CN109627293B

CN109627293B - 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽及其应用

Info

Publication number: CN109627293B
Application number: CN201910028355.4A
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 董春娜; 肖进; 李静; 王飞; 巴利民; 齐鹏
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2017-08-13
Filing date: 2017-08-13
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2037-08-13
Also published as: CN107253978A; CN107253978B; CN109627293A

Abstract

本发明公开了塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽及其应用。本发明试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽或序列表中序列4所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。本试剂盒使用化学合成抗原肽包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在感染塞尼卡谷病毒的结构蛋白抗体。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。

Description

塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽及其应用

本申请是申请号为“201710688944.6”，发明名称为“塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒”的专利申请的分案申请

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

塞尼卡谷病毒（SenecaValleyVirus,SVV）,又称为SenecavirusA（SVA），是猪原发性疱疹病（Swineidiopathicvesiculardisease，SIVD）的主要病原。SVV感染猪群后，尽管不会造成较大政治、经济损失，但所引起的水疱性病变，与***病毒、猪水泡病、水泡性口炎、猪水疱疹等造成的病变相似，给临床鉴别诊断造成了一定的困难。目前，北美、南美地区以及澳大利亚都有猪群发生SIVD的报道。2015年我国及巴西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床及死亡症状，造成了严重的经济损失，我国于2016年也首次分离到了SVV。

SVV是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员，SVV为单股、正链、不分节段的RNA病毒。通过对小RNA病毒科的12个代表性病毒属病毒进行全基因组序列比对发现，塞尼卡病毒属与心肌炎病毒属遗传关系最近。SVV为直径约27nm的二十面体无囊膜单股正链不分节段的RNA病毒。病毒基因组含有7280个核苷酸，一个开放阅读框含有6543个核苷酸，编码2181个氨基酸的多聚蛋白，可以分割成12个多肽，构成标准的小RNA病毒科L-4-3-4模式。

与所有小RNA病毒科成员一样，P1多肽由3C蛋白酶裂解成VP0、VP3和VP1，构成病毒核衣壳。成熟的VP0裂解生成VP2和VP4。病毒VP1～VP4亚基蛋白结构保守，可能与病毒的细胞嗜性有关。VP2和VP4某些区域相互作用参与核酸包装。

由于我国于2016年首次分离到了SVV，目前有关SVV抗体检测的方法尚处于研究阶段，SVV抗体检测方法相关的研究主要有间接ELISA和竞争ELISA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用塞尼卡谷病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3抗原表位多肽作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测猪血清中是否含有塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体。

为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的塞尼卡谷病毒抗原表位多肽组合物。本发明提供的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽或序列表中序列4所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5~1.5)：(0.5~1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的三种时，任意三种多肽的质量比为(0.5~1.5)：(0.5~1.5)：(0.5~1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1；

当所述多肽组合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽组成时，它们的质量比为(0.5~1.5)：(0.5~1.5)：(0.5~1.5)：(0.5~1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1：1。

本发明的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；其中所述酶联反应板包被有塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物。

所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到。

所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔200ng多肽，2~8℃下放置8~12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1%（g/ml）牛血清白蛋白（BSA）pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2~3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

所述阳性对照血清为所述塞尼卡谷病毒人工感染后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体（SPF）的猪血清。

所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.06%（g/ml）过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5%（g/100ml）酪蛋白的0.01M、 pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％~1.2％（ml/ml）的Tween-20的0.01M，pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明试剂盒的检测程序为：

1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。

2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；

3、设定： 2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。

4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。

5、加样：各孔分别按预先设定加100µl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。

6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。

7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。

8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

9、温育：置37℃温箱，反应30min。

10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300µl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。

11、显色每孔加入100µl底物工作液（将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配），震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。

12、每孔加入显色终止液50µl，振荡混匀终止反应。

13、测定每孔的OD450nm值（加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值）。

检测结果的判定：

1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。

2、阳性对照每个检测值应该在1.0~2.5之间，否则无效。

3、临界值的计算：临界值=0.17×阳性对照OD450nm值平均值。

待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。

本发明的上述试剂盒，可用于检测塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体，以判断被检动物是否存在感染后产生的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体。

在制备检测是否感染塞尼卡谷病毒病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对塞尼卡谷病毒结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从VP1、VP2、VP3蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。

同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板的制备。

另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高了检测塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体的效率，以判断被检动物是否感染塞尼卡谷病毒。

总之，本试剂盒采用化学合成结构蛋白VP1、VP2、VP3主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测塞尼卡谷病毒病毒感染后产生的结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染塞尼卡谷病毒病毒。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

本发明所涉及的塞尼卡谷病毒结构蛋白酶联免疫检测试剂盒用于检测动物是否感染塞尼卡谷病毒，有利于我国塞尼卡谷病毒防控体系的建立。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备

本试验采用生物信息学方法对塞尼卡谷病毒结构蛋白VP1、VP2、VP3的主要抗原表位进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出四条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2、序列3和序列4所示，制成纯度约80%的更新更全的包被抗原，能够覆盖塞尼卡谷病毒病毒的主要中和抗原表位，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的四条多肽，作为本发明试剂盒的包被原。

本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪 (型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl， 9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：

一、包被抗原固相合成

1、合成试剂的准备

合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。

依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸（购自NOVA公司），加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100%的NMP、3%的AIM（已酰咪唑）、35%的PIP（哌啶）、100%的MeOH（甲醇）等放置到相对应的试剂瓶中。

2、合成仪状态的检测

检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，***表压是否正常（433A正常表压10.2psi）。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer 或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A）—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求（具体检测要求见下表1）。

表1. 多肽合成仪流速检测标准表

3、包被抗原合成开始

在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0 Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查 Chemistry是否为 Std Fmoc 1.0 Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

4、包被抗原合成进行

Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶（PIP）进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并***（1-hydroxybenzotriazole，HOBT）至反应器内。

如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤（合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2）。期间观察记录试剂用量及运行情况。

表2. 包被抗原合成循环步骤

5、包被抗原合成结束

包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂（肽现在还连接在树脂上）基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100%甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

二、包被抗原的裂解及鉴定

1、多肽抗原的裂解

经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：

从冰箱内取出合成的多肽树酯（指肽还连接在树脂上），放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸（Trifluoroacetic acid, TFA）、10ml的三丙基硅烷（TIS）和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30~120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨（DMF）多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。

2、包被抗原的鉴定

多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法（MODAL-TOF）和反相高压液相色谱法（RP-HPLC）进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。

3、包被抗原纯化

将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤（用PALL公司生产的Tangential Flow Device 循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵），多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃ 或-40℃备用。

4、包被抗原冷冻干燥

为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

实施例2、塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制备

塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：

（1）包被有塞尼卡谷病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。

（2）阳性对照血清：是以塞尼卡谷病毒人工感染后采集猪血清，作为试剂盒的阳性对照血清（1管，1.5ml/管）。

（3）阴性对照血清：是无特定病原体（SPF）的猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清（1管，1.5ml/管）。

（4）酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG（购自sigma公司，货号A5670）作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶（12ml/瓶）。

（5）样品稀释液：为含有0.5%（g/100ml）酪蛋白的0.01M、 pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶（24ml/瓶）。

（6）底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液（1瓶，12ml/瓶）

（7）底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺（TMB）溶液（1瓶，12ml/瓶）。

（8）终止液：2mol/L的硫酸溶液（1瓶，12ml/瓶）。

（9）20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％~1.2％（ml/ml）的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（50ml/瓶，2瓶）。

根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板（2块，96孔/块），用于血清样品的稀释。

其中，包被有塞尼卡谷病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：1．将实施例1制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔200ng多肽（其中序列表中序列1所示的多肽为50ng，序列表中序列2所示的多肽为50ng，序列表中序列3所示的多肽为50ng，序列表中序4所示的多肽为50ng），2~8℃下放置8~12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1%（g/ml）牛血清白蛋白（BSA）pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2~3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

实施例3、塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验

一、塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法

2、配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；

6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。

7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。

8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

9、温育：置37℃温箱，反应30min。

10、洗板：弃去反应液，每孔加入洗涤缓冲液300µl，浸泡15s，甩弃洗涤液缓冲液，连续洗板4次后拍干。

12、每孔加入显色终止液50µl，振荡混匀终止反应。

13、测定每孔的OD_450nm值（加终止液的反应板应在15min内读取OD_450nm值）。

检测结果的判定：

1、阴性对照OD_450nm平均值应该≤0.15，否则无效。

2、阳性对照每个检测值应该在1.0~2.5之间，否则无效。

3、临界值的计算：临界值=0.17×阳性对照OD_450nm值平均值。

待检血清测定OD_450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD_450nm值<临界值者判为阴性。

二、对已知阳性血清的敏感性试验

使用按照实施例2的方法制备的三批塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒（批次ZM2017001、ZM2017002、ZM2017003），分别依照上述塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对塞尼卡谷病毒感染猪血清35份（塞尼卡谷病毒感染出现临床症状后不同时间采集的猪血清）进行敏感性试验，实验结果见表3，本发明的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒共检测出34份，有1份未检出，结果表明本试剂盒对35份已知阳性血清的敏感性为97.1%。

表3. 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性检测结果

三、最低检测限量试验

选取塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体阳性的猪血清3份，进行倍比稀释1:20、1:40~1:320，使用实施例2制备的三批塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒（批次ZM2017001、ZM2017002、ZM2017003），依照上述塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对倍比稀释猪血清进行检测，结果表明，本发明试剂盒的可以检测到1:160倍稀释的阳性血清，其中，表4是其中一个批次的实验结果。表4中，阳性对照：是以塞尼卡谷病毒人工感染后采集猪血清，作为试剂盒的阳性对照血清（1管，1.5ml/管）。阴性对照：是无特定病原体（SPF）猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清（1管，1.5ml/管）。临界值（Cut-off值）=0.17×阳性对照OD_450nm值平均值。

表4 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的最低检测限量试验检测结果

实施例4、塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验

使用实施例2中的三批试剂盒依照实施例3中所述的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对50份健康猪血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、2份猪***病毒O型（FMD-O）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、2份猪***病毒A型（FMD-A）阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供）、2份猪水泡病阳性血清（SVD）（中牧实业股份有限公司提供）、2份猪水泡性口炎病毒（VSV）阳性血清（中牧实业股份有限公司提供），分别进行检测。

试剂盒的特异性检测结果如下表（表5）显示，对50份健康猪血清的检测结果显示，ZM2017001试剂盒的特异性为100.0%，ZM2017002试剂盒的特异性为100.0%，ZM2017003试剂盒的特异性为100.0%。对2份猪***病毒O型（FMD-O）阳性血清、2份猪***病毒A型（FMD-A）阳性血清、2份猪水泡病（SVD）阳性血清、2份猪水泡性口炎病毒（VSV）阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100%。

表5 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果

实施例5、塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的符合率试验

一、病毒中和试验（VNT）方法

目前塞尼卡谷病毒公认的检测方法是病毒中和试验（VNT），因此用本试剂盒同病毒中和试验进行符合率试验。

1. 材料

1.1 感染猪血清，24份（血清编号I1~I24），为塞尼卡谷病毒感染后出现临床症状后采集的猪血清，经56℃30min灭活，由中牧实业股份有限公司提供。

1.2 健康猪血清，24份（血清编号N1~N24），经56℃30min灭活，由中牧实业股份有限公司提供。

1.3 试验用病毒（SVV病毒）为塞尼卡谷病毒的PK15细胞毒，调整其毒价至400TCID₅₀/0.1ml，置于-20℃保存待用。

2. 方法病毒中和试验方法如下：血清灭活后，用DMEM培养基进行倍比稀释（25μl/孔），每个稀释度做3个重复；每孔加入等体积（25μl/孔）100TCID₅₀的SVV病毒（对照除外），置于37℃孵育1小时；然后每孔加入用DMEM培养基稀释的100μl PK15细胞（2~3×10⁴），置于37℃，5%CO₂培养箱培养，72小时后观察细胞病变（CPE）。CPE被抑制的最后一个稀释度（90~100%被抑制）被认为是病毒中和试验（VNT）效价，效价≥1:64判为阳性。

二、符合率试验结果：

利用实施例2制备的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒与病毒中和试验（VNT）分别检测24份塞尼卡谷病毒猪血清和24份健康血清。

塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒对24份感染猪血清的检测结果见表6，本发明试剂盒的敏感性为95.8%，而病毒中和试验的敏感性为87.5%，在24份感染猪血清中，两种方法检测结果一致的为22份。因此，本发明试剂盒和病毒中和试验的符合率为91.7%，本发明试剂盒具有较高的敏感性。对健康猪血清的测试两者的符合率为100%，检测结果均为阴性（见表6）。

塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒与病毒中和试验一共检测48份猪血清，其中46份猪血清两种方法检测结果一致，2份猪血清检测结果有差异，符合率为95.8%。

表6 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒及病毒中和试验法对感染猪血清和健康猪血清的检测结果

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽及其应用

<130> WHOI190003

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Ser Asp Leu Glu Val Thr Val Val Ser Leu Glu Pro Asp Leu Glu Phe

1 5 10 15

Ala Val Gly Trp Phe Pro Ser Gly Ser Glu Tyr Gln Ala Ser Ser Phe

20 25 30

Val Tyr Asp Gln Leu

35

<210> 2

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Thr Lys Ser Asp Pro Pro Ser Ser Ser Thr Asp Gln Pro Thr Thr Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ala Ile Asp Arg Trp Tyr Thr Gly Arg Leu Asn Ser Trp Thr

20 25 30

Lys Ala Val Lys

35

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Pro Tyr Ile Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln Asn Ser

1 5 10 15

Trp Thr Leu Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys Glu Gly

20 25 30

Ala Thr Thr Asp Pro Glu

35

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Thr Leu Ser Glu Ala Met Gln Cys Thr Tyr Ser Ile Trp Asp Ile Gly

1 5 10 15

Leu Asn Ser Ser Trp Thr Phe Val Val Pro Tyr Ile Ser Pro Ser Asp

20 25 30

Tyr Arg

Claims

1.一种塞尼卡谷病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗，其中所述酶联反应板包被有由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽、序列表中序列3所示的多肽和序列表中序列4所示的多肽组成的塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；所述阳性对照血清为所述塞尼卡谷病毒人工感染后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体的猪血清。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物中各个多肽为化学人工合成得到。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物溶于100μl的 pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔200ng塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物，2~8℃下放置8~12小时，使塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2~3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

4.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.0006g/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.00005g/ml酪蛋白的0.01mol/L、 pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有体积百分浓度为0.8％~1.2％的Tween-20的0.01mol/L，pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液。