
样品OD450值＜临界值，则初步检测为FMDV阴性；样品OD值≥临界值，则初步检测为FMDV阳性，需重新检测。重检时每重检样品平行2次。重检后若两孔均为FMDV阴性，则判断为FMDV阴性；若任一孔为阳性，则判断为FMDV阳性。
二、乳鼠血清中和试验（MSN）方法
目前国内常用的***血清学检测方法之一是乳鼠中和试验（MSN），因此用本试剂盒同乳鼠中和试验进行符合率试验。
材料
1.免疫血清  50头份抗体阳性血清（包括猪口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清25份、***O型病毒合成肽疫苗免疫后得到的阳性血清19份及田间采集的阳性血清6份）由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。
2.健康猪血清  由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。
3.试验用病毒为***OR/80病毒，毒种由兰州兽医研究所提供，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂保存和使用，将病毒经6-8日龄乳鼠传2代后，收集病毒。用3-4日龄乳鼠测定并调整其毒价至1000LD50/0.2ml，置于-20℃保存待用。
乳鼠血清中和试验方法如下：
将每头份待测血清分别与100×LD50/0.1ml的OMⅡ系病毒液等量混合，于37℃孵育1小时，然后接种3日龄乳鼠（颈部皮下注射0.2ml），每组（亦即每个待测血清）4只，同时设立病毒对照、健康对照及标准阳性血清对照组，每组3只，观察7d，记录乳鼠死亡比率并判定结果，若乳鼠4/4或3/4健活，则待测血清为阳性（R），若乳鼠4/4或3/4死亡，则待测血清为阴性（-）；若乳鼠2/4健活或2/4死亡，则判定结果可疑（±），需加倍重复测定，重复试验中，有1组呈阳性，则判定为阳性。
敏感性=判定阴性血清样本数/待测血清样本数×100%。
三、符合率试验结果：
利用实施例2制备的***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验（MSN）分别检测100份猪血清，其中阳性血清（上述免疫血清）50份，阴性血清（上述健康猪血清）50份，结果显示如表3，***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性为98%，而乳鼠血清中和试验的敏感性只有86%，在50份阳性血清中，两种方法检测结果一致的为44份，因此，本试剂盒和乳鼠血清中和试验的符合率为88%，因此本试剂盒具有较高的敏感性。对阴性血清的测试两者的符合率为100%，检测结果均为阴性（见表3）。
***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验一共检测100份猪血清，其中94份猪血清两种方法检测结果一致，6份猪血清检测结果有差异，符合率为94%。
表3***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒及乳鼠血清中和试验法对阳性血清和阴性血清的检测结果
实施例4、***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验
灵敏度试验是比较实施例3中的两种方法检测猪感染血清（猪血清由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供，为猪***O型病毒感染血清）和疫苗免疫后血清（***O型病毒合成肽疫苗免疫后的阳性血清，由中牧实业股份有限公司云南保山厂提供）的结果。使用实施例2制备的三批***病毒结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒（批次号1、2、3），依照实施例3中***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对200份猪***O型病毒感染血清及150份***O型病毒合成肽疫苗免疫后血清检测敏感性试验。
批号为1的试剂盒的检测结果显示本试剂盒对200份感染猪血清的敏感性为196/200×100%=98%；对150份***疫苗免疫猪血清的敏感性为149/150×100%=99.3%。批号为2的试剂盒的检测结果显示本试剂盒对200份感染猪血清的敏感性为197/200×100%=98.5%；对150份***疫苗免疫猪血清的敏感性为148/150×100%=98.7%。批号为3的试剂盒的检测结果显示试剂盒对200份感染猪血清的敏感性为197/200×100%=98.5%；对150份***疫苗免疫猪血清的敏感性为149/150×100%=99.3%。
实施例5、***病毒结构蛋白酶联免疫检测试剂盒的特异性试验
使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的***合成肽结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对600份健康猪血清（中牧实业股份有限公司保山厂和兰州生物药厂提供）、10份猪瘟（HC）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、10份猪水泡病（SVD）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、10份猪圆环病毒（PCV）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、10份猪PRRS病毒阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、10份猪***亚洲Ⅰ型（Asia1）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）和10份猪***A型（A）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如下表（表4）显示，对600份健康猪血清的检测结果显示，批次1号试剂盒的特异性为99.7%，批次2号试剂盒的特异性为99.5%，批次3号试剂盒的特异性为99.7%。对10份猪瘟（HC）阳性血清、10份猪水泡病（SVD）阳性血清、10份猪圆环病毒（PCV）阳性血清、10份猪PRRS病毒阳性血清、10份猪***亚洲Ⅰ型（AsiaⅠ）阳性血清和10份猪***A型（A）阳性血清阳性血清检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这60份阳性血清检测的特异性均为100%。
表4.***合成肽结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果

Claims (13)

1.***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组合的混合多肽。
2.一种***病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为由序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组成的混合多肽。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽的质量比为0.5-2.0：1。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽的质量比为1:1。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。
7.根据权利要求2-4中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的 pH 9.4的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37℃放置2-4小时，再4-8℃下放置过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1g/100ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理1-2小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.05%过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.02mg/ml的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为无***抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清；所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有3g/100mlBSA的0.15M、 pH为7.4的PBS缓冲液；浓缩洗涤液：0.01M ，pH 7.4，含有体积百分浓度为0.8％～1.2％的Tween-20和0.05g/100ml叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：所述***病毒为猪O型***病毒。
12.权利要求1所述的***病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽在制备检测是否感染动物***病毒病的试剂盒中的应用；其中，动物***病毒病为猪***病毒病。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述动物***病毒病为猪O型***病毒引起的猪***病。
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